प्रोपियोनिक एसिड (पीपीए), एक जीवाणुरोधी एजेंट और सामान्य आहार योजक, चूहों में असामान्य तंत्रिका विकास और साथ ही गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल शिथिलता का कारण बनता पाया गया है, जो आंत के माइक्रोबायोटा असंतुलन के कारण हो सकता है। आहार में पीपीए के संपर्क और आंत के माइक्रोबायोटा असंतुलन के बीच एक संबंध का सुझाव दिया गया है, लेकिन इसकी प्रत्यक्ष रूप से जांच नहीं की गई है। यहां, हमने आंत के माइक्रोबायोटा संरचना में पीपीए से जुड़े परिवर्तनों की जांच की जो असंतुलन का कारण बन सकते हैं। बिना उपचारित आहार (n=9) और पीपीए-समृद्ध आहार (n=13) पर पाले गए चूहों के आंत के माइक्रोबायोम का लंबी दूरी की मेटाजेनोमिक अनुक्रमण का उपयोग करके अनुक्रमण किया गया ताकि सूक्ष्मजीव संरचना और जीवाणु चयापचय मार्गों में अंतर का आकलन किया जा सके। आहार में पीपीए का संबंध कई महत्वपूर्ण टैक्सोन की प्रचुरता में वृद्धि से था, जिनमें कई बैक्टेरॉइड्स, प्रीवोटेला और रूमीनोकोकस प्रजातियां शामिल हैं, जिनके सदस्यों को पहले पीपीए उत्पादन में शामिल किया गया है। पीपीए के संपर्क में आए चूहों के माइक्रोबायोम में लिपिड चयापचय और स्टेरॉयड हार्मोन जैवसंश्लेषण से संबंधित अधिक मार्ग भी थे। हमारे परिणाम बताते हैं कि पीपीए आंतों के माइक्रोबायोटा और उससे जुड़े चयापचय मार्गों को बदल सकता है। ये देखे गए परिवर्तन इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि उपभोग के लिए सुरक्षित माने जाने वाले परिरक्षक आंतों के माइक्रोबायोटा की संरचना और बदले में, मानव स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं।
मानव माइक्रोबायोम को अक्सर "शरीर का अंतिम अंग" कहा जाता है और यह मानव स्वास्थ्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है (बाकेरो और नोम्बेला, 2012)। विशेष रूप से, आंत माइक्रोबायोम अपने व्यापक प्रभाव और कई आवश्यक कार्यों में भूमिका के लिए जाना जाता है। आंत में सहजीवी बैक्टीरिया प्रचुर मात्रा में पाए जाते हैं, जो कई पारिस्थितिक स्थानों में रहते हैं, पोषक तत्वों का उपयोग करते हैं और संभावित रोगजनकों से प्रतिस्पर्धा करते हैं (जंध्याला एट अल., 2015)। आंत माइक्रोबायोटा के विविध जीवाणु घटक विटामिन जैसे आवश्यक पोषक तत्वों का उत्पादन करने और पाचन को बढ़ावा देने में सक्षम हैं (रोलैंड एट अल., 2018)। जीवाणु चयापचय को ऊतक विकास को प्रभावित करने और चयापचय और प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं को बढ़ाने के लिए भी दिखाया गया है (हेइज्ट्ज एट अल., 2011; यू एट अल., 2022)। मानव आंत माइक्रोबायोम की संरचना अत्यंत विविध है और यह आहार, लिंग, दवाओं और स्वास्थ्य स्थिति जैसे आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों पर निर्भर करती है (कुंभारे एट अल., 2019)।
मातृ आहार भ्रूण और नवजात शिशु के विकास का एक महत्वपूर्ण घटक है और उन यौगिकों का एक संभावित स्रोत है जो विकास को प्रभावित कर सकते हैं (बेज़र एट अल., 2004; इनिस, 2014)। ऐसा ही एक महत्वपूर्ण यौगिक प्रोपियोनिक एसिड (पीपीए) है, जो जीवाणु किण्वन से प्राप्त एक लघु-श्रृंखला वसा अम्ल उप-उत्पाद और एक खाद्य योज्य है (डेन बेस्टन एट अल., 2013)। पीपीए में जीवाणुरोधी और कवकनाशी गुण होते हैं और इसलिए इसका उपयोग खाद्य परिरक्षक के रूप में और औद्योगिक अनुप्रयोगों में फफूंद और जीवाणु वृद्धि को रोकने के लिए किया जाता है (वेम्मेनहोव एट अल., 2016)। पीपीए का विभिन्न ऊतकों में अलग-अलग प्रभाव होता है। यकृत में, पीपीए मैक्रोफेज में साइटोकाइन अभिव्यक्ति को प्रभावित करके सूजन-रोधी प्रभाव डालता है (कावासो एट अल., 2022)। यह नियामक प्रभाव अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं में भी देखा गया है, जिससे सूजन कम होती है (हासे एट अल., 2021)। हालांकि, मस्तिष्क में इसका विपरीत प्रभाव देखा गया है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि पीपीए के संपर्क में आने से चूहों में ऑटिज़्म जैसे व्यवहार उत्पन्न होते हैं (एल-अंसारी एट अल., 2012)। अन्य अध्ययनों से पता चला है कि पीपीए मस्तिष्क में ग्लियोसिस उत्पन्न कर सकता है और सूजन-रोधी मार्गों को सक्रिय कर सकता है (अब्देल्ली एट अल., 2019)। चूंकि पीपीए एक दुर्बल अम्ल है, यह आंतों की उपकला के माध्यम से रक्तप्रवाह में फैल सकता है और इस प्रकार रक्त-मस्तिष्क अवरोध और प्लेसेंटा सहित अवरोधकों को पार कर सकता है (स्टिन्सन एट अल., 2019), जो बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित एक नियामक चयापचय के रूप में पीपीए के महत्व को उजागर करता है। हालांकि ऑटिज़्म के लिए एक जोखिम कारक के रूप में पीपीए की संभावित भूमिका की वर्तमान में जांच चल रही है, ऑटिज़्म से ग्रस्त व्यक्तियों पर इसके प्रभाव तंत्रिका विभेदन को प्रेरित करने से कहीं अधिक हो सकते हैं।
