प्रतिरक्षा-परिवर्तनकारी मेटाबोलाइट्स ट्यूमर सूक्ष्म वातावरण (TME) की एक प्रमुख विशेषता हैं, लेकिन कुछ अपवादों को छोड़कर, इनकी पहचान काफी हद तक अज्ञात बनी हुई है। यहाँ, हमने उच्च-श्रेणी के सीरस कार्सिनोमा (HGSC) के रोगियों के ट्यूमर और एसाइटिस से प्राप्त ट्यूमर और टी कोशिकाओं का विश्लेषण करके इन विभिन्न TME घटकों के मेटाबोलोम का पता लगाया। एसाइटिस और ट्यूमर कोशिकाओं में मेटाबोलाइट्स में व्यापक अंतर पाए गए। एसाइटिस की तुलना में, ट्यूमर में घुसपैठ करने वाली टी कोशिकाओं में 1-मिथाइलनिकोटिनमाइड (MNA) की मात्रा काफी अधिक पाई गई। यद्यपि टी कोशिकाओं में MNA का स्तर ऊंचा होता है, निकोटिनमाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज (एक एंजाइम जो एस-एडेनोसिलमेथियोनिन से निकोटिनमाइड में मिथाइल समूहों के स्थानांतरण को उत्प्रेरित करता है) की अभिव्यक्ति केवल फाइब्रोब्लास्ट और ट्यूमर कोशिकाओं तक ही सीमित है। कार्यात्मक रूप से, MNA टी कोशिकाओं को ट्यूमर को बढ़ावा देने वाले साइटोकाइन ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा को स्रावित करने के लिए प्रेरित करता है। इसलिए, टीएमई से प्राप्त एमएनए टी कोशिकाओं के प्रतिरक्षा नियमन में योगदान देता है और मानव कैंसर के उपचार के लिए एक संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है।
ट्यूमर से उत्पन्न मेटाबोलाइट्स एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा पर गहरा अवरोधक प्रभाव डाल सकते हैं, और अधिकाधिक प्रमाण यह दर्शाते हैं कि वे रोग की प्रगति के लिए एक प्रमुख प्रेरक शक्ति के रूप में भी कार्य कर सकते हैं (1)। वारबर्ग प्रभाव के अतिरिक्त, हाल के अध्ययनों में ट्यूमर कोशिकाओं की चयापचय स्थिति और ट्यूमर सूक्ष्म वातावरण (TME) की प्रतिरक्षा स्थिति के साथ इसके संबंध का अध्ययन शुरू किया गया है। माउस मॉडल और मानव टी कोशिकाओं पर किए गए अध्ययनों से पता चला है कि ग्लूटामिन चयापचय (2), ऑक्सीडेटिव चयापचय (3) और ग्लूकोज चयापचय (4) विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका उपसमूहों पर स्वतंत्र रूप से कार्य कर सकते हैं। इन मार्गों में कई मेटाबोलाइट्स टी कोशिकाओं के एंटी-ट्यूमर कार्य को बाधित करते हैं। यह सिद्ध हो चुका है कि कोएंजाइम टेट्राहाइड्रोबायोप्टेरिन (BH4) के अवरोध से टी कोशिकाओं के प्रसार को नुकसान पहुँच सकता है, और शरीर में BH4 की वृद्धि CD4 और CD8 द्वारा मध्यस्थता की गई एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ा सकती है। इसके अतिरिक्त, BH4 के प्रशासन द्वारा काइनुरेनाइन के प्रतिरक्षादमनकारी प्रभाव को कम किया जा सकता है (5)। आइसोसिट्रेट डीहाइड्रोजिनेज (IDH) उत्परिवर्ती ग्लियोब्लास्टोमा में, एनेंटियोमेटाबोलिक (R)-2-हाइड्रॉक्सीग्लूटारेट (R-2-HG) का स्राव टी सेल सक्रियण, प्रसार और साइटोलिसिस गतिविधि को बाधित करता है (6)। हाल ही में, यह दिखाया गया है कि ग्लाइकोलिसिस का एक उप-उत्पाद, मिथाइलग्लायोक्सल, माइलॉयड मूल की दमनकारी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित होता है, और मिथाइलग्लायोक्सल का टी सेल स्थानांतरण प्रभावकारी टी सेल कार्य को बाधित कर सकता है। उपचार में, मिथाइलग्लायोक्सल का निष्प्रभावीकरण माइलॉयड-व्युत्पन्न दमनकारी कोशिकाओं (MDSC) की गतिविधि को दूर कर सकता है और माउस मॉडल में चेकपॉइंट ब्लॉकेड थेरेपी को सहक्रियात्मक रूप से बढ़ा सकता है (7)। ये अध्ययन सामूहिक रूप से टी सेल कार्य और गतिविधि को विनियमित करने में टीएमई-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स की महत्वपूर्ण भूमिका पर जोर देते हैं।
डिम्बग्रंथि कैंसर में टी सेल की शिथिलता व्यापक रूप से देखी गई है (8)। ​​इसका आंशिक कारण हाइपोक्सिया और असामान्य ट्यूमर वाहिकाओं (9) में निहित चयापचय संबंधी विशेषताएं हैं, जिसके परिणामस्वरूप ग्लूकोज और ट्रिप्टोफैन लैक्टिक एसिड और काइनुरेनाइन जैसे उप-उत्पादों में परिवर्तित हो जाते हैं। अत्यधिक बाह्य लैक्टेट इंटरफेरॉन-γ (IFN-γ) के उत्पादन को कम करता है और माइलोसप्रेसिव उपसमूहों के विभेदन को बढ़ावा देता है (10, 11)। ट्रिप्टोफैन का उपभोग सीधे टी सेल प्रसार को रोकता है और टी सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग को बाधित करता है (12-14)। इन अवलोकनों के बावजूद, प्रतिरक्षा चयापचय से संबंधित अधिकांश कार्य अनुकूलित मीडिया का उपयोग करके इन विट्रो टी सेल कल्चर में या इन विवो में समरूप माउस मॉडल तक सीमित थे, जिनमें से कोई भी मानव कैंसर और शारीरिक वृहद एवं सूक्ष्म वातावरण की विषमता को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं करता है।
डिम्बग्रंथि कैंसर की एक सामान्य विशेषता पेरिटोनियल फैलाव और जलोदर की उपस्थिति है। जलोदर में कोशिका द्रव का संचय उन्नत रोग और खराब पूर्वानुमान से जुड़ा है (15)। रिपोर्टों के अनुसार, यह विशिष्ट भाग हाइपोक्सिक होता है, इसमें वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) और इंडोलमाइन 2,3-डाइऑक्सीजिनेज (IDO) का उच्च स्तर होता है, और इसमें टी रेगुलेटरी कोशिकाएं और माइलॉयड इनहिबिटरी कोशिकाएं व्याप्त होती हैं (15-18)। जलोदर का चयापचय वातावरण ट्यूमर से भिन्न हो सकता है, इसलिए पेरिटोनियल क्षेत्र में टी कोशिकाओं का पुनर्प्रोग्रामिंग स्पष्ट नहीं है। इसके अलावा, जलोदर और ट्यूमर वातावरण में मौजूद मेटाबोलाइट्स के बीच प्रमुख अंतर और विषमता प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ और ट्यूमर पर उनके कार्य में बाधा डाल सकती है, और इस पर आगे शोध की आवश्यकता है।
इन समस्याओं को हल करने के लिए, हमने विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं (जिनमें CD4+ और CD8+ T कोशिकाएं शामिल हैं) के साथ-साथ ट्यूमर के भीतर और बीच में मौजूद कोशिकाओं के मेटाबोलाइट्स का अध्ययन करने के लिए एक संवेदनशील कोशिका पृथक्करण और तरल क्रोमेटोग्राफी टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) विधि विकसित की। यह विधि रोगी के एक ही एसाइटिस और ट्यूमर वातावरण में मौजूद कोशिकाओं तक फैली हुई है। हम इस विधि का उपयोग उच्च-आयामी प्रवाह साइटोमेट्री और एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNA-seq) के साथ मिलकर इन प्रमुख कोशिकाओं की चयापचय स्थिति का अत्यधिक विस्तृत चित्र प्रदान करने के लिए करते हैं। इस विधि से ट्यूमर T कोशिकाओं में 1-मिथाइलनिकोटिनमाइड (MNA) के स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चला, और इन विट्रो प्रयोगों से पता चला कि T कोशिका कार्य पर MNA का प्रतिरक्षा-मॉड्यूलेटरी प्रभाव पहले अज्ञात था। कुल मिलाकर, यह विधि ट्यूमर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच पारस्परिक चयापचय संबंधी अंतःक्रियाओं को उजागर करती है, और प्रतिरक्षा विनियमन मेटाबोलाइट्स में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, जो T कोशिका-आधारित डिम्बग्रंथि कैंसर प्रतिरक्षा चिकित्सा उपचार के अवसरों के लिए उपयोगी हो सकती है।
हमने ग्लूकोज अपटेक [2-(एन-(7-नाइट्रोफेनिल-2-ऑक्सा-1,3-डायज़ा-4-वाईएल)अमीनो)-2-डीऑक्सीग्लूकोज (2-एनबीडीजी)] और माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि [माइटोट्रैकर डीप रेड (एमटी डीआर)] (7, 19, 20) को एक साथ मात्रा निर्धारित करने के लिए उच्च-आयामी प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग किया, जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिका आबादी को अलग करने वाले विशिष्ट मार्कर हैं (तालिका एस2 और चित्र एस1ए)। इस विश्लेषण से पता चला कि टी कोशिकाओं की तुलना में, एसाइटिस और ट्यूमर कोशिकाओं में ग्लूकोज अपटेक का स्तर अधिक होता है, लेकिन माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि में अंतर कम होता है। ट्यूमर कोशिकाओं [CD45-EpCAM (EpCAM)+] का औसत ग्लूकोज ग्रहण T कोशिकाओं की तुलना में तीन से चार गुना अधिक होता है, और CD4+ T कोशिकाओं का औसत ग्लूकोज ग्रहण CD8+ T कोशिकाओं की तुलना में 1.2 गुना अधिक होता है। इससे पता चलता है कि ट्यूमर में घुसपैठ करने वाले लिम्फोसाइट्स (TIL) की चयापचय संबंधी आवश्यकताएं एक ही TME में भी भिन्न होती हैं (चित्र 1A)। इसके विपरीत, ट्यूमर कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि CD4+ T कोशिकाओं के समान होती है, और दोनों प्रकार की कोशिकाओं की माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि CD8+ T कोशिकाओं की तुलना में अधिक होती है (चित्र 1B)। सामान्य तौर पर, ये परिणाम चयापचय स्तर को दर्शाते हैं। ट्यूमर कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि CD4+ T कोशिकाओं की तुलना में अधिक होती है, और CD4+ T कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि CD8+ T कोशिकाओं की तुलना में अधिक होती है। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में इन प्रभावों के बावजूद, ट्यूमर की तुलना में एसाइटिस में CD4+ और CD8+ T कोशिकाओं की चयापचय स्थिति या उनके सापेक्ष अनुपात में कोई सुसंगत अंतर नहीं है (चित्र 1C)। इसके विपरीत, CD45-कोशिका अंश में, ट्यूमर में EpCAM+ कोशिकाओं का अनुपात जलोदर की तुलना में बढ़ गया (चित्र 1D)। हमने EpCAM+ और EpCAM- कोशिका घटकों के बीच एक स्पष्ट चयापचयीय अंतर भी देखा। EpCAM+ (ट्यूमर) कोशिकाओं में EpCAM- कोशिकाओं की तुलना में ग्लूकोज का अवशोषण और माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि अधिक होती है, जो TME में ट्यूमर कोशिकाओं में फाइब्रोब्लास्ट की चयापचयीय गतिविधि से कहीं अधिक है (चित्र 1, E और F)।
(A और B) ग्लूकोज अपटेक (2-NBDG) की माध्यिका प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) (A) और CD4+ T कोशिकाओं की माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि (MitoTracker गहरा लाल) (B) प्रतिनिधि ग्राफ (बाएं) और सारणीबद्ध डेटा (दाएं), एसाइटिस और ट्यूमर से CD8+ T कोशिकाएं और EpCAM+ CD45-ट्यूमर कोशिकाएं। (C) एसाइटिस और ट्यूमर में CD4+ और CD8+ कोशिकाओं (CD3+ T कोशिकाओं का) का अनुपात। (D) एसाइटिस और ट्यूमर (CD45−) में EpCAM+ ट्यूमर कोशिकाओं का अनुपात। (E और F) EpCAM+ CD45-ट्यूमर और EpCAM-CD45-मैट्रिक्स ग्लूकोज अपटेक (2-NBDG) (E) और माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि (MitoTracker गहरा लाल) (F) प्रतिनिधि ग्राफ (बाएं) और सारणीबद्ध डेटा (दाएं) एसाइटिस और ट्यूमर कोशिकाएं। (G) फ्लो साइटोमेट्री द्वारा CD25, CD137 और PD1 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि ग्राफ। (H और I) CD4+ T कोशिकाओं (H) और CD8+ T कोशिकाओं (I) पर CD25, CD137 और PD1 अभिव्यक्ति। (J और K) CCR7 और CD45RO की अभिव्यक्ति के आधार पर नैव, सेंट्रल मेमोरी (Tcm), इफेक्टर (Teff) और इफेक्टर मेमोरी (Tem) फेनोटाइप। जलोदर और ट्यूमर में CD4+ T कोशिकाओं (J) और CD8+ T कोशिकाओं (K) की प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और सारणीबद्ध डेटा (दाएं)। युग्मित t-परीक्षण द्वारा निर्धारित P मान (*P<0.05, **P<0.01 और ***P<0.001)। रेखा मिलान किए गए रोगियों (n = 6) को दर्शाती है। FMO, फ्लोरेसेंस माइनस वन; MFI, माध्यिका फ्लोरेसेंस तीव्रता।
आगे के विश्लेषण से उच्च स्तर पर विभेदित टी सेल फेनोटाइपिक स्थिति के बीच अन्य महत्वपूर्ण अंतरों का पता चला। ट्यूमर में सक्रिय (चित्र 1, G से I) और प्रभावकारी मेमोरी (चित्र 1, J और K) कोशिकाएं जलोदर (CD3 + टी कोशिकाओं का अनुपात) की तुलना में कहीं अधिक बार पाई जाती हैं। इसी प्रकार, सक्रियण मार्करों (CD25 और CD137) और क्षीणन मार्करों [प्रोग्राम्ड सेल डेथ प्रोटीन 1 (PD1)] की अभिव्यक्ति द्वारा फेनोटाइप का विश्लेषण करने पर पता चला कि यद्यपि इन कोशिकाओं की चयापचय संबंधी विशेषताएं भिन्न हैं (चित्र S1, B से E), लेकिन भोली, प्रभावकारी या मेमोरी उपसमूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण चयापचय संबंधी अंतर लगातार नहीं देखा गया (चित्र S1, F से I)। इन परिणामों की पुष्टि मशीन लर्निंग विधियों का उपयोग करके स्वचालित रूप से कोशिका फेनोटाइप निर्धारित करके की गई (21), जिससे रोगी के जलोदर में बड़ी संख्या में अस्थि मज्जा कोशिकाओं (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) की उपस्थिति का भी पता चला (चित्र S2A)। पहचाने गए सभी कोशिका प्रकारों में, इस माइलॉइड कोशिका समूह ने उच्चतम ग्लूकोज अवशोषण और माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि प्रदर्शित की (चित्र S2, B से G)। ये परिणाम एचजीएससी रोगियों में जलोदर और ट्यूमर में पाए जाने वाले विभिन्न कोशिका प्रकारों के बीच मजबूत चयापचय संबंधी अंतरों को उजागर करते हैं।
टीआईएल की मेटाबोनामिक विशेषताओं को समझने में मुख्य चुनौती ट्यूमर से पर्याप्त शुद्धता, गुणवत्ता और मात्रा वाले टी सेल नमूनों को अलग करने की आवश्यकता है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि फ्लो साइटोमेट्री पर आधारित सॉर्टिंग और बीड एनरिचमेंट विधियों से सेलुलर मेटाबोलाइट प्रोफाइल में परिवर्तन हो सकते हैं (22-24)। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने एलसी-एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण से पहले शल्य चिकित्सा द्वारा निकाले गए मानव डिम्बग्रंथि कैंसर से टीआईएल को अलग करने के लिए बीड एनरिचमेंट विधि को अनुकूलित किया (सामग्री और विधियाँ देखें; चित्र 2ए)। मेटाबोलाइट परिवर्तनों पर इस प्रोटोकॉल के समग्र प्रभाव का आकलन करने के लिए, हमने उपरोक्त बीड पृथक्करण चरण के बाद स्वस्थ दाताओं द्वारा सक्रिय टी कोशिकाओं के मेटाबोलाइट प्रोफाइल की तुलना उन कोशिकाओं से की जिन्हें बीड पृथक्करण द्वारा अलग नहीं किया गया था बल्कि बर्फ पर रखा गया था। इस गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण में पाया गया कि इन दोनों स्थितियों के बीच उच्च सहसंबंध है (आर = 0.77), और 86 मेटाबोलाइट्स के समूह की तकनीकी पुनरावृत्ति उच्च है (चित्र 2बी)। इसलिए, ये विधियाँ कोशिका प्रकार संवर्धन से गुजरने वाली कोशिकाओं में सटीक चयापचय विश्लेषण कर सकती हैं, इस प्रकार एचजीएससी में विशिष्ट चयापचयों की पहचान करने के लिए पहला उच्च-रिज़ॉल्यूशन मंच प्रदान करती हैं, जिससे लोगों को कोशिका विशिष्टता यौन चयापचय कार्यक्रम की गहरी समझ प्राप्त करने में मदद मिलती है।
(A) चुंबकीय मनका संवर्धन का योजनाबद्ध आरेख। LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण से पहले, कोशिकाओं को चुंबकीय मनका संवर्धन के तीन लगातार चरणों से गुज़ारा जाएगा या उन्हें बर्फ पर रखा जाएगा। (B) चयापचयों की प्रचुरता पर संवर्धन प्रकार का प्रभाव। प्रत्येक संवर्धन प्रकार के लिए तीन मापों का औसत ± मानक त्रुटि (SE)। धूसर रेखा 1:1 संबंध दर्शाती है। अक्ष लेबल में दोहराए गए मापों का अंतरा-वर्ग सहसंबंध (ICC) दर्शाया गया है। NAD, निकोटिनमाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड। (C) रोगी चयापचय विश्लेषण की कार्यप्रणाली का योजनाबद्ध आरेख। रोगियों से जलोदर या ट्यूमर एकत्र किए जाते हैं और क्रायोप्रिजर्व किए जाते हैं। प्रत्येक नमूने के एक छोटे से हिस्से का फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया, जबकि शेष नमूनों को CD4+, CD8+ और CD45- कोशिकाओं के लिए संवर्धन के तीन चरणों से गुज़ारा गया। इन कोशिका अंशों का LC-MS/MS का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। (D) मानकीकृत चयापचय प्रचुरता का ऊष्मा मानचित्र। दानव आरेख नमूनों के बीच यूक्लिडियन दूरियों के वार्ड क्लस्टरिंग को दर्शाता है। (E) नमूना मेटाबोलाइट मानचित्र का प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA), जिसमें प्रत्येक नमूने की तीन प्रतिकृतियाँ दिखाई गई हैं; एक ही रोगी के नमूनों को एक रेखा से जोड़ा गया है। (F) रोगी पर आधारित नमूने के मेटाबोलाइट प्रोफाइल का PCA (अर्थात, आंशिक अतिरेक का उपयोग करते हुए); नमूना प्रकार उत्तल आवरण द्वारा सीमित है। PC1, मुख्य घटक 1; PC2, मुख्य घटक 2।
इसके बाद, हमने इस संवर्धन विधि का प्रयोग छह एचजीएससी रोगियों के प्राथमिक एसाइटिस और ट्यूमर में सीडी4+, सीडी8+ और सीडी45-कोशिका अंशों में 99 मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण करने के लिए किया (चित्र 2सी, चित्र एस3ए और तालिका एस3 और एस4)। रुचि की आबादी जीवित कोशिकाओं के मूल बड़े नमूने का 2% से 70% तक है, और कोशिकाओं का अनुपात रोगियों के बीच बहुत भिन्न होता है। बीड्स को अलग करने के बाद, रुचि का संवर्धित अंश (सीडी4+, सीडी8+ या सीडी45-) औसतन नमूने में सभी जीवित कोशिकाओं के 85% से अधिक का प्रतिनिधित्व करता है। यह संवर्धन विधि हमें मानव ट्यूमर ऊतक चयापचय से कोशिका आबादी का विश्लेषण करने की अनुमति देती है, जो बड़े नमूनों से करना असंभव है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने निर्धारित किया कि एल-काइनुरेनाइन और एडेनोसिन, ये दो सुप्रसिद्ध प्रतिरक्षादमनकारी मेटाबोलाइट्स ट्यूमर टी कोशिकाओं या ट्यूमर कोशिकाओं में बढ़े हुए थे (चित्र एस3, बी और सी)। इसलिए, ये परिणाम रोगी के ऊतकों में जैविक रूप से महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स का पता लगाने के लिए हमारी सेल पृथक्करण और मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक की सटीकता और क्षमता को प्रदर्शित करते हैं।