तंत्रिका विकास संबंधी विकारों से पीड़ित रोगियों में दस्त और कब्ज जैसे गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल लक्षण आम हैं (काओ एट अल., 2021)। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ऑटिज्म स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर (एएसडी) से पीड़ित रोगियों का माइक्रोबायोम स्वस्थ व्यक्तियों से भिन्न होता है, जो आंत माइक्रोबायोटा असंतुलन की उपस्थिति का संकेत देता है (फाइनगोल्ड एट अल., 2010)। इसी प्रकार, सूजन आंत्र रोग, मोटापा, अल्जाइमर रोग आदि से पीड़ित रोगियों के माइक्रोबायोम की विशेषताएं भी स्वस्थ व्यक्तियों से भिन्न होती हैं (टर्नबौघ एट अल., 2009; वोग्ट एट अल., 2017; हेनके एट अल., 2019)। हालांकि, अभी तक आंत माइक्रोबायोम और तंत्रिका संबंधी रोगों या लक्षणों के बीच कोई कारण-कार्य संबंध स्थापित नहीं किया गया है (याप एट अल., 2021), हालांकि कुछ जीवाणु प्रजातियों को इनमें से कुछ रोग स्थितियों में भूमिका निभाने वाला माना जाता है। उदाहरण के लिए, ऑटिज़्म से पीड़ित रोगियों के माइक्रोबायोटा में अकरमानसिया, बैक्टेरॉइड्स, क्लोस्ट्रीडियम, लैक्टोबैसिलस, डेसल्फोविब्रियो और अन्य जेनेरा अधिक मात्रा में पाए जाते हैं (टोमोवा एट अल., 2015; गोलुबेवा एट अल., 2017; क्रिस्टियानो एट अल., 2018; ज़ुरिटा एट अल., 2020)। विशेष रूप से, इनमें से कुछ जेनेरा की सदस्य प्रजातियों में पीपीए उत्पादन से जुड़े जीन पाए जाते हैं (रीचार्ड्ट एट अल., 2014; यून और ली, 2016; झांग एट अल., 2019; बॉर और ड्यूरे, 2023)। पीपीए के रोगाणुरोधी गुणों को देखते हुए, इसकी प्रचुरता में वृद्धि पीपीए-उत्पादक बैक्टीरिया के विकास के लिए लाभकारी हो सकती है (जैकोबसन एट अल., 2018)। इस प्रकार, पीएफए ​​से भरपूर वातावरण आंतों के माइक्रोबायोटा में बदलाव ला सकता है, जिसमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगजनक भी शामिल हैं, जो गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल लक्षणों के संभावित कारक हो सकते हैं।
माइक्रोबायोम अनुसंधान में एक केंद्रीय प्रश्न यह है कि क्या सूक्ष्मजीवों की संरचना में अंतर अंतर्निहित बीमारियों का कारण है या लक्षण। आहार, आंत के माइक्रोबायोम और तंत्रिका संबंधी रोगों के बीच जटिल संबंध को स्पष्ट करने की दिशा में पहला कदम सूक्ष्मजीवों की संरचना पर आहार के प्रभावों का आकलन करना है। इस उद्देश्य के लिए, हमने पीपीए-समृद्ध या पीपीए-रहित आहार पर पलने वाले चूहों के बच्चों के आंत के माइक्रोबायोम की तुलना करने के लिए लॉन्ग-रीड मेटाजेनोमिक अनुक्रमण का उपयोग किया। बच्चों को वही आहार दिया गया जो उनकी माताओं को दिया गया था। हमने परिकल्पना की कि पीपीए-समृद्ध आहार से आंत के सूक्ष्मजीवों की संरचना और सूक्ष्मजीवों के कार्यात्मक मार्गों में परिवर्तन होंगे, विशेष रूप से वे जो पीपीए चयापचय और/या पीपीए उत्पादन से संबंधित हैं।
इस अध्ययन में FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J ट्रांसजेनिक चूहों (जैक्सन लेबोरेटरीज) का उपयोग किया गया, जो सेंट्रल फ्लोरिडा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (UCF-IACUC) के दिशानिर्देशों (पशु उपयोग परमिट संख्या: PROTO202000002) के अनुसार ग्लिया-विशिष्ट GFAP प्रमोटर के नियंत्रण में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) को अत्यधिक मात्रा में व्यक्त करते हैं। दूध छुड़ाने के बाद, चूहों को अलग-अलग पिंजरों में रखा गया, प्रत्येक पिंजरे में प्रत्येक लिंग के 1-5 चूहे थे। चूहों को या तो शुद्ध नियंत्रित आहार (संशोधित ओपन-लेबल मानक आहार, 16 किलो कैलोरी वसा) या सोडियम प्रोपियोनेट-पूरक आहार (संशोधित ओपन-लेबल मानक आहार, 16 किलो कैलोरी वसा, जिसमें 5,000 पीपीएम सोडियम प्रोपियोनेट होता है) दिया गया। उपयोग किए गए सोडियम प्रोपियोनेट की मात्रा 5,000 मिलीग्राम PFA/किलोग्राम कुल भोजन वजन के बराबर थी। खाद्य परिरक्षक के रूप में उपयोग के लिए स्वीकृत पीपीए की यह उच्चतम सांद्रता है। इस अध्ययन की तैयारी के लिए, जनक चूहों को संभोग से 4 सप्ताह पहले और मादा चूहे की गर्भावस्था के दौरान दोनों प्रकार के आहार दिए गए। संतान चूहों [22 चूहे, 9 नियंत्रण (6 नर, 3 मादा) और 13 पीपीए (4 नर, 9 मादा)] को दूध छुड़ाने के बाद 5 महीने तक मादा चूहों के समान आहार दिया गया। संतान चूहों को 5 महीने की उम्र में मार दिया गया और उनके आंतों के मल को एकत्र किया गया और प्रारंभ में -20°C पर 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबों में संग्रहित किया गया और फिर मेजबान डीएनए के समाप्त होने और सूक्ष्मजीवी न्यूक्लिक अम्लों के निष्कर्षण तक -80°C फ्रीजर में स्थानांतरित कर दिया गया।
होस्ट डीएनए को एक संशोधित प्रोटोकॉल (चारालैम्पस एट अल., 2019) के अनुसार निकाला गया। संक्षेप में, मल सामग्री को 500 µl इनहिबिटेक्स (क्वाइजेन, कैटलॉग संख्या/आईडी: 19593) में स्थानांतरित किया गया और जमा कर रखा गया। प्रति निष्कर्षण अधिकतम 1-2 मल पेलेट संसाधित करें। फिर ट्यूब के अंदर प्लास्टिक के मूसल का उपयोग करके मल सामग्री को यांत्रिक रूप से समरूप बनाया गया ताकि एक घोल बन जाए। नमूनों को 10,000 RCF पर 5 मिनट के लिए या नमूनों के पेलेट बनने तक सेंट्रीफ्यूज करें, फिर सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें और पेलेट को 250 µl 1× PBS में पुनः सस्पेंड करें। यूकेरियोटिक कोशिका झिल्लियों को ढीला करने के लिए डिटर्जेंट के रूप में नमूने में 250 µl 4.4% सैपोनिन घोल (TCI, उत्पाद संख्या S0019) मिलाएं। नमूनों को धीरे से तब तक मिलाया गया जब तक कि मिश्रण चिकना न हो जाए और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। इसके