हमारे विश्लेषण से रोगियों के भीतर और उनके बीच कोशिका प्रकारों का मजबूत चयापचयीय पृथक्करण भी सामने आया (चित्र 2D और चित्र S4A)। विशेष रूप से, अन्य रोगियों की तुलना में, रोगी 70 ने अलग-अलग चयापचयीय विशेषताएँ दिखाईं (चित्र 2E और चित्र S4B), जो यह दर्शाती हैं कि रोगियों के बीच पर्याप्त चयापचयीय विषमता हो सकती है। यह ध्यान देने योग्य है कि अन्य रोगियों (1.2 से 2 लीटर; तालिका S1) की तुलना में, रोगी 70 में एकत्रित जलोदर की कुल मात्रा (80 मिली) कम थी। प्रमुख घटक विश्लेषण (उदाहरण के लिए, आंशिक अतिरेक विश्लेषण का उपयोग करके) के दौरान अंतर-रोगी विषमता का नियंत्रण कोशिका प्रकारों के बीच सुसंगत परिवर्तन दिखाता है, और कोशिका प्रकार और/या सूक्ष्म वातावरण चयापचय प्रोफ़ाइल के अनुसार स्पष्ट रूप से एकत्रित होते हैं (चित्र 2F)। एकल चयापचयों के विश्लेषण ने इन प्रभावों पर बल दिया और कोशिका प्रकारों और सूक्ष्म वातावरण के बीच महत्वपूर्ण अंतरों को उजागर किया। यह उल्लेखनीय है कि सबसे बड़ा अंतर MNA में देखा गया है, जो आमतौर पर CD45- कोशिकाओं और ट्यूमर में घुसपैठ करने वाली CD4+ और CD8+ कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में पाया जाता है (चित्र 3A)। CD4+ कोशिकाओं के लिए, यह प्रभाव सबसे स्पष्ट है, और CD8+ कोशिकाओं में MNA भी वातावरण से काफी प्रभावित होता प्रतीत होता है। हालांकि, यह महत्वपूर्ण नहीं है, क्योंकि छह रोगियों में से केवल तीन का ही ट्यूमर CD8+ स्कोर के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। MNA के अलावा, एसाइटिस और ट्यूमर में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में, TIL में कम पहचाने गए अन्य मेटाबोलाइट्स भी अलग-अलग मात्रा में पाए जाते हैं (चित्र S3 और S4)। इसलिए, ये आंकड़े आगे के शोध के लिए इम्यूनोमॉड्यूलेटरी मेटाबोलाइट्स का एक आशाजनक समूह प्रकट करते हैं।
(A) एसाइटिस और ट्यूमर से CD4+, CD8+ और CD45- कोशिकाओं में MNA की सामान्यीकृत सामग्री। बॉक्स प्लॉट माध्यिका (रेखा), अंतरचतुर्थक सीमा (फ्रेम हिंज) और डेटा सीमा, अंतरचतुर्थक सीमा के 1.5 गुना तक (फ्रेम व्हिस्कर) दर्शाता है। रोगी सामग्री और विधियों में वर्णित अनुसार, P मान निर्धारित करने के लिए रोगी के लिम्मा मान का उपयोग करें (*P<0.05 और **P<0.01)। (B) MNA चयापचय का योजनाबद्ध आरेख (60)। मेटाबोलाइट्स: S-एडेनोसिल-1-मेथियोनीन; SAH, S-एडेनोसिन-1-होमोसिस्टीन; NA, निकोटिनमाइड; MNA, 1-मिथाइलनिकोटिनमाइड; 2-PY, 1-मिथाइल-2-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड; 4-PY, 1-मिथाइल-4-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड; NR, निकोटिनमाइड राइबोज; NMN, निकोटिनमाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड। एंजाइम (हरे रंग में): NNMT, निकोटिनमाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज; SIRT, सिर्टुइन्स; NAMPT, निकोटिनमाइड फॉस्फोरिबोसिल ट्रांसफरेज; AOX1, एल्डिहाइड ऑक्सीडेज 1; NRK, निकोटिनमाइड राइबोसाइड काइनेज; NMNAT, निकोटिनमाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड एडेनाइलेट ट्रांसफरेज; Pnp1, प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज। (C) एसाइटिस (धूसर) और ट्यूमर (लाल; n = 3 रोगी) के scRNA-seq का t-SNE। (D) scRNA-seq का उपयोग करके पहचानी गई विभिन्न कोशिका आबादी में NNMT अभिव्यक्ति। (E) SK-OV-3, मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T, T कोशिकाओं और MNA-उपचारित T कोशिकाओं में NNMT और AOX1 की अभिव्यक्ति। फोल्डेड एक्सप्रेशन को SK-OV-3 के सापेक्ष दर्शाया गया है। SEM के साथ एक्सप्रेशन पैटर्न दिखाया गया है (n = 6 स्वस्थ दाता)। 35 से अधिक Ct मानों को पता न चलने योग्य (UD) माना जाता है। (F) SK-OV-3, HEK293T, T कोशिकाओं और 8mM MNA से उपचारित T कोशिकाओं में SLC22A1 और SLC22A2 का एक्सप्रेशन। फोल्डेड एक्सप्रेशन को SK-OV-3 के सापेक्ष दर्शाया गया है। SEM के साथ एक्सप्रेशन पैटर्न दिखाया गया है (n = 6 स्वस्थ दाता)। 35 से अधिक Ct मानों को पता न चलने योग्य (UD) माना जाता है। (G) MNA के साथ 72 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद सक्रिय स्वस्थ दाता T कोशिकाओं में कोशिका MNA सामग्री। SEM के साथ एक्सप्रेशन पैटर्न दिखाया गया है (n = 4 स्वस्थ दाता)।
MNA का उत्पादन निकोटिनमाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज (NNMT; चित्र 3B) द्वारा एस-एडेनोसिल-1-मेथियोनिन (SAM) से निकोटिनमाइड (NA) में मिथाइल समूह के स्थानांतरण से होता है। NNMT विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर में अति-अभिव्यक्त होता है और प्रसार, आक्रमण और मेटास्टेसिस से जुड़ा होता है (25-27)। TME में T कोशिकाओं में MNA के स्रोत को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने तीन HGSC रोगियों के एसाइटिस और ट्यूमर में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में NNMT की अभिव्यक्ति को चिह्नित करने के लिए scRNA-seq का उपयोग किया (तालिका S5)। लगभग 6,500 कोशिकाओं के विश्लेषण से पता चला कि एसाइटिस और ट्यूमर वातावरण में, NNMT की अभिव्यक्ति अनुमानित फाइब्रोब्लास्ट और ट्यूमर कोशिका आबादी तक ही सीमित थी (चित्र 3, C और D)। यह ध्यान देने योग्य है कि PTPRC (CD45 +) व्यक्त करने वाली किसी भी आबादी में NNMT की कोई स्पष्ट अभिव्यक्ति नहीं है (चित्र 3D और चित्र S5A), जो इंगित करता है कि मेटाबोलाइट स्पेक्ट्रम में पता लगाया गया MNA टी कोशिकाओं में प्रवेश कर चुका है। एल्डिहाइड ऑक्सीडेज 1 (AOX1) की अभिव्यक्ति, जो MNA को 1-मिथाइल-2-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (2-PYR) या 1-मिथाइल-4-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (4-PYR) में परिवर्तित करती है (चित्र 3B), COL1A1 व्यक्त करने वाले फाइब्रोब्लास्ट की आबादी तक ही सीमित है (चित्र S5A), जो मिलकर इंगित करता है कि टी कोशिकाओं में पारंपरिक MNA चयापचय की क्षमता का अभाव है। इन MNA-संबंधित जीनों के अभिव्यक्ति पैटर्न को HGSC रोगियों के एसाइटिस से प्राप्त दूसरे स्वतंत्र सेल डेटा सेट का उपयोग करके सत्यापित किया गया था (चित्र S5B; n = 6) (16)। इसके अतिरिक्त, एमएनए से उपचारित स्वस्थ दाता टी कोशिकाओं के मात्रात्मक पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) विश्लेषण से पता चला कि नियंत्रण एसके-ओवी-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में, एनएनएटी या एओएक्स1 लगभग व्यक्त नहीं हुआ था (चित्र 3ई)। ये अप्रत्याशित परिणाम संकेत देते हैं कि एमएनए फाइब्रोब्लास्ट या ट्यूमर से टीएमई में आसन्न टी कोशिकाओं में स्रावित हो सकता है।
हालांकि संभावित उम्मीदवारों में घुलनशील वाहक 22 (SLC22) परिवार (SLC22A1, SLC22A2 और SLC22A3) द्वारा एन्कोड किए गए कार्बनिक धनायन ट्रांसपोर्टर 1 से 3 (OCT1, OCT2 और OCT3) का परिवार शामिल है, फिर भी MNA के संभावित ट्रांसपोर्टर अभी तक अपरिभाषित हैं (28)। स्वस्थ दाता टी कोशिकाओं से mRNA के QPCR ने SLC22A1 के निम्न अभिव्यक्ति स्तर और SLC22A2 के पता न चलने योग्य स्तर दिखाए, जिसने पुष्टि की कि इसे पहले साहित्य में रिपोर्ट किया गया था (चित्र 3F) (29)। इसके विपरीत, SK-OV-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिका रेखा ने दोनों ट्रांसपोर्टरों के उच्च स्तर को व्यक्त किया (चित्र 3F)।
टी कोशिकाओं द्वारा बाहरी एमएनए को अवशोषित करने की क्षमता की संभावना का परीक्षण करने के लिए, स्वस्थ दाता टी कोशिकाओं को एमएनए की विभिन्न सांद्रताओं की उपस्थिति में 72 घंटे तक संवर्धित किया गया। बाह्य एमएनए की अनुपस्थिति में, एमएनए की कोशिकीय मात्रा का पता नहीं लगाया जा सका (चित्र 3G)। हालांकि, बाह्य एमएनए से उपचारित सक्रिय टी कोशिकाओं में एमएनए की मात्रा में खुराक-निर्भर वृद्धि देखी गई, जो 6 mM एमएनए तक थी (चित्र 3G)। यह परिणाम दर्शाता है कि ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति के निम्न स्तर और अंतःकोशिकीय एमएनए चयापचय के लिए जिम्मेदार मुख्य एंजाइम की कमी के बावजूद, टीआईएल अभी भी एमएनए को ग्रहण कर सकती हैं।
रोगियों की टी कोशिकाओं में मेटाबोलाइट्स का स्पेक्ट्रम और इन विट्रो एमएनए अवशोषण प्रयोगों से यह संभावना बढ़ जाती है कि कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) एमएनए स्रावित करते हैं और ट्यूमर कोशिकाएं टीआईएल के फेनोटाइप और कार्य को नियंत्रित कर सकती हैं। टी कोशिकाओं पर एमएनए के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, स्वस्थ दाता टी कोशिकाओं को एमएनए की उपस्थिति या अनुपस्थिति में इन विट्रो में सक्रिय किया गया और उनके प्रसार और साइटोकाइन उत्पादन का मूल्यांकन किया गया। उच्चतम खुराक पर एमएनए मिलाने के 7 दिनों के बाद, जनसंख्या दोगुनी होने की संख्या में मामूली कमी आई, जबकि सभी खुराकों पर सक्रियता बनी रही (चित्र 4ए)। इसके अलावा, बाह्य एमएनए के उपचार के परिणामस्वरूप ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (टीएनएफα) व्यक्त करने वाली सीडी4+ और सीडी8+ टी कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि हुई (चित्र 4बी)। इसके विपरीत, सीडी4+ टी कोशिकाओं में आईएफएन-γ का अंतःकोशिकीय उत्पादन काफी कम हो गया, लेकिन सीडी8+ टी कोशिकाओं में नहीं, और इंटरल्यूकिन 2 (आईएल-2) में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ (चित्र 4, सी और डी)। इसलिए, इन एमएनए-उपचारित टी सेल कल्चर के सुपरनेटेंट के एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोरबेंट परख (ईएलआईएसए) से टीएनएफα में उल्लेखनीय वृद्धि, आईएफएन-γ में कमी और आईएल-2 में कोई परिवर्तन नहीं दिखा (चित्र 4, ई से जी)। आईएफएन-γ में कमी इंगित करती है कि एमएनए टी कोशिकाओं की एंटीट्यूमर गतिविधि को बाधित करने में भूमिका निभा सकता है। टी सेल-मध्यस्थता विषाक्तता पर एमएनए के प्रभाव का अनुकरण करने के लिए, फोलेट रिसेप्टर α को लक्षित करने वाली काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (एफआरα-कार-टी) कोशिकाएं और हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) द्वारा विनियमित काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (जीएफपी-कार-टी) कोशिकाएं स्वस्थ दाता परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से उत्पादित की जाती हैं। CAR-T कोशिकाओं को MNA की उपस्थिति में 24 घंटे तक संवर्धित किया गया, और फिर उन्हें फोलेट रिसेप्टर α व्यक्त करने वाली मानव SK-OV-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिकाओं के साथ 10:1 के प्रभावक-लक्ष्य अनुपात पर सह-संवर्धित किया गया। MNA उपचार के परिणामस्वरूप FRα-CAR-T कोशिकाओं की संक्षारण गतिविधि में उल्लेखनीय कमी आई, जो एडेनोसिन से उपचारित FRα-CAR-T कोशिकाओं के समान थी (चित्र 4H)।
(A) सातवें दिन कल्चर से प्राप्त कुल व्यवहार्य कोशिका गणना और जनसंख्या दोहरीकरण (PD)। बार ग्राफ छह स्वस्थ दाताओं के माध्य + SEM को दर्शाता है। यह कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा को दर्शाता है। (B से D) CD3/CD28 और IL-2 का उपयोग 7 दिनों के लिए उनकी संबंधित MNA सांद्रता पर T कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए किया गया था। विश्लेषण से पहले, कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए गोल्गीस्टॉप के साथ PMA/आयनोमाइसिन से उत्तेजित किया गया था। T कोशिकाओं में TNFα (B) की अभिव्यक्ति। जीवित कोशिकाओं में TNFα अभिव्यक्ति का उदाहरण चित्र (बाएं) और सारणीबद्ध डेटा (दाएं)। T कोशिकाओं में IFN-γ (C) और IL-2 (D) की अभिव्यक्ति। साइटोकाइन की अभिव्यक्ति को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मापा गया था। बार ग्राफ माध्य (n = 6 स्वस्थ दाता) + SEM को दर्शाता है। P मान निर्धारित करने के लिए एक-तरफ़ा विश्लेषण और दोहराए गए मापों (*P<0.05 और **P<0.01) का उपयोग करें। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त डेटा को दर्शाता है। (E से G) CD3/CD28 और IL-2 का उपयोग 7 दिनों के लिए उनकी संबंधित MNA सांद्रता पर T कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए किया गया था। PMA/आयनोमाइसिन उत्तेजना के 4 घंटे पहले और बाद में माध्यम एकत्र किया गया था। TNFα (E), IFN-γ (F) और IL-2 (G) की सांद्रता को ELISA द्वारा मापा गया था। बार ग्राफ माध्य (n = 5 स्वस्थ दाता) + SEM को दर्शाता है। P मान एक-तरफ़ा विश्लेषण और दोहराए गए मापों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था (*P<0.05)। बिंदीदार रेखा पता लगाने की सीमा को इंगित करती है। (H) कोशिका लिसिस परख। FRα-CAR-T या GFP-CAR-T कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए एडेनोसिन (250μM) या MNA (10 mM) के साथ समायोजित किया गया था, या अनुपचारित (Ctrl) छोड़ दिया गया था। SK-OV-3 कोशिकाओं के प्रतिशत विनाश को मापा गया। वेल्च टी परीक्षण द्वारा निर्धारित पी मान (*पी<0.5 और **पी<0.01)।
MNA पर निर्भर TNFα अभिव्यक्ति विनियमन की क्रियाविधि को समझने के लिए, MNA से उपचारित T कोशिकाओं के TNFα mRNA में होने वाले परिवर्तनों का मूल्यांकन किया गया (चित्र 5A)। MNA से उपचारित स्वस्थ दाता T कोशिकाओं में TNFα प्रतिलेखन स्तरों में दो गुना वृद्धि देखी गई, जो दर्शाता है कि MNA, TNFα प्रतिलेखन विनियमन पर निर्भर है। इस संभावित विनियामक तंत्र की जांच करने के लिए, TNFα को विनियमित करने वाले दो ज्ञात प्रतिलेखन कारकों, अर्थात् सक्रिय T कोशिका नाभिकीय कारक (NFAT) और विशिष्ट प्रोटीन 1 (Sp1) का, समीपस्थ TNFα प्रमोटर से MNA बंधन की प्रतिक्रिया में मूल्यांकन किया गया (30)। TNFα प्रमोटर में 6 पहचाने गए NFAT बंधन स्थल और 2 Sp1 बंधन स्थल हैं, जो एक स्थल पर अतिव्यापी हैं [5' कैप से -55 बेस पेयर (bp)] (30)। क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिपिटेशन (ChIP) से पता चला कि MNA से उपचारित करने पर, TNFα प्रमोटर से Sp1 का बंधन तीन गुना बढ़ गया। NFAT का समावेश भी बढ़ा और महत्व के करीब पहुंच गया (चित्र 5B)। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि MNA, Sp1 प्रतिलेखन के माध्यम से TNFα की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, और कुछ हद तक NFAT की अभिव्यक्ति को भी।
(A) MNA के बिना संवर्धित T कोशिकाओं की तुलना में, MNA से उपचारित T कोशिकाओं में TNFα अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन। SEM के साथ अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाया गया है (n = 5 स्वस्थ दाता)। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त डेटा को दर्शाता है। (B) NFAT और Sp1 को (Ctrl) और PMA/आयनोमाइसिन उत्तेजना के साथ 4 घंटे तक संयोजित करने के बाद, 8 mM MNA के साथ या उसके बिना उपचारित T कोशिकाओं के TNFα प्रमोटर को दर्शाया गया है। इम्यूनोग्लोबुलिन G (IgG) और H3 का उपयोग क्रमशः इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के लिए नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। ChIP के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला कि MNA-उपचारित कोशिकाओं में TNFα प्रमोटर से Sp1 और NFAT का बंधन नियंत्रण की तुलना में कई गुना बढ़ गया। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त डेटा को दर्शाता है। P मान एकाधिक t-परीक्षणों द्वारा निर्धारित किया गया (*** P <0.01)। (C) HGSC के एसाइटिस की तुलना में, ट्यूमर में T कोशिकाओं (गैर-साइटोटॉक्सिक) ने TNF की अभिव्यक्ति में वृद्धि दिखाई। रंग अलग-अलग रोगियों को दर्शाते हैं। प्रदर्शित कोशिकाओं को 300 तक यादृच्छिक रूप से नमूना लिया गया है और अति-चित्रण को सीमित करने के लिए उनमें जिटरिंग की गई है (** Padj = 0.0076)। (D) डिम्बग्रंथि कैंसर के लिए MNA का प्रस्तावित मॉडल। MNA ट्यूमर कोशिकाओं और TME में फाइब्रोब्लास्ट में उत्पन्न होता है और T कोशिकाओं द्वारा ग्रहण किया जाता है। MNA, TNFα प्रमोटर से Sp1 के बंधन को बढ़ाता है, जिससे TNFα प्रतिलेखन और TNFα साइटोकाइन उत्पादन में वृद्धि होती है। MNA, IFN-γ में कमी भी लाता है। T कोशिका कार्य के अवरोध से मारने की क्षमता में कमी और ट्यूमर की वृद्धि में तेजी आती है।
रिपोर्टों के अनुसार, TNFα में आगे और पीछे दोनों दिशाओं पर निर्भर एंटी-ट्यूमर प्रभाव होते हैं, लेकिन डिम्बग्रंथि कैंसर के विकास और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने में इसकी एक सुप्रसिद्ध भूमिका है (31-33)। रिपोर्टों के अनुसार, डिम्बग्रंथि कैंसर के रोगियों में एसाइटिस और ट्यूमर ऊतकों में TNFα की सांद्रता सौम्य ऊतकों की तुलना में अधिक होती है (34-36)। क्रियाविधि के संदर्भ में, TNFα श्वेत रक्त कोशिकाओं की सक्रियता, कार्य और प्रसार को नियंत्रित कर सकता है, और कैंसर कोशिकाओं के फेनोटाइप को बदल सकता है (37, 38)। इन निष्कर्षों के अनुरूप, विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला कि एसाइटिस की तुलना में ट्यूमर ऊतकों में टी कोशिकाओं में TNF का स्तर काफी अधिक था (चित्र 5C)। TNF अभिव्यक्ति में वृद्धि केवल गैर-साइटोटॉक्सिक फेनोटाइप वाली टी कोशिका आबादी में ही स्पष्ट थी (चित्र S5A)। संक्षेप में, ये आंकड़े इस दृष्टिकोण का समर्थन करते हैं कि MNA में HGSC में दोहरे प्रतिरक्षादमनकारी और ट्यूमर को बढ़ावा देने वाले प्रभाव होते हैं।
फ्लो साइटोमेट्री पर आधारित फ्लोरोसेंट लेबलिंग, टीआईएल चयापचय के अध्ययन की मुख्य विधि बन गई है। इन अध्ययनों से पता चला है कि परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स या द्वितीयक लिम्फोइड अंगों से प्राप्त टी कोशिकाओं की तुलना में, चूहे और मानव टीआईएल में ग्लूकोज ग्रहण करने की प्रवृत्ति अधिक होती है (4, 39) और माइटोकॉन्ड्रियल कार्यक्षमता में धीरे-धीरे कमी आती है (19, 40)। हालांकि हमने इस अध्ययन में भी समान परिणाम देखे हैं, लेकिन महत्वपूर्ण विकास एक ही निकाले गए ट्यूमर ऊतक से ट्यूमर कोशिकाओं और टीआईएल के चयापचय की तुलना करना है। कुछ पिछली रिपोर्टों के अनुरूप, एसाइटिस और ट्यूमर से प्राप्त ट्यूमर (CD45-EpCAM +) कोशिकाओं में CD8 + और CD4 + टी कोशिकाओं की तुलना में ग्लूकोज ग्रहण करने की क्षमता अधिक होती है, जो इस बात का समर्थन करती है कि ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा ग्लूकोज ग्रहण करने की उच्च क्षमता की तुलना टी कोशिकाओं से की जा सकती है। टी कोशिका प्रतिस्पर्धा की अवधारणा। हालांकि, ट्यूमर कोशिकाओं की माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि CD8 + टी कोशिकाओं की तुलना में अधिक होती है, लेकिन CD4 + टी कोशिकाओं के समान होती है। ये परिणाम इस उभरते हुए विचार को पुष्ट करते हैं कि ऑक्सीडेटिव मेटाबोलिज्म ट्यूमर कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है (41, 42)। वे यह भी सुझाव देते हैं कि CD8+ T कोशिकाएं CD4+ T कोशिकाओं की तुलना में ऑक्सीडेटिव डिसफंक्शन के प्रति अधिक संवेदनशील हो सकती हैं, या CD4+ T कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि को बनाए रखने के लिए ग्लूकोज के अलावा अन्य कार्बन स्रोतों का उपयोग कर सकती हैं (43, 44)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमने एसाइटिस में CD4+ T इफेक्टर, T इफेक्टर मेमोरी और T सेंट्रल मेमोरी कोशिकाओं के बीच ग्लूकोज अपटेक या माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि में कोई अंतर नहीं देखा। इसी प्रकार, ट्यूमर में CD8+ T कोशिकाओं की विभेदन अवस्था का ग्लूकोज अपटेक में परिवर्तन से कोई संबंध नहीं है, जो इन विट्रो में संवर्धित T कोशिकाओं और इन विवो में मानव TIL के बीच महत्वपूर्ण अंतर को उजागर करता है (22)। इन अवलोकनों की पुष्टि निष्पक्ष स्वचालित कोशिका जनसंख्या आवंटन के उपयोग से भी हुई, जिससे यह पता चला कि ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में उच्च ग्लूकोज अपटेक और माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि वाली CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ कोशिकाएं प्रचलित हैं, लेकिन उनमें मेटाबोलिक रूप से सक्रिय कोशिका जनसंख्या होती है। यह जनसंख्या scRNA-seq विश्लेषण में पहचानी गई मायलोइड सप्रेसर कोशिकाओं या प्लाज्मासाइटोइड डेंड्रिटिक कोशिकाओं की संभावित उप-जनसंख्या का प्रतिनिधित्व कर सकती है। हालाँकि इन दोनों की रिपोर्ट मानव डिम्बग्रंथि ट्यूमर में की गई है [45], फिर भी इस मायलोइड उप-जनसंख्या का वर्णन करने के लिए आगे के काम की आवश्यकता है।
हालांकि फ्लो साइटोमेट्री-आधारित विधियाँ विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच ग्लूकोज और ऑक्सीडेटिव चयापचय में सामान्य अंतर को स्पष्ट कर सकती हैं, लेकिन ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट (TME) में माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय के लिए ग्लूकोज या अन्य कार्बन स्रोतों द्वारा उत्पादित सटीक मेटाबोलाइट्स का अभी तक निर्धारण नहीं किया गया है। किसी दिए गए TIL उपसमूह में मेटाबोलाइट्स की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए निकाले गए ऊतक से कोशिका आबादी का शुद्धिकरण आवश्यक है। इसलिए, हमारी कोशिका संवर्धन विधि, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर, उन मेटाबोलाइट्स के बारे में जानकारी प्रदान कर सकती है जो समान रोगी नमूनों में T कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिका आबादी में भिन्न रूप से समृद्ध होते हैं। हालांकि इस विधि के फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग की तुलना में कई फायदे हैं, फिर भी कुछ मेटाबोलाइट लाइब्रेरी अंतर्निहित स्थिरता और/या तीव्र टर्नओवर दर (22) के कारण प्रभावित हो सकती हैं। फिर भी, हमारी विधि दो मान्यता प्राप्त प्रतिरक्षादमनकारी मेटाबोलाइट्स, एडेनोसिन और काइनुरेनाइन की पहचान करने में सक्षम थी, क्योंकि ये विभिन्न प्रकार के नमूनों में बहुत भिन्न होते हैं।
ट्यूमर और टीआईएल उपप्रकारों के हमारे मेटाबोनामिक विश्लेषण से डिम्बग्रंथि टीएमई में मेटाबोलाइट्स की भूमिका के बारे में अधिक जानकारी मिलती है। सबसे पहले, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके, हमने निर्धारित किया कि ट्यूमर और सीडी4+ टी कोशिकाओं के बीच माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि में कोई अंतर नहीं था। हालांकि, एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण ने इन आबादी के बीच मेटाबोलाइट्स की प्रचुरता में महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रकट किए, जो दर्शाता है कि टीआईएल चयापचय और इसकी समग्र चयापचय गतिविधि के बारे में निष्कर्षों के लिए सावधानीपूर्वक व्याख्या की आवश्यकता है। दूसरे, एमएनए वह मेटाबोलाइट है जिसमें एसाइटिस में सीडी45-कोशिकाओं और टी कोशिकाओं के बीच सबसे बड़ा अंतर होता है, न कि ट्यूमर में। इसलिए, कंपार्टमेंटलाइज़ेशन और ट्यूमर स्थान का टीआईएल चयापचय पर अलग-अलग प्रभाव हो सकता है, जो किसी दिए गए सूक्ष्म वातावरण में संभावित विषमता को उजागर करता है। तीसरे, एमएनए-उत्पादक एंजाइम एनएनएमटी की अभिव्यक्ति मुख्य रूप से सीएएफ तक सीमित है, जो कुछ हद तक ट्यूमर कोशिकाएं हैं, लेकिन ट्यूमर-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में पता लगाने योग्य एमएनए स्तर देखे गए हैं। डिम्बग्रंथि के सीएएफ में एनएनएटी की अतिअभिव्यक्ति का कैंसर को बढ़ावा देने वाला प्रभाव ज्ञात है, जिसका आंशिक कारण सीएएफ चयापचय, ट्यूमर आक्रमण और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देना है (27)। यद्यपि टीआईएल का समग्र स्तर मध्यम है, सीएएफ में एनएनएटी की अभिव्यक्ति कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) मेसेनकाइमल उपप्रकार से निकटता से संबंधित है, जो खराब पूर्वानुमान से जुड़ा है (27, 46, 47)। अंत में, एमएनए निम्नीकरण के लिए जिम्मेदार एंजाइम एओएक्स1 की अभिव्यक्ति भी सीएएफ आबादी तक सीमित है, जो इंगित करता है कि टी कोशिकाओं में एमएनए को चयापचयित करने की क्षमता का अभाव है। ये परिणाम इस विचार का समर्थन करते हैं कि यद्यपि इस निष्कर्ष को सत्यापित करने के लिए आगे के कार्य की आवश्यकता है, टी कोशिकाओं में एमएनए का उच्च स्तर एक प्रतिरक्षादमनकारी सीएएफ सूक्ष्म वातावरण की उपस्थिति का संकेत दे सकता है।
MNA ट्रांसपोर्टरों के निम्न अभिव्यक्ति स्तर और MNA चयापचय में शामिल प्रमुख प्रोटीनों के नगण्य स्तर को देखते हुए, T कोशिकाओं में MNA की उपस्थिति अप्रत्याशित है। दो स्वतंत्र समूहों के scRNA-seq विश्लेषण और लक्षित qPCR द्वारा न तो NNMT और न ही AOX1 का पता लगाया जा सका। ये परिणाम दर्शाते हैं कि MNA का संश्लेषण T कोशिकाओं द्वारा नहीं होता, बल्कि यह आसपास के TME से अवशोषित होता है। इन विट्रो प्रयोगों से पता चलता है कि T कोशिकाएं बाह्य MNA को संचित करने की प्रवृत्ति रखती हैं।
हमारे इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि बाह्य MNA, T कोशिकाओं में TNFα की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है और TNFα प्रमोटर से Sp1 के बंधन को बढ़ाता है। यद्यपि TNFα में ट्यूमर-रोधी और ट्यूमर-रोधी दोनों कार्य होते हैं, डिम्बग्रंथि कैंसर में, TNFα डिम्बग्रंथि कैंसर के विकास को बढ़ावा दे सकता है (31-33)। डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिका संवर्धन में TNFα का निष्प्रभावीकरण या माउस मॉडल में TNFα संकेत का उन्मूलन, TNFα-मध्यस्थता वाले सूजन संबंधी साइटोकाइन उत्पादन को बेहतर बना सकता है और ट्यूमर के विकास को रोक सकता है (32, 35)। इसलिए, इस मामले में, TME-व्युत्पन्न MNA, ऑटोक्रीन लूप के माध्यम से TNFα-निर्भर तंत्र द्वारा एक प्रो-इंफ्लेमेटरी मेटाबोलाइट के रूप में कार्य कर सकता है, जिससे डिम्बग्रंथि कैंसर की घटना और प्रसार को बढ़ावा मिलता है (31)। इस संभावना के आधार पर, डिम्बग्रंथि कैंसर के लिए एक संभावित चिकित्सीय एजेंट के रूप में TNFα अवरोध का अध्ययन किया जा रहा है (37, 48, 49)। इसके अतिरिक्त, MNA, CAR-T कोशिकाओं की डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिकाओं के प्रति विषाक्तता को कम करता है, जो MNA-मध्यस्थ प्रतिरक्षा दमन के लिए और अधिक प्रमाण प्रदान करता है। कुल मिलाकर, ये परिणाम एक ऐसे मॉडल का सुझाव देते हैं जिसमें ट्यूमर और CAF कोशिकाएं बाह्यकोशिकीय TME में MNA स्रावित करती हैं। (i) TNF-प्रेरित डिम्बग्रंथि कैंसर वृद्धि उत्तेजना और (ii) MNA-प्रेरित T कोशिका विषाक्तता गतिविधि अवरोध के माध्यम से, इसका ट्यूमर पर दोहरा प्रभाव हो सकता है (चित्र 5D)।
निष्कर्षतः, तीव्र कोशिका संवर्धन, एकल-कोशिका अनुक्रमण और चयापचय प्रोफाइलिंग के संयोजन को लागू करके, इस अध्ययन ने एचजीएससी रोगियों में ट्यूमर और एसाइटिस कोशिकाओं के बीच भारी प्रतिरक्षा-चयापचय संबंधी अंतरों को उजागर किया। इस व्यापक विश्लेषण से पता चला कि टी कोशिकाओं के बीच ग्लूकोज ग्रहण और माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि में अंतर हैं, और एमएनए को एक गैर-कोशिका स्वायत्त प्रतिरक्षा नियामक चयापचय के रूप में पहचाना गया। ये आंकड़े इस बात पर प्रभाव डालते हैं कि मानव कैंसर में टीएमई टी कोशिका चयापचय को कैसे प्रभावित करता है। हालांकि टी कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं के बीच पोषक तत्वों के लिए प्रत्यक्ष प्रतिस्पर्धा की सूचना दी गई है, चयापचय अप्रत्यक्ष नियामक के रूप में भी कार्य कर सकते हैं जो ट्यूमर की प्रगति को बढ़ावा देते हैं और संभवतः अंतर्जात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को दबाते हैं। इन नियामक चयापचयों की कार्यात्मक भूमिका का आगे का विवरण एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए वैकल्पिक रणनीतियों के द्वार खोल सकता है।
मरीज़ों के नमूने और नैदानिक ​​डेटा कनाडा टिशू रिपॉजिटरी नेटवर्क द्वारा प्रमाणित ब्रिटिश कोलंबिया कैंसर ट्यूमर टिशू रिपॉजिटरी से प्राप्त किए गए थे। ब्रिटिश कोलंबिया कैंसर रिसर्च एथिक्स कमेटी और ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय (H07-00463) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार, सभी मरीज़ों के नमूनों और नैदानिक ​​डेटा के लिए लिखित सहमति प्राप्त की गई थी या उन्होंने औपचारिक रूप से अपनी सहमति छोड़ दी थी। नमूनों को प्रमाणित बायोबैंक (BRC-00290) में संग्रहित किया गया है। मरीज़ों की विस्तृत विशेषताओं को सारणी S1 और S5 में दर्शाया गया है। क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, मरीज़ के ट्यूमर के नमूने को यांत्रिक रूप से विघटित करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग किया जाता है और फिर एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए इसे 100-माइक्रोन फिल्टर से गुजारा जाता है। कोशिकाओं को एकत्रित करने और सुपरनेटेंट को हटाने के लिए मरीज़ के एसाइटिस को 4°C पर 10 मिनट के लिए 1500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया था। ट्यूमर और एसाइटिस से प्राप्त कोशिकाओं को 50% ऊष्मा-निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 40% आरपीएमआई-1640 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) और 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड में क्रायोप्रिजर्व किया गया। इन संरक्षित एकल कोशिका सस्पेंशन को पिघलाकर नीचे वर्णित मेटाबोलॉमिक्स और मेटाबोलाइट निर्धारण के लिए उपयोग किया गया।
संपूर्ण माध्यम में 0.22 μm फ़िल्टर किया हुआ 50:50 अनुपात में पूरक RPMI 1640: AimV शामिल है। RPMI 1640 + 2.05 mM l-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में 10% ऊष्मा-निष्क्रिय मानव AB सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 12.5 mM हेपेस (थर्मो फिशर साइंटिफिक), 2 mM l-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक), 1 x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनस्ट्रेप) घोल (थर्मो फिशर साइंटिफिक) और 50 μM मर्कैप्टोएथेनॉल मिलाया जाता है। AimV (इनविट्रोजन) में 20 mM हेपेस (थर्मो फिशर साइंटिफिक) और 2 mM l-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) मिलाया जाता है। फ्लो साइटोमीटर स्टेनिंग बफर में 0.22 μm फ़िल्टर किया हुआ फॉस्फेट बफर्ड सलाइन (PBS; इनविट्रोजन) होता है, जिसमें 3% ऊष्मा-निष्क्रिय AB मानव सीरम (सिग्मा) मिलाया जाता है। सेल एनरिचमेंट बफर में 0.22 μm फ़िल्टर किया हुआ PBS होता है और इसमें 0.5% ऊष्मा-निष्क्रिय मानव AB सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच) मिलाया जाता है।
37°C तापमान वाले पूर्ण माध्यम में, कोशिकाओं को 10 nM MT DR और 100 μM 2-NBDG से 30 मिनट के लिए रंगा गया। इसके बाद, कोशिकाओं को 4°C तापमान पर 15 मिनट के लिए वायबिलिटी डाई eF506 से रंगा गया। कोशिकाओं को FC ब्लॉक (eBioscience) और ब्रिलियंट स्टेन बफर (BD Biosciences) में पुनर्संगठित करें, फ्लो साइटोमीटर स्टेनिंग बफर में (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) पतला करें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग बफर में एंटीबॉडी के एक सेट (तालिका S2) से 4°C तापमान पर 20 मिनट के लिए रंगा गया। विश्लेषण से पहले कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग बफर (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R कॉन्फ़िगरेशन) में पुनर्संगठित करें। सेल काउंट डेटा का विश्लेषण करने के लिए SpectroFlo और FlowJo V10 का उपयोग करें, और डेटा बनाने के लिए GraphPad Prism 8 का उपयोग करें। 2-NBDG और MT DR की माध्यिका प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) को लॉग-सामान्यीकृत किया गया, और फिर मिलान किए गए रोगियों को ध्यान में रखते हुए सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए युग्मित t परीक्षण का उपयोग किया गया। विश्लेषण से 40 से कम घटनाओं वाले सभी समूहों को हटा दें; सांख्यिकीय विश्लेषण और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन करने से पहले किसी भी ऋणात्मक मान के लिए MFI मान 1 दर्ज करें।
उपरोक्त प्रक्रिया पैनल की मैन्युअल गेटिंग रणनीति को पूरक बनाने के लिए, हमने फ्लोजो में मृत कोशिकाओं को हटाने के बाद कोशिकाओं को स्वचालित रूप से जनसंख्या में आवंटित करने के लिए शेप रिस्ट्रिक्शन ट्री (FAUST) (21) द्वारा पूर्ण एनोटेशन का उपयोग किया। हम आउटपुट को मैन्युअल रूप से प्रबंधित करते हैं ताकि गलत तरीके से आवंटित प्रतीत होने वाली जनसंख्याओं (PD1+ को PD1-ट्यूमर कोशिकाओं के साथ मिलाकर) और बरकरार रखी गई जनसंख्याओं को मर्ज किया जा सके। प्रत्येक नमूने में औसतन 2% से अधिक कोशिकाएँ होती हैं, कुल मिलाकर 11 जनसंख्याएँ होती हैं।
ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पादों से पीबीएमसी को अलग करने के लिए फिकोल ग्रेडिएंट घनत्व सेंट्रीफ्यूगेशन (STEMCELL Technologies) का उपयोग किया गया। CD8 माइक्रोबीड्स (Miltenyi) का उपयोग करके पीबीएमसी से CD8+ टी कोशिकाओं को पृथक किया गया और निर्माता के निर्देशों के अनुसार 2 सप्ताह तक ट्रांसएक्ट (Miltenyi) का उपयोग करके पूर्ण माध्यम में विस्तारित किया गया। कोशिकाओं को IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) युक्त पूर्ण माध्यम में 5 दिनों तक रखा गया, और फिर ट्रांसएक्ट के साथ पुनः उत्तेजित किया गया। 7वें दिन, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, मानव CD45 माइक्रोबीड्स (Miltenyi) का उपयोग करके लगातार तीन चरणों में कोशिकाओं को समृद्ध किया गया। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण (जैसा कि ऊपर वर्णित है) के लिए कोशिकाओं को विभाजित किया गया, और LC-MS/MS विश्लेषण के लिए दस लाख कोशिकाओं को तीन बार विभाजित किया गया। नमूनों को नीचे वर्णित अनुसार LC-MS/MS द्वारा संसाधित किया गया। हमने 1,000 के आयन संख्या के साथ लुप्त मेटाबोलाइट मान का अनुमान लगाया। विश्लेषण से पहले प्रत्येक नमूने को कुल आयन संख्या (TIC) द्वारा सामान्यीकृत किया जाता है, लघुगणकीय रूप से परिवर्तित किया जाता है और MetaboAnalystR में स्वचालित रूप से सामान्यीकृत किया जाता है।
प्रत्येक रोगी के एकल कोशिका निलंबन को पिघलाया गया और 40 μm फ़िल्टर से छानकर पूर्ण माध्यम में डाला गया (जैसा कि ऊपर वर्णित है)। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, CD8+, CD4+ और CD45- कोशिकाओं के लिए नमूनों को समृद्ध करने के लिए माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) का उपयोग करके चुंबकीय मनका पृथक्करण द्वारा सकारात्मक चयन के तीन लगातार दौर (बर्फ पर) किए गए। संक्षेप में, कोशिकाओं को कोशिका संवर्धन बफर (जैसा कि ऊपर वर्णित है) में पुनः निलंबित किया गया और उनकी गणना की गई। कोशिकाओं को मानव CD8 बीड्स, मानव CD4 बीड्स या मानव CD45 बीड्स (मिल्टेनी) के साथ 4°C पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया, और फिर कोशिका संवर्धन बफर से धोया गया। नमूने को LS कॉलम (मिल्टेनी) से गुजारा गया, और सकारात्मक और नकारात्मक अंशों को एकत्र किया गया। अवधि को कम करने और कोशिका पुनर्प्राप्ति चरण को अधिकतम करने के लिए, CD8- अंश का उपयोग CD4+ संवर्धन के दूसरे दौर के लिए किया गया, और CD4- अंश का उपयोग बाद के CD45- संवर्धन के लिए किया गया। पृथक्करण की पूरी प्रक्रिया के दौरान घोल को बर्फ पर रखें।
मेटाबोलाइट विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने हेतु, कोशिकाओं को बर्फ़ जैसे ठंडे नमक के घोल से एक बार धोया गया, और प्रत्येक नमूने में 1 मिलीलीटर 80% मेथनॉल मिलाया गया, फिर उन्हें अच्छी तरह से मिलाया गया और तरल नाइट्रोजन में तुरंत जमा दिया गया। नमूनों को तीन बार जमने-पिघलने की प्रक्रिया से गुज़ारा गया और 4°C पर 15 मिनट के लिए 14,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। मेटाबोलाइट युक्त सुपरनेटेंट को पूरी तरह सूखने तक वाष्पीकृत किया गया। मेटाबोलाइट्स को 50 माइक्रोलीटर 0.03% फॉर्मिक एसिड में पुनः घोला गया, अच्छी तरह से मिलाया गया और फिर अवशेषों को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया।
ऊपर वर्णित विधि के अनुसार मेटाबोलाइट्स को निकालें। मेटाबोलॉमिक्स अनुसंधान के लिए सुपरनेटेंट को उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी बोतल में स्थानांतरित करें। बैच प्रभावों को रोकने के लिए प्रत्येक नमूने को समान संख्या में कोशिकाओं के साथ उपचारित करने के लिए एक यादृच्छिक उपचार प्रोटोकॉल का उपयोग करें। हमने एबी एससीआईईएक्स क्यूटीआरएपी 5500 ट्रिपल क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (50) पर पहले प्रकाशित वैश्विक मेटाबोलाइट्स का गुणात्मक मूल्यांकन किया। क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण और पीक क्षेत्र एकीकरण मल्टीक्वांट संस्करण 2.1 सॉफ्टवेयर (एप्लाइड बायोसिस्टम्स एससीआईईएक्स) का उपयोग करके किया गया।
लापता मेटाबोलाइट मान का अनुमान लगाने के लिए 1000 की आयन गणना का उपयोग किया गया था, और प्रत्येक नमूने के टीआईसी का उपयोग नमूना प्रसंस्करण से वाद्य विश्लेषण द्वारा लाए गए परिवर्तनों को ठीक करने के लिए प्रत्येक पता लगाए गए मेटाबोलाइट के सामान्यीकृत शिखर क्षेत्र की गणना करने के लिए किया गया था। टीआईसी के सामान्यीकरण के बाद, लघुगणकीय रूपांतरण और स्वचालित मानक रेखा स्केलिंग के लिए MetaboAnalystR(51) (डिफ़ॉल्ट पैरामीटर) का उपयोग किया जाता है। हमने नमूना प्रकारों के बीच मेटाबोलोम अंतरों के खोजपूर्ण विश्लेषण करने के लिए वेगन आर पैकेज के साथ पीसीए का उपयोग किया, और रोगियों का विश्लेषण करने के लिए आंशिक अतिरेक विश्लेषण का उपयोग किया। नमूनों के बीच यूक्लिडियन दूरी को क्लस्टर करने के लिए हीट मैप डेंड्रोग्राम बनाने के लिए वार्ड विधि का उपयोग किया गया। हमने संपूर्ण कोशिका प्रकार और सूक्ष्म वातावरण में भिन्न रूप से प्रचुर मात्रा में मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए मानकीकृत मेटाबोलाइट प्रचुरता पर लिम्मा (52) का उपयोग किया। स्पष्टीकरण को सरल बनाने के लिए, हम मॉडल को निर्दिष्ट करने के लिए समूह माध्य पैरामीटर का उपयोग करते हैं, और सूक्ष्म वातावरण में कोशिका प्रकारों को प्रत्येक समूह (n = 6 समूह) के रूप में मानते हैं; सार्थकता परीक्षण के लिए, हमने प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए तीन बार माप दोहराए। गलत दोहराव से बचने के लिए, लिम्मा डिज़ाइन में रोगी को एक बाधा के रूप में शामिल किया गया था। विभिन्न रोगियों के बीच मेटाबोलाइट्स में अंतर की जाँच करने के लिए, हमने रोगियों को एक निश्चित तरीके से शामिल करते हुए लिम्मा मॉडल को समायोजित किया। हम Padj के सेल प्रकार और सूक्ष्म वातावरण के बीच पूर्व-निर्धारित कंट्रास्ट की सार्थकता <0.05 (बेन्जामिनी-होचबर्ग सुधार) रिपोर्ट करते हैं।
मिल्टेनी डेड सेल रिमूवल किट (>80% व्यवहार्यता) का उपयोग करके जीवंतता संवर्धन के बाद, कुल जीवित जमे हुए एसाइटिस और ट्यूमर के नमूनों पर 10x 5′ जीन अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल का उपयोग करके एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रमण किया गया। मिलान वाले ट्यूमर और एसाइटिस वाले पाँच मामलों का विश्लेषण किया गया, हालाँकि एक ट्यूमर के नमूने की कम व्यवहार्यता के कारण इसे शामिल नहीं किया जा सका। रोगियों के कई चयन प्राप्त करने के लिए, हमने प्रत्येक रोगी के नमूनों को 10x क्रोमियम नियंत्रक की लेन में संयोजित किया, और एसाइटिस और ट्यूमर स्थलों का अलग-अलग विश्लेषण किया। अनुक्रमण के बाद [इल्यूमिना हाईसेक 4000 28×98 बीपी युग्मित अंत (पीई), क्यूबेक जीनोम; ट्यूमर और एसाइटिस के लिए क्रमशः प्रति कोशिका औसतन 73,488 और 41,378 रीड्स प्राप्त हुए। हमने CellSNP और Vireo (53) का उपयोग किया (CellSNP पर आधारित)। GRCh38 द्वारा प्रदान किए गए सामान्य मानव SNP (VCF) को एक दाता पहचान सौंपी जाती है। हम रोगी की जीनोटाइप स्थिति (IBS) की निकटतम पहचान (IBS) का अनुमान लगाने के लिए SNPRelate का उपयोग करते हैं, जिसमें अनिर्धारित कोशिकाओं और डुप्लेक्स के रूप में पहचानी गई कोशिकाओं और एसाइटिस और ट्यूमर के नमूनों के बीच मिलान करने वाले दाताओं को छोड़कर (54)। इस कार्य के आधार पर, हमने आगे के विश्लेषण के लिए ट्यूमर और एसाइटिस में प्रचुर मात्रा में कोशिका प्रतिनिधित्व वाले तीन मामलों को रखा। स्कैटर (55) और स्क्रैन (56) बायोकोंडक्टर पैकेजिंग में एक मास फिल्ट्रेशन चरण करने के बाद, विश्लेषण के लिए 6975 कोशिकाएं (ट्यूमर और एसाइटिस से क्रमशः 2792 और 4183 कोशिकाएं) प्राप्त हुईं। हमने साझा निकटतम पड़ोसी के igraph (57) के लूवेन क्लस्टरिंग का उपयोग किया। अभिव्यक्ति के आधार पर कोशिकाओं को क्लस्टर करने के लिए जैकार्ड दूरी पर आधारित नेटवर्क (SNN) का उपयोग किया गया। मार्कर जीन अभिव्यक्ति के आधार पर संभावित कोशिका प्रकारों के लिए क्लस्टरों को मैन्युअल रूप से एनोटेट किया गया और t-SNE के साथ दृश्यित किया गया। साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं को CD8A और GZMA की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया, जिसमें कम राइबोसोमल प्रोटीन अभिव्यक्ति वाले उप-क्लस्टरों को छोड़कर। हमने इज़ार एट अल. (16) के प्रकाशित डेटा का उपयोग किया, जिसमें उनके t-SNE एम्बेडिंग शामिल हैं, जो प्रतिरक्षा कोशिका मार्करों और NNMT अभिव्यक्ति के बीच अभिव्यक्ति ओवरलैप को नियंत्रित कर सकते हैं।
फिकोल ग्रेडिएंट घनत्व सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पादों (STEMCELL Technologies) से PBMC को अलग किया गया। CD3 बीड्स (Miltenyi) का उपयोग करके PBMC से CD3+ कोशिकाओं को पृथक किया गया। MNA की उपस्थिति या अनुपस्थिति में, CD3+ कोशिकाओं को प्लेट-बाउंड CD3 (5 μg/ml), घुलनशील CD28 (3 μg/ml) और IL-2 (300 U/ml; प्रोलेउकिन) के साथ सक्रिय किया गया। विस्तार के अंतिम दिन, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा व्यवहार्यता (फिक्सेबल वायबिलिटी डाई eFluor450, eBioscience) और प्रसार (123 काउंट eBeads, Thermo Fisher Scientific) का मूल्यांकन किया गया। प्रभावकारी क्रिया का मूल्यांकन करने के लिए, कोशिकाओं को गोल्गीस्टॉप के साथ PMA (20 ng/ml) और आयोनोमाइसिन (1 μg/ml) से 4 घंटे तक उत्तेजित करें और CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) और TNFα-फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (FITC) (MAb11, BD) की निगरानी करें। qPCR और ChIP कोशिकाओं को PMA (20 ng/ml) और आयोनोमाइसिन (1 μg/ml) से 4 घंटे तक उत्तेजित करें। PMA (20 ng/ml) और आयोनोमाइसिन (1 μg/ml) से 4 घंटे तक उत्तेजना से पहले और बाद में ELISA सुपरनेटेंट एकत्र किया गया।
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) का उपयोग करके RNA को अलग करने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें। नमूने को समरूप बनाने के लिए QIAshredder (QIAGEN) का उपयोग करें। पूरक DNA (cDNA) को संश्लेषित करने के लिए उच्च क्षमता वाले RNA से cDNA किट (Thermo Fisher Scientific) का उपयोग करें। जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) का उपयोग करें (निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार) निम्नलिखित प्रोब्स के साथ: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट ऑफ हाइड्रोजन (GAPDH)] और Hs01010726_m1 (SLC22A2)। नमूनों का परीक्षण स्टेपवनप्लस रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) पर माइक्रोएम्प फास्ट ऑप्टिकल 96-वेल रिएक्शन प्लेट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) में माइक्रोएम्प ऑप्टिकल फिल्म के साथ किया गया। 35 से अधिक सीटी मान को पता लगाने की सीमा से ऊपर माना जाता है और उसे पता न चलने योग्य के रूप में चिह्नित किया जाता है।
पहले बताए गए तरीके से ChIP करें (58)। संक्षेप में, कोशिकाओं को फॉर्मेल्डिहाइड (अंतिम सांद्रता 1.42%) से उपचारित किया गया और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। पूरक सूजन बफर (25 mM हेपेस, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl और 0.1% NP-40) का उपयोग बर्फ पर 10 मिनट के लिए करें, फिर बताए गए तरीके से इम्यूनोप्रेसिपिटेशन बफर में पुनः सस्पेंड करें (58)। इसके बाद नमूने को निम्नलिखित चक्रों के साथ सोनिकेट किया गया: 10 चक्र (20 1-सेकंड पल्स) और 40 सेकंड का स्थिर समय। ChIP-ग्रेड इम्यूनोग्लोबुलिन G (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 1μl), हिस्टोन H3 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 3μl), NFAT (इनविट्रोजन; 3μl) और SP1 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 3μl) एंटीबॉडी को नमूने के साथ 4°C पर रात भर हिलाते हुए इनक्यूबेट करें। प्रोटीन ए बीड्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक) को नमूने के साथ 4°C पर 1 घंटे तक हल्के हिलाते हुए इनक्यूबेट करें, फिर डीएनए को समृद्ध करने के लिए चेलेक्स बीड्स (बायो-रैड) का उपयोग करें, और प्रोटीन पाचन के लिए प्रोटीनएज़ के (थर्मो फिशर) का उपयोग करें। टीएनएफα प्रमोटर का पता पीसीआर द्वारा लगाया गया: फॉरवर्ड, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; विपरीत दिशा में, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-बीपीपी उत्पाद)। इमेजेज को इमेज लैब (बायो-रैड) द्वारा तैयार किया गया और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई।
सेल कल्चर सुपरनेटेंट को ऊपर बताए अनुसार एकत्र किया गया। मानव TNFα ELISA किट (इनविट्रोजन), मानव IL-2 ELISA किट (इनविट्रोजन) और मानव IFN-γ ELISA किट (एबकैम) के निर्माता के निर्देशों के अनुसार निर्धारण किया गया। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, TNFα और IL-2 का पता लगाने के लिए सुपरनेटेंट को 1:100 के अनुपात में और IFN-γ का पता लगाने के लिए 1:3 के अनुपात में पतला किया गया। 450 nm पर अवशोषण मापने के लिए EnVision 2104 मल्टीलेबल रीडर (पर्किनएल्मर) का उपयोग किया गया।
ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पादों (STEMCELL Technologies) से PBMC को फिकोल ग्रेडिएंट घनत्व सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा अलग किया गया। CD3+ कोशिकाओं को CD3 बीड्स (Miltenyi) का उपयोग करके PBMC से पृथक किया गया। MNA की उपस्थिति या अनुपस्थिति में, CD3+ कोशिकाओं को प्लेट-बाउंड CD3 (5 μg/ml), घुलनशील CD28 (3 μg/ml) और IL-2 (300 U/ml; Proleukin) के साथ 3 दिनों के लिए सक्रिय किया गया। 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं को एकत्र किया गया और 0.9% खारे पानी से धोया गया, और पेलेट को तुरंत जमा दिया गया। 123 काउंट ईबीड्स का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R कॉन्फ़िगरेशन) द्वारा कोशिका गणना की गई।
ऊपर वर्णित विधि के अनुसार मेटाबोलाइट्स को निकाला गया। सूखे अर्क को 4000 सेल इक्विवेलेंट/μl की सांद्रता पर पुनर्गठित किया गया। रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी (1290 इन्फिनिटी II, एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, CA) और CORTECS T3 कॉलम (2.1×150 mm, कण आकार 1.6-μm, छिद्र आकार 120-Å; #186008500, वाटर्स) द्वारा नमूने का विश्लेषण किया गया। पोलर मास स्पेक्ट्रोमीटर (6470, एजिलेंट) का उपयोग किया गया, जिसमें इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण पॉजिटिव मोड में संचालित होता है। मोबाइल फेज A 0.1% फॉर्मिक एसिड (H2O में) है, मोबाइल फेज B 90% एसीटोनिट्राइल और 0.1% फॉर्मिक एसिड है। LC ग्रेडिएंट 100% A के लिए 0 से 2 मिनट, 99% B के लिए 2 से 7.1 मिनट और 99% B के लिए 7.1 से 8 मिनट है। फिर 3 मिनट के लिए 0.6 मिली/मिनट की प्रवाह दर पर मोबाइल फेज A के साथ कॉलम को पुनः संतुलित करें। प्रवाह दर 0.4 मिली/मिनट है, और कॉलम चैम्बर को 50°C तक गर्म किया जाता है। प्रतिधारण समय (RT) और रूपांतरण (RT = 0.882 मिनट, रूपांतरण 1 = 137→94.1, रूपांतरण 2 = 137→92, रूपांतरण 3 = 137→78) स्थापित करने के लिए MNA के शुद्ध रासायनिक मानक (M320995, टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी, नॉर्थ यॉर्क, ओंटारियो, कनाडा) का उपयोग करें। जब तीनों रूपांतरण सही प्रतिधारण समय पर होते हैं, तो विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए मात्रा निर्धारण हेतु रूपांतरण 1 का उपयोग किया जाता है। MNA (टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी) का मानक वक्र स्टॉक विलयन (1 मिलीग्राम/मिलीलीटर) के छह क्रमिक तनुकरणों द्वारा तैयार किया गया था, जिससे क्रमशः 0.1, 1.0, 10 और 100 नैनोग्राम/मिलीलीटर तथा 1.0 और 10 माइक्रोग्राम/मिलीलीटर के मानक प्राप्त हुए। इसकी पहचान सीमा 1 नैनोग्राम/मिलीलीटर है, और रैखिक प्रतिक्रिया 10 नैनोग्राम/मिलीलीटर और 10 माइक्रोग्राम/मिलीलीटर के बीच है। LC/MS विश्लेषण के लिए नमूने और मानक के दो माइक्रोलीटर के प्रत्येक इंजेक्शन का उपयोग किया जाता है, और विश्लेषण प्लेटफॉर्म की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक आठ इंजेक्शन के बाद एक मिश्रित गुणवत्ता नियंत्रण नमूना चलाया जाता है। MNA से उपचारित सभी कोशिका नमूनों की MNA प्रतिक्रियाएँ परख की रैखिक सीमा के भीतर थीं। डेटा विश्लेषण मासहंटर मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (v9.0, एजिलेंट) का उपयोग करके किया गया था।
दूसरी पीढ़ी का αFR-CAR कंस्ट्रक्ट सोंग एट अल. (59) से लिया गया था। संक्षेप में, इस कंस्ट्रक्ट में निम्नलिखित घटक शामिल हैं: CD8a लीडर सीक्वेंस, मानव αFR-विशिष्ट सिंगल-चेन वेरिएबल फ्रैगमेंट, CD8a हिंज और ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र, CD27 इंट्रासेलुलर डोमेन और CD3z इंट्रासेलुलर डोमेन। संपूर्ण CAR सीक्वेंस को GenScript द्वारा संश्लेषित किया गया था, और फिर इसे दूसरी पीढ़ी के लेंटिवाइरल एक्सप्रेशन वेक्टर में GFP एक्सप्रेशन कैसेट के ऊपर क्लोन किया गया था, जिसका उपयोग ट्रांसडक्शन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था।
लेंटिवाइरस का उत्पादन HEK293T कोशिकाओं [अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC)] के ट्रांसफेक्शन द्वारा किया जाता है; इन्हें 10% फीटल बोवाइन सीरम (FBS) और 1% पेनस्ट्रेप युक्त डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम में उगाया जाता है, और CAR-GFP वेक्टर और पैकेजिंग प्लास्मिड (psPAX2 और pMD2.G, Addgene) का उपयोग किया जाता है। इसके लिए लिपोफेक्शन एमाइन (सिग्मा-एल्ड्रिच) का उपयोग किया जाता है। ट्रांसफेक्शन के 48 और 72 घंटे बाद वायरस युक्त सुपरनेटेंट को एकत्र किया गया, फ़िल्टर किया गया और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा सांद्रित किया गया। ट्रांसडक्शन तक सांद्रित वायरल सुपरनेटेंट को -80°C पर संग्रहित किया गया।
स्वस्थ दाता ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पादों (STEMCELL Technologies) से PBMC को फिकोल ग्रेडिएंट घनत्व सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा अलग किया जाता है। PBMC से CD8+ कोशिकाओं को पृथक करने के लिए पॉजिटिव सिलेक्शन CD8 माइक्रोबीड्स (Miltenyi) का उपयोग किया जाता है। T कोशिकाओं को TransAct (Miltenyi) और TexMACS माध्यम [Miltenyi; जिसमें 3% ऊष्मा-निष्क्रिय मानव सीरम, 1% PenStrep और IL-2 (300 U/ml) मिलाया गया है] में उत्तेजित किया जाता है। उत्तेजना के चौबीस घंटे बाद, T कोशिकाओं को लेंटिवाइरस (10 μl सांद्रित वायरस सुपरनेटेंट प्रति 106 कोशिकाएं) से ट्रांसड्यूस किया गया। ट्रांसडक्शन के 1 से 3 दिन बाद Cytek Aurora (FSC (फॉरवर्ड स्कैटर)/SSC (साइड स्कैटर), सिंगलेट, GFP+) पर, कोशिकाओं के GFP एक्सप्रेशन का मूल्यांकन करके कम से कम 30% की ट्रांसडक्शन दक्षता प्रदर्शित की जाती है।
CAR-T कोशिकाओं को इम्यूनोकल्ट (STEMCELL Technologies; 1% पेनस्ट्रेप युक्त) में 24 घंटे तक निम्नलिखित स्थितियों में संवर्धित किया गया: अनुपचारित, 250 μM एडेनोसिन या 10 mM MNA से उपचारित। पूर्व-उपचार के बाद, CAR-T कोशिकाओं को PBS से धोया गया और 20,000 SK-OV-3 कोशिकाओं [ATCC; McCoy 5A माध्यम (Sigma-Aldrich) में 10% FBS और 1% पेनस्ट्रेप युक्त 10:10 के अनुपात में मिलाया गया। प्रभावक से लक्ष्य अनुपात 1 को पूरक इम्यूनोकल्ट माध्यम में तीन बार दोहराया गया। SK-OV-3 कोशिकाओं और डिजिटलिस सैपोनिन (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) से लाइस की गई SK-OV-3 कोशिकाओं को क्रमशः नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया। 24 घंटे के सह-संवर्धन के बाद, सुपरनेटेंट को एकत्रित किया गया और निर्माता के निर्देशों के अनुसार लैक्टेट डीहाइड्रोजनेज (एलडीएच) का मापन किया गया (एलडीएच ग्लो साइटोटॉक्सिसिटी एसे किट, प्रोमेगा)। एलडीएच सुपरनेटेंट को एलडीएच बफर में 1:50 के अनुपात में पतला किया गया। कोशिका मृत्यु प्रतिशत को निम्न सूत्र का उपयोग करके मापा गया: कोशिका मृत्यु प्रतिशत = सुधार प्रतिशत / अधिकतम कोशिका मृत्यु दर x 100%, जहाँ सुधार प्रतिशत = सह-संवर्धन-केवल टी कोशिकाएँ, और अधिकतम कोशिका मृत्यु दर = धनात्मक नियंत्रण-ऋणात्मक नियंत्रण।
पाठ या सामग्री एवं विधियों में वर्णित अनुसार, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए GraphPad Prism 8, Microsoft Excel या R v3.6.0 का उपयोग करें। यदि एक ही रोगी से कई नमूने एकत्र किए जाते हैं (जैसे कि जलोदर और ट्यूमर), तो हम युग्मित टी परीक्षण का उपयोग करते हैं या रोगी को रैखिक या सामान्यीकृत मॉडल में उपयुक्त रूप से यादृच्छिक प्रभाव के रूप में शामिल करते हैं। मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण के लिए, महत्व परीक्षण तीन बार किया जाता है।
इस लेख के पूरक सामग्री के लिए, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 देखें।
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मारिसा के. किलगौर (मारिसा के. किलगौर), सारा मैकफर्सन (सारा मैकफर्सन), लॉरेन जी. जकारियास (लॉरेन जी. जकारियास), अबीगैल एली एरिस जी. वॉटसन (एच. वॉटसन), जॉन स्टैग (जॉन स्टैग), ब्रैड एच. नेल्सन (ब्रैड एच. नेल्सन), राल्फ जे. डी बेलार्डिनी (राल्फ जे. डेबेरार्डिनिस), रसेल जी. जोन्स (रसेल जी. जोन्स), फिनीस टी. हैमिल्टन (फिनीस टी.
एमएनए टी कोशिकाओं के प्रतिरक्षा दमन में योगदान देता है और मानव कैंसर के उपचार के लिए एक संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है।
मारिसा के. किलगौर (मारिसा के. किलगौर), सारा मैकफर्सन (सारा मैकफर्सन), लॉरेन जी. जकारियास (लॉरेन जी. जकारियास), अबीगैल एली एरिस जी. वॉटसन (एच. वॉटसन), जॉन स्टैग (जॉन स्टैग), ब्रैड एच. नेल्सन (ब्रैड एच. नेल्सन), राल्फ जे. डी बेलार्डिनी (राल्फ जे. डेबेरार्डिनिस), रसेल जी. जोन्स (रसेल जी. जोन्स), फिनीस टी. हैमिल्टन (फिनीस टी.
एमएनए टी कोशिकाओं के प्रतिरक्षा दमन में योगदान देता है और मानव कैंसर के उपचार के लिए एक संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है।
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