बाद, यूकेरियोटिक कोशिकाओं को विघटित करने के लिए, नमूने में 350 μl न्यूक्लिएज-मुक्त जल मिलाया गया, 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट किया गया, और फिर 12 μl 5 M NaCl मिलाया गया। इसके बाद नमूनों को 6000 RCF पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। सुपरनेटेंट को एस्पिरेट किया गया और पेलेट को 100 μl 1X PBS में पुनः सस्पेंड किया गया। होस्ट DNA को हटाने के लिए, 100 μl HL-SAN बफर (12.8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml न्यूक्लिएज-मुक्त जल) और 10 μl HL-SAN एंजाइम (ArticZymes P/N 70910-202) मिलाया गया। नमूनों को पिपेटिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाया गया और एपेंडॉर्फ™ थर्मोमिक्सर सी पर 800 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। इनक्यूबेशन के बाद, 6000 आरसीएफ पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया और 800 µl और 1000 µl 1X पीबीएस से दो बार धोया गया। अंत में, पेलेट को 100 µl 1X पीबीएस में पुनः सस्पेंड किया गया।
न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स मोनार्क जीनोमिक डीएनए प्यूरिफिकेशन किट (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स, इप्सविच, एमए, कैट# T3010L) का उपयोग करके कुल बैक्टीरियल डीएनए को अलग किया गया। किट के साथ दी गई मानक संचालन प्रक्रिया में थोड़ा संशोधन किया गया है। अंतिम इल्यूशन के लिए ऑपरेशन से पहले न्यूक्लिएज-मुक्त पानी को 60°C पर इनक्यूबेट करें और बनाए रखें। प्रत्येक नमूने में 10 µl प्रोटीनएज़ K और 3 µl RNase A मिलाएं। फिर 100 µl सेल लाइसिस बफर मिलाएं और धीरे से मिक्स करें। इसके बाद नमूनों को एपेंडॉर्फ™ थर्मोमिक्सर C में 56°C और 1400 rpm पर कम से कम 1 घंटे और अधिकतम 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। इनक्यूबेट किए गए नमूनों को 12,000 RCF पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया और प्रत्येक नमूने से सुपरनेटेंट को 400 µL बाइंडिंग सॉल्यूशन वाले एक अलग 1.5 mL माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित किया गया। इसके बाद ट्यूबों को 1 सेकंड के अंतराल पर 5-10 सेकंड के लिए पल्स वर्टेक्स किया गया। प्रत्येक नमूने की संपूर्ण तरल सामग्री (लगभग 600-700 µL) को एक फ्लो-थ्रू संग्रह ट्यूब में रखे फिल्टर कार्ट्रिज में स्थानांतरित करें। प्रारंभिक डीएनए बंधन के लिए ट्यूबों को 3 मिनट के लिए 1,000 RCF पर सेंट्रीफ्यूज किया गया और फिर अवशिष्ट तरल को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए 12,000 RCF पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। नमूना कॉलम को एक नई संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित किया गया और फिर दो बार धोया गया। पहले धोने के लिए, प्रत्येक ट्यूब में 500 µL वॉश बफर डालें। ट्यूब को 3-5 बार उल्टा करें और फिर 1 मिनट के लिए 12,000 RCF पर सेंट्रीफ्यूज करें। संग्रह ट्यूब से तरल को हटा दें और फिल्टर कार्ट्रिज को उसी संग्रह ट्यूब में वापस रख दें। दूसरे धोने के लिए, बिना उल्टा किए फिल्टर में 500 µL वॉश बफर डालें। नमूनों को 1 मिनट के लिए 12,000 RCF पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। फ़िल्टर को 1.5 मिलीलीटर लोबाइंड® ट्यूब में स्थानांतरित करें और 100 µL पहले से गर्म किए गए न्यूक्लिएज-मुक्त पानी को मिलाएं। फ़िल्टर को कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया और फिर 1 मिनट के लिए 12,000 RCF पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। निकाले गए डीएनए को -80°C पर संग्रहित किया गया।
डीएनए की सांद्रता का मापन क्यूबिट™ 4.0 फ्लोरोमीटर का उपयोग करके किया गया। डीएनए को क्यूबिट™ 1X डीएसडीएनए हाई सेंसिटिविटी किट (कैट. नं. Q33231) का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किया गया। डीएनए खंड की लंबाई का वितरण एजिलेंट™ 4150 या 4200 टेपस्टेशन का उपयोग करके मापा गया। डीएनए को एजिलेंट™ जीनोमिक डीएनए अभिकर्मकों (कैट. नं. 5067-5366) और जीनोमिक डीएनए स्क्रीनटेप (कैट. नं. 5067-5365) का उपयोग करके तैयार किया गया। लाइब्रेरी निर्माण ऑक्सफोर्ड नैनोपोर टेक्नोलॉजीज™ (ओएनटी) रैपिड पीसीआर बारकोडिंग किट (SQK-RPB004) का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया। डीएनए का अनुक्रमण ओएनटी ग्रिडियन™ एमके1 सीक्वेंसर का उपयोग करके मिन106डी फ्लो सेल (आर 9.4.1) के साथ किया गया। सीक्वेंसिंग सेटिंग्स इस प्रकार थीं: उच्च सटीकता बेस कॉलिंग, न्यूनतम q मान 9, बारकोड सेटअप और बारकोड ट्रिम। नमूनों की सीक्वेंसिंग 72 घंटे तक की गई, जिसके बाद बेस कॉल डेटा को आगे की प्रक्रिया और विश्लेषण के लिए भेजा गया।
बायोइन्फॉर्मेटिक्स प्रोसेसिंग पूर्व वर्णित विधियों (ग्रीनमैन एट अल., 2024) का उपयोग करके की गई थी। सीक्वेंसिंग से प्राप्त FASTQ फ़ाइलों को प्रत्येक नमूने के लिए अलग-अलग डायरेक्टरी में विभाजित किया गया था। बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण से पहले, डेटा को निम्नलिखित पाइपलाइन का उपयोग करके संसाधित किया गया था: सबसे पहले, नमूनों की FASTQ फ़ाइलों को एक ही FASTQ फ़ाइल में मर्ज किया गया। फिर, 1000 bp से छोटी रीड्स को Filtlong v. 0.2.1 का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया, जिसमें केवल एक पैरामीटर -min_length 1000 (विक, 2024) को बदला गया था। आगे फ़िल्टर करने से पहले, रीड की गुणवत्ता को NanoPlot v. 1.41.3 का उपयोग करके निम्नलिखित पैरामीटर के साथ नियंत्रित किया गया: -fastq -plots dot -N50 -o(डी कोस्टर और राडेमेकर्स, 2023)। होस्ट-दूषित रीड्स को हटाने के लिए मिनीमैप2 v. 2.24-r1122 का उपयोग करके रीड्स को माउस संदर्भ जीनोम GRCm39 (GCF_000001635.27) के साथ संरेखित किया गया था, जिसमें निम्नलिखित पैरामीटर थे: -L -ax map-ont(ली, 2018)। उत्पन्न संरेखण फ़ाइलों को samtools v. 1.16.1 में samtools view -b (डेनेक एट अल., 2021) का उपयोग करके BAM प्रारूप में परिवर्तित किया गया। इसके बाद, samtools view -b -f 4 का उपयोग करके असंरेखित रीड्स की पहचान की गई, जिससे पता चला कि ये रीड्स होस्ट जीनोम से संबंधित नहीं थे। असंरेखित रीड्स को डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ samtools bam2fq का उपयोग करके वापस FASTQ प्रारूप में परिवर्तित किया गया। पहले वर्णित सेटिंग्स का उपयोग करके आगे फ़िल्टर किए गए रीड्स पर नैनोप्लॉट को पुनः चलाया गया। फ़िल्टरिंग के बाद, मेटाजेनोमिक डेटा को metaflye v. 2.8.2-b1689 का उपयोग करके निम्नलिखित मापदंडों के साथ असेंबल किया गया: –nano-raw–meta (कोल्मोगोरोव एट अल., 2020)। शेष पैरामीटरों को उनके डिफ़ॉल्ट मानों पर छोड़ दें। असेंबली के बाद, फ़िल्टर किए गए रीड्स को मिनीमैप2 का उपयोग करके असेंबली में मैप किया गया, और SAM प्रारूप में एक अलाइनमेंट फ़ाइल बनाने के लिए -ax map-ont पैरामीटर का उपयोग किया गया। असेंबली को पहले racon v. 1.4.20 का उपयोग करके निम्नलिखित पैरामीटरों के साथ परिष्कृत किया गया: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (वासेर एट अल., 2017)। racon के पूरा होने के बाद, इसे medaka v. 1.7.2 का उपयोग करके medaka_consesus के साथ और परिष्कृत किया गया, जिसमें -m पैरामीटर को छोड़कर सभी पैरामीटर उनके डिफ़ॉल्ट मानों पर छोड़ दिए गए। -m पैरामीटर को r941_min_hac_g507 पर सेट किया गया है ताकि हमारे डेटा के लिए उपयोग की जाने वाली फ्लो सेल केमिस्ट्री और उच्च-सटीकता बेस कॉलिंग को निर्दिष्ट किया जा सके (नैनोपोरेटेक/मेडाका, 2024)। फ़िल्टर किए गए डेटा (जिसे आगे से माइक्रोबियल डेटा कहा जाएगा) और अंतिम रूप से साफ़ किए गए असेंबली का उपयोग आगे के विश्लेषण के लिए किया गया था।
वर्गीकरण के लिए, क्रैकेन2 v. 2.1.2 (वुड एट अल., 2019) का उपयोग करके रीड्स और असेंबल किए गए कॉन्टिग्स का वर्गीकरण किया गया। रीड्स और असेंबली के लिए क्रमशः रिपोर्ट और आउटपुट फ़ाइलें जेनरेट करें। रीड्स और असेंबली का विश्लेषण करने के लिए –use-names विकल्प का उपयोग करें। रीड सेगमेंट के लिए –gzip-compressed और –paired विकल्प निर्दिष्ट किए गए हैं। मेटाजीनोम में टैक्सोन की सापेक्ष बहुलता का अनुमान ब्रेकेन v. 2.8 (लू एट अल., 2017) का उपयोग करके लगाया गया था। हमने सबसे पहले निम्नलिखित मापदंडों के साथ ब्रेकेन-बिल्ड का उपयोग करके 1000 बेस वाला एक kmer डेटाबेस बनाया: -d-k 35 -l 1000 एक बार बन जाने के बाद, ब्रैकेन, क्रैकेन2 द्वारा उत्पन्न रिपोर्ट के आधार पर चलता है और निम्नलिखित विकल्पों का उपयोग करके डेटा को फ़िल्टर करता है: -d -I -O-पी 1000 -एल

इनमें से, विश्लेषण किए जा रहे वर्गीकरण स्तर के आधार पर P, G या S का चयन किया जाता है। गलत सकारात्मक वर्गीकरणों के प्रभाव को कम करने के लिए, 1e-4 (1/10,000 रीड्स) की न्यूनतम सापेक्ष प्रचुरता सीमा निर्धारित की गई थी। सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले, ब्रैकेन द्वारा रिपोर्ट की गई सापेक्ष प्रचुरता (fraction_total_reads) को सेंटर्ड लॉग-रेशियो (CLR) रूपांतरण (ऐचिसन, 1982) का उपयोग करके रूपांतरित किया गया था। डेटा रूपांतरण के लिए CLR विधि को इसलिए चुना गया क्योंकि यह स्केल-अपरिवर्तनीय है और गैर-विरल डेटासेट के लिए पर्याप्त है (ग्लोर एट अल., 2017)। CLR रूपांतरण प्राकृतिक लघुगणक का उपयोग करता है। ब्रैकेन द्वारा रिपोर्ट किए गए गणना डेटा को सापेक्ष लॉग एक्सप्रेशन (RLE) (एंडर्स और ह्यूबर्ट, 2010) का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था। आंकड़ों को मैटप्लॉटलिब v. 3.7.1, सीबॉर्न v. 3.7.2 और अनुक्रमिक लघुगणक (ग्लोर एट अल., 2017) 0.12.2 और स्टैन्टनोटेशन v. 0.5.0 (हंटर, 2007; वास्कॉम, 2021; चार्ली एट अल., 2022) के संयोजन का उपयोग करके तैयार किया गया था। प्रत्येक नमूने के लिए सामान्यीकृत जीवाणु गणना का उपयोग करके बैसिलस/बैक्टीरियोइडेट्स अनुपात की गणना की गई थी। तालिकाओं में रिपोर्ट किए गए मानों को 4 दशमलव स्थानों तक पूर्णांकित किया गया है। सिम्पसन विविधता सूचकांक की गणना क्रैकेनटूल्स v. 1.2 पैकेज (लू एट अल., 2022) में दिए गए alpha_diversity.py स्क्रिप्ट का उपयोग करके की गई थी। स्क्रिप्ट में ब्रैकेन रिपोर्ट दी गई है और सिम्पसन सूचकांक "Si" -an पैरामीटर के लिए दिया गया है। प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर को औसत CLR अंतर ≥ 1 या ≤ -1 के रूप में परिभाषित किया गया था। औसत CLR अंतर ±1 किसी नमूने के प्रकार की प्रचुरता में 2.7 गुना वृद्धि दर्शाता है। चिह्न (+/-) यह दर्शाता है कि क्या वह टैक्सोन PPA नमूने और नियंत्रण नमूने में अधिक प्रचुर मात्रा में है। सार्थकता का निर्धारण मैन-व्हिटनी U परीक्षण (विर्टानेन एट अल., 2020) का उपयोग करके किया गया था। स्टेट्समॉडेल्स v. 0.14 (बेन्जामिनी और होचबर्ग, 1995; सीबोल्ड और पर्कटोल्ड, 2010) का उपयोग किया गया था, और एकाधिक परीक्षणों के लिए सुधार हेतु बेन्जामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया लागू की गई थी। सांख्यिकीय सार्थकता निर्धारित करने के लिए समायोजित p-मान ≤ 0.05 को सीमा के रूप में उपयोग किया गया था।
जीन एनोटेशन और सापेक्ष प्रचुरता अनुमान, मरांगा एट अल. (मरांगा एट अल., 2023) द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के संशोधित संस्करण का उपयोग करके किया गया था। सबसे पहले, SeqKit v. 2.5.1 (शेन एट अल., 2016) का उपयोग करके सभी असेंबली से 500 bp से छोटे कॉन्टिग्स को हटा दिया गया। चयनित असेंबली को फिर एक पैन-मेटाजीनोम में संयोजित किया गया। ओपन रीडिंग फ्रेम्स (ORFs) की पहचान Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3 का एक समानांतर संस्करण) का उपयोग करके निम्नलिखित मापदंडों के साथ की गई: -d-एफ जीएफएफ-आई -O-T 24 -p मेटा -C 10000 (हायट एट अल., 2012; जैनिके, 2024)। परिणामी न्यूक्लियोटाइड फ़ाइलों को फिर पायथन का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया ताकि सभी अपूर्ण जीनों को हटाया जा सके। इसके बाद CD-HIT v. 4.8.1 का उपयोग निम्नलिखित मापदंडों के साथ जीनों को क्लस्टर करने के लिए किया गया: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (फू एट अल., 2012)। उत्पन्न गैर-अनावश्यक जीन कैटलॉग का उपयोग जीन प्रचुरता और एनोटेशन का अनुमान लगाने के लिए किया गया था। सापेक्ष जीन प्रचुरता का अनुमान KMA v. 1.4.9 (क्लॉसेन एट अल., 2018) का उपयोग करके लगाया गया था। सबसे पहले, निम्नलिखित मापदंडों के साथ KMA इंडेक्स का उपयोग करके एक इंडेक्स फ़ाइल बनाएँ: -i -Oफिर, बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन अनुभाग में वर्णित अनुसार प्रत्येक नमूने के लिए माइक्रोबियल रीड्स के साथ उत्पन्न इंडेक्स का उपयोग करते हुए, KMA को निम्नलिखित मापदंडों के साथ चलाया गया: -i -O-टी_डीबी-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. इसके बाद, CLR का उपयोग करके जीन गणनाओं को सामान्यीकृत किया गया, और Sci-kit learn के प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस (PCA) वर्ग का उपयोग किया गया (पेद्रेगोसा एट अल., 2011)। अनुमानित जीन एनोटेशन गैर-अतिरेक जीन कैटलॉग पर eggNOG v. 2.1.12 के emapper.py स्क्रिप्ट और eggNOG डेटाबेस संस्करण 5.0.2 का उपयोग करके निम्नलिखित मापदंडों के साथ किया गया: –itype CDS –cpu 24 -i– डेटा कैटलॉग–गो_एविडेंस गैर-इलेक्ट्रॉनिक – आउटपुट– आउटपुट निर्देशिका–target_orthologs all –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(कैंटालापिएड्रा एट अल., 2021)। केएमए परिणामों की जांच करके पर्याप्त टेम्पलेट कवरेज और टेम्पलेट पहचान (≥ 90%) तथा प्रचुरता (गहराई ≥ 3) वाले जीनों का चयन किया गया। केएमए गहराई परिणामों को ऊपर वर्णित अनुसार सीएलआर का उपयोग करके रूपांतरित किया गया। इसके बाद, प्रत्येक जीन के लिए कॉन्टिग स्रोत का उपयोग करके कार्यात्मक एनोटेशन और वर्गीकरण परिणामों से प्राप्त कॉन्टिग आईडी के साथ केएमए परिणामों की तुलना की गई। टैक्सोन की तरह, जीन प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर को उन जीनों के रूप में परिभाषित किया गया जिनका औसत सीएलआर अंतर ≥ 1 या ≤ -1 था, जिसमें चिह्न (+/-) यह दर्शाता है कि जीन क्रमशः पीपीए या नियंत्रण नमूनों में अधिक प्रचुर मात्रा में था।
जीन पाथवे की प्रचुरता की तुलना करने के लिए, जीनों को सबसे पहले eggNOG द्वारा निर्दिष्ट क्योटो एनसाइक्लोपीडिया ऑफ जीन्स एंड जीनोम्स (KEGG) ऑर्थोलॉग (KO) पहचानकर्ताओं के अनुसार समूहीकृत किया गया। विश्लेषण से पहले, बिना नॉकआउट वाले या एकाधिक नॉकआउट वाले जीनों को हटा दिया गया। इसके बाद, प्रत्येक नमूने में प्रत्येक KO की औसत प्रचुरता की गणना की गई और सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया। PPA चयापचय जीन को KEGG_Pathway कॉलम में ko00640 पंक्ति से निर्दिष्ट किसी भी जीन के रूप में परिभाषित किया गया, जो KEGG के अनुसार प्रोपियोनेट चयापचय में भूमिका को दर्शाता है। PPA उत्पादन से संबंधित जीनों की सूची अनुपूरक तालिका 1 में दी गई है (रीचार्ड्ट एट अल., 2014; यांग एट अल., 2017)। प्रत्येक नमूना प्रकार में महत्वपूर्ण रूप से अधिक प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले PPA चयापचय और उत्पादन जीनों की पहचान करने के लिए क्रमचय परीक्षण किए गए। विश्लेषण किए गए प्रत्येक जीन के लिए एक हजार क्रमचय किए गए। सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करने के लिए 0.05 के p-मान को कटऑफ के रूप में उपयोग किया गया। क्लस्टर के भीतर प्रतिनिधि जीनों के एनोटेशन के आधार पर, क्लस्टर के भीतर अलग-अलग जीनों को कार्यात्मक एनोटेशन दिए गए। पीपीए चयापचय और/या पीपीए उत्पादन से जुड़े टैक्सोन की पहचान क्रैकेन2 आउटपुट फ़ाइलों में कॉन्टिग आईडी का मिलान करके की जा सकती है, जो एगएनओजी का उपयोग करके कार्यात्मक एनोटेशन के दौरान बरकरार रखी गई समान कॉन्टिग आईडी से मेल खाती हैं। सार्थकता परीक्षण पहले वर्णित मैन-व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग करके किया गया था। एकाधिक परीक्षण के लिए सुधार बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया का उपयोग करके किया गया था। सांख्यिकीय सार्थकता निर्धारित करने के लिए पी-मान ≤ 0.05 को कटऑफ के रूप में उपयोग किया गया था।
चूहों के आंत माइक्रोबायोम की विविधता का आकलन सिम्पसन विविधता सूचकांक का उपयोग करके किया गया। जीनस और प्रजाति विविधता के संदर्भ में नियंत्रण और पीपीए नमूनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया (जीनस के लिए पी-मान: 0.18, प्रजाति के लिए पी-मान: 0.16) (चित्र 1)। इसके बाद प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग करके सूक्ष्मजीव संरचना की तुलना की गई। चित्र 2 नमूनों के उनके फाइला के अनुसार क्लस्टरिंग को दर्शाता है, जिससे पता चलता है कि पीपीए और नियंत्रण नमूनों के माइक्रोबायोम की प्रजाति संरचना में अंतर था। यह क्लस्टरिंग जीनस स्तर पर कम स्पष्ट थी, जिससे पता चलता है कि पीपीए कुछ बैक्टीरिया को प्रभावित करता है (पूरक चित्र 1)।
चित्र 1. चूहे के आंत माइक्रोबायोम की प्रजाति और वंशों की अल्फा विविधता। बॉक्स प्लॉट पीपीए और नियंत्रण नमूनों में वंशों (ए) और प्रजातियों (बी) के सिम्पसन विविधता सूचकांकों को दर्शाते हैं। सार्थकता का निर्धारण मैन-व्हिटनी यू परीक्षण द्वारा किया गया था, और बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया का उपयोग करके बहु-सुधार किया गया था। ns, p-मान सार्थक नहीं था (p>0.05)।
चित्र 2. प्रजाति स्तर पर चूहे की आंत के माइक्रोबायोम संरचना के प्रमुख घटक विश्लेषण के परिणाम। प्रमुख घटक विश्लेषण प्लॉट नमूनों के पहले दो प्रमुख घटकों में वितरण को दर्शाता है। रंग नमूने के प्रकार को इंगित करते हैं: पीपीए-प्रभावित चूहे बैंगनी रंग के हैं और नियंत्रण चूहे पीले रंग के हैं। प्रमुख घटक 1 और 2 को क्रमशः x-अक्ष और y-अक्ष पर प्लॉट किया गया है, और इन्हें उनके व्याख्यायित विचरण अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया है।
आरएलई रूपांतरित गणना डेटा का उपयोग करते हुए, नियंत्रण और पीपीए चूहों में बैक्टीरियोइडेट्स/बैसिली अनुपात के माध्यिका में महत्वपूर्ण कमी देखी गई (नियंत्रण: 9.66, पीपीए: 3.02; पी-मान = 0.0011)। यह अंतर नियंत्रण की तुलना में पीपीए चूहों में बैक्टीरियोइडेट्स की अधिकता के कारण था, हालांकि यह अंतर महत्वपूर्ण नहीं था (नियंत्रण माध्य सीएलआर: 5.51, पीपीए माध्य सीएलआर: 6.62; पी-मान = 0.054), जबकि बैक्टीरियोइडेट्स की मात्रा समान थी (नियंत्रण माध्य सीएलआर: 7.76, पीपीए माध्य सीएलआर: 7.60; पी-मान = 0.18)।
आंत के माइक्रोबायोम के वर्गीकरण संबंधी सदस्यों की प्रचुरता के विश्लेषण से पता चला कि पीपीए और नियंत्रण नमूनों के बीच 1 फाइलम और 77 प्रजातियों में महत्वपूर्ण अंतर था (पूरक तालिका 2)। पीपीए नमूनों में 59 प्रजातियों की प्रचुरता नियंत्रण नमूनों की तुलना में काफी अधिक थी, जबकि नियंत्रण नमूनों में केवल 16 प्रजातियों की प्रचुरता पीपीए नमूनों की तुलना में अधिक थी (चित्र 3)।
चित्र 3. पीपीए और नियंत्रण चूहों के आंत माइक्रोबायोम में टैक्सोन की भिन्न-भिन्न प्रचुरता। ज्वालामुखी प्लॉट पीपीए और नियंत्रण नमूनों के बीच जेनेरा (ए) या प्रजातियों (बी) की प्रचुरता में अंतर दर्शाते हैं। धूसर बिंदु टैक्सोन की प्रचुरता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दर्शाते हैं। रंगीन बिंदु प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर (पी-मान ≤ 0.05) दर्शाते हैं। नमूना प्रकारों के बीच प्रचुरता में सबसे बड़े अंतर वाले शीर्ष 20 टैक्सोन को क्रमशः लाल और हल्के नीले रंग (नियंत्रण और पीपीए नमूने) में दिखाया गया है। पीले और बैंगनी बिंदु नियंत्रण या पीपीए नमूनों में नियंत्रण की तुलना में कम से कम 2.7 गुना अधिक प्रचुर मात्रा में थे। काले बिंदु उन टैक्सोन को दर्शाते हैं जिनकी प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर है, जिनका औसत सीएलआर अंतर -1 और 1 के बीच है। पी मानों की गणना मैन-व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग करके की गई थी और बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया का उपयोग करके बहु-परीक्षण के लिए सही किया गया था। बोल्ड औसत सीएलआर अंतर प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं।
आंत के सूक्ष्मजीवों की संरचना का विश्लेषण करने के बाद, हमने माइक्रोबायोम का कार्यात्मक विश्लेषण किया। कम गुणवत्ता वाले जीनों को छांटने के बाद, सभी नमूनों में कुल 378,355 अद्वितीय जीन पाए गए। इन जीनों की रूपांतरित प्रचुरता का उपयोग प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) के लिए किया गया, और परिणामों से पता चला कि नमूना प्रकारों में उनके कार्यात्मक प्रोफाइल के आधार पर उच्च स्तर का समूहीकरण है (चित्र 4)।
चित्र 4. चूहे के आंत माइक्रोबायोम के कार्यात्मक प्रोफाइल का उपयोग करके पीसीए परिणाम। पीसीए प्लॉट नमूनों के पहले दो प्रमुख घटकों में वितरण को दर्शाता है। रंग नमूने के प्रकार को इंगित करते हैं: पीपीए-एक्सपोज़्ड चूहे बैंगनी रंग के हैं और नियंत्रण चूहे पीले रंग के हैं। प्रमुख घटक 1 और 2 को क्रमशः x-अक्ष और y-अक्ष पर प्लॉट किया गया है, और इन्हें उनके व्याख्यायित विचरण अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया है।
इसके बाद हमने विभिन्न प्रकार के नमूनों में KEGG नॉकआउट की प्रचुरता की जांच की। कुल 3648 अद्वितीय नॉकआउट की पहचान की गई, जिनमें से 196 नियंत्रण नमूनों में और 106 PPA नमूनों में काफी अधिक मात्रा में पाए गए (चित्र 5)। नियंत्रण नमूनों में कुल 145 जीन और PPA नमूनों में 61 जीन पाए गए, जिनकी प्रचुरता में काफी अंतर था। लिपिड और एमिनोशुगर चयापचय से संबंधित मार्ग PPA नमूनों में काफी अधिक समृद्ध थे (पूरक तालिका 3)। नाइट्रोजन चयापचय और सल्फर रिले सिस्टम से संबंधित मार्ग नियंत्रण नमूनों में काफी अधिक समृद्ध थे (पूरक तालिका 3)। एमिनोशुगर/न्यूक्लियोटाइड चयापचय (ko:K21279) और इनोसिटोल फॉस्फेट चयापचय (ko:K07291) से संबंधित जीनों की प्रचुरता PPA नमूनों में काफी अधिक थी (चित्र 5)। नियंत्रण नमूनों में बेंजोएट चयापचय (ko:K22270), नाइट्रोजन चयापचय (ko:K00368), और ग्लाइकोलिसिस/ग्लूकोनियोजेनेसिस (ko:K00131) से संबंधित जीन काफी अधिक थे (चित्र 5)।
चित्र 5. पीपीए और नियंत्रण चूहों के आंत माइक्रोबायोम में KO की विभेदक प्रचुरता। ज्वालामुखी प्लॉट कार्यात्मक समूहों (KO) की प्रचुरता में अंतर को दर्शाता है। धूसर बिंदु उन KO को इंगित करते हैं जिनकी प्रचुरता नमूना प्रकारों के बीच महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं थी (p-मान > 0.05)। रंगीन बिंदु प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर (p-मान ≤ 0.05) को इंगित करते हैं। नमूना प्रकारों के बीच प्रचुरता में सबसे बड़े अंतर वाले 20 KO को क्रमशः नियंत्रण और पीपीए नमूनों के अनुरूप लाल और हल्के नीले रंग में दिखाया गया है। पीले और बैंगनी बिंदु क्रमशः नियंत्रण और पीपीए नमूनों में कम से कम 2.7 गुना अधिक प्रचुर मात्रा में मौजूद KO को इंगित करते हैं। काले बिंदु -1 और 1 के बीच औसत CLR अंतर के साथ महत्वपूर्ण रूप से भिन्न प्रचुरता वाले KO को इंगित करते हैं। P मानों की गणना मैन-व्हिटनी U परीक्षण का उपयोग करके की गई थी और बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया का उपयोग करके एकाधिक तुलनाओं के लिए समायोजित किया गया था। NaN इंगित करता है कि KO KEGG में किसी मार्ग से संबंधित नहीं है। बोल्ड में दर्शाए गए औसत CLR अंतर मान प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं। सूचीबद्ध KOs जिन मार्गों से संबंधित हैं, उनके बारे में विस्तृत जानकारी के लिए, अनुपूरक तालिका 3 देखें।
एनोटेटेड जीनों में से, 1601 जीनों की प्रचुरता विभिन्न नमूना प्रकारों के बीच काफी भिन्न थी (p ≤ 0.05), जिनमें से प्रत्येक जीन कम से कम 2.7 गुना अधिक प्रचुर मात्रा में था। इनमें से 4 जीन नियंत्रण नमूनों में अधिक प्रचुर मात्रा में थे और 1597 जीन पीपीए नमूनों में अधिक प्रचुर मात्रा में थे। चूंकि पीपीए में रोगाणुरोधी गुण होते हैं, इसलिए हमने विभिन्न नमूना प्रकारों के बीच पीपीए चयापचय और उत्पादन जीनों की प्रचुरता की जांच की। 1332 पीपीए चयापचय-संबंधित जीनों में से, 27 जीन नियंत्रण नमूनों में काफी अधिक प्रचुर मात्रा में थे और 12 जीन पीपीए नमूनों में अधिक प्रचुर मात्रा में थे। 223 पीपीए उत्पादन-संबंधित जीनों में से, 1 जीन पीपीए नमूनों में काफी अधिक प्रचुर मात्रा में था। चित्र 6ए पीपीए चयापचय में शामिल जीनों की उच्च प्रचुरता को दर्शाता है, जिसमें नियंत्रण नमूनों में काफी अधिक प्रचुरता और बड़े प्रभाव आकार हैं, जबकि चित्र 6बी पीपीए नमूनों में देखी गई काफी अधिक प्रचुरता वाले व्यक्तिगत जीनों को उजागर करता है।
चित्र 6. चूहे के आंत माइक्रोबायोम में पीपीए-संबंधित जीनों की भिन्न-भिन्न प्रचुरता। ज्वालामुखीय प्लॉट पीपीए चयापचय (ए) और पीपीए उत्पादन (बी) से जुड़े जीनों की प्रचुरता में अंतर दर्शाते हैं। धूसर बिंदु उन जीनों को इंगित करते हैं जिनकी प्रचुरता नमूना प्रकारों के बीच महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं थी (पी-मान > 0.05)। रंगीन बिंदु प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर (पी-मान ≤ 0.05) दर्शाते हैं। प्रचुरता में सबसे बड़े अंतर वाले 20 जीनों को क्रमशः लाल और हल्के नीले रंग (नियंत्रण और पीपीए नमूने) में दिखाया गया है। पीले और बैंगनी बिंदुओं की प्रचुरता नियंत्रण नमूनों की तुलना में नियंत्रण और पीपीए नमूनों में कम से कम 2.7 गुना अधिक थी। काले बिंदु उन जीनों को दर्शाते हैं जिनकी प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर है, जिनका औसत सीएलआर अंतर -1 और 1 के बीच है। पी मानों की गणना मैन-व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग करके की गई थी और बेंजामिनी-होचबर्ग प्रक्रिया का उपयोग करके एकाधिक तुलनाओं के लिए सही किया गया था। जीन गैर-अतिरेक जीन सूची में प्रतिनिधि जीनों के अनुरूप हैं। जीन के नामों में KEGG प्रतीक होता है जो KO जीन को दर्शाता है। बोल्ड में दर्शाए गए औसत CLR अंतर महत्वपूर्ण रूप से भिन्न प्रचुरता को इंगित करते हैं। एक डैश (-) इंगित करता है कि KEGG डेटाबेस में जीन के लिए कोई प्रतीक नहीं है।
पीपीए चयापचय और/या उत्पादन से संबंधित जीन वाले टैक्सोन की पहचान कॉन्टिग की वर्गीकरण पहचान को जीन के कॉन्टिग आईडी से मिलान करके की गई। जीनस स्तर पर, 130 जेनेरा में पीपीए चयापचय से संबंधित जीन पाए गए और 61 जेनेरा में पीपीए उत्पादन से संबंधित जीन पाए गए (पूरक तालिका 4)। हालांकि, किसी भी जेनेरा में प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया (p > 0.05)।
प्रजाति स्तर पर, 144 जीवाणु प्रजातियों में पीपीए चयापचय से संबंधित जीन पाए गए और 68 जीवाणु प्रजातियों में पीपीए उत्पादन से संबंधित जीन पाए गए (पूरक तालिका 5)। पीपीए चयापचय करने वाले जीवाणुओं में से, आठ जीवाणुओं ने नमूना प्रकारों के बीच प्रचुरता में महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई, और सभी ने प्रभाव में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाया (पूरक तालिका 6)। प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर वाले सभी पहचाने गए पीपीए चयापचय करने वाले जीवाणु पीपीए नमूनों में अधिक मात्रा में पाए गए। प्रजाति-स्तरीय वर्गीकरण ने उन वंशों के प्रतिनिधियों को प्रकट किया जिनमें नमूना प्रकारों के बीच महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जिनमें कई बैक्टेरॉइड्स और रूमीनोकोकस प्रजातियां, साथ ही डंकानिया डुबोइस, माइक्सोबैक्टीरियम एंटेरिका, मोनोकोकस पेक्टिनोलिटिकस और एल्केलिजेन्स पॉलीमोर्फा शामिल हैं। पीपीए उत्पादक जीवाणुओं में से, चार जीवाणुओं ने नमूना प्रकारों के बीच प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर वाली प्रजातियों में बैक्टेरॉइड्स नोवोरोसी, डंकानिया डुबोइस, माइक्सोबैक्टीरियम एंटेरिटिडिस और रूमीनोकोकस बोविस शामिल हैं।
इस अध्ययन में, हमने चूहों के आंत माइक्रोबायोटा पर पीपीए के प्रभाव का परीक्षण किया। पीपीए बैक्टीरिया में अलग-अलग प्रतिक्रियाएँ उत्पन्न कर सकता है क्योंकि यह कुछ प्रजातियों द्वारा उत्पादित होता है, अन्य प्रजातियों द्वारा भोजन के रूप में उपयोग किया जाता है, या इसमें रोगाणुरोधी प्रभाव होते हैं। इसलिए, आहार पूरक के माध्यम से आंत के वातावरण में इसके समावेश के सहनशीलता, संवेदनशीलता और पोषक तत्व के रूप में इसका उपयोग करने की क्षमता के आधार पर अलग-अलग प्रभाव हो सकते हैं। संवेदनशील जीवाणु प्रजातियाँ समाप्त हो सकती हैं और उनकी जगह पीपीए के प्रति अधिक प्रतिरोधी या इसे भोजन के रूप में उपयोग करने में सक्षम प्रजातियाँ आ सकती हैं, जिससे आंत माइक्रोबायोटा की संरचना में परिवर्तन हो सकता है। हमारे परिणामों से सूक्ष्मजीव संरचना में महत्वपूर्ण अंतर का पता चला, लेकिन समग्र सूक्ष्मजीव विविधता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। सबसे बड़े प्रभाव प्रजाति स्तर पर देखे गए, जिसमें पीपीए और नियंत्रण नमूनों के बीच 70 से अधिक टैक्सोन की प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर था (पूरक तालिका 2)। पीपीए-उजागर नमूनों की संरचना के आगे के मूल्यांकन से गैर-उजागर नमूनों की तुलना में सूक्ष्मजीव प्रजातियों की अधिक विषमता का पता चला, जिससे पता चलता है कि पीपीए जीवाणु वृद्धि विशेषताओं को बढ़ा सकता है और पीपीए-समृद्ध वातावरण में जीवित रहने वाली जीवाणु आबादी को सीमित कर सकता है। इस प्रकार, पीपीए आंत के माइक्रोबायोटा की विविधता में व्यापक व्यवधान पैदा करने के बजाय चुनिंदा रूप से परिवर्तन प्रेरित कर सकता है।
पीपीए जैसे खाद्य परिरक्षकों को पहले आंत के माइक्रोबायोम घटकों की प्रचुरता को बदलने के लिए दिखाया गया है, लेकिन समग्र विविधता को प्रभावित नहीं करते हैं (नागपाल एट अल., 2021)। यहां, हमने बैक्टीरियोइडेट्स (जिसे पहले बैक्टीरियोइडेट्स के नाम से जाना जाता था) के अंतर्गत बैक्टीरियोइडेट्स प्रजातियों के बीच सबसे उल्लेखनीय अंतर देखा, जो पीपीए के संपर्क में आए चूहों में काफी अधिक मात्रा में पाए गए। बैक्टीरियोइड्स प्रजातियों की बढ़ी हुई प्रचुरता बलगम के अपघटन में वृद्धि से जुड़ी है, जिससे संक्रमण का खतरा बढ़ सकता है और सूजन को बढ़ावा मिल सकता है (कॉर्निक एट अल., 2015; देसाई एट अल., 2016; पेनज़ोल एट अल., 2019)। एक अध्ययन में पाया गया कि बैक्टेरॉइड्स फ्रैजिलिस से उपचारित नवजात नर चूहों में ऑटिज्म स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर (एएसडी) के समान सामाजिक व्यवहार प्रदर्शित हुए (कार्मेल एट अल., 2023), और अन्य अध्ययनों से पता चला है कि बैक्टेरॉइड्स प्रजातियाँ प्रतिरक्षा गतिविधि को बदल सकती हैं और ऑटोइम्यून इंफ्लेमेटरी कार्डियोमायोपैथी का कारण बन सकती हैं (गिल-क्रूज़ एट अल., 2019)। पीपीए के संपर्क में आने वाले चूहों में रूमीनोकोकस, प्रीवोटेला और पैराबैक्टेरॉइड्स वंश से संबंधित प्रजातियों में भी उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई (कोरेटी एट अल., 2018)। कुछ रूमीनोकोकस प्रजातियाँ प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स के उत्पादन के माध्यम से क्रोहन रोग जैसी बीमारियों से जुड़ी हैं (हेनके एट अल., 2019), जबकि प्रीवोटेला प्रजातियाँ जैसे कि प्रीवोटेला ह्यूमानी उच्च रक्तचाप और इंसुलिन संवेदनशीलता जैसी चयापचय संबंधी बीमारियों से जुड़ी हैं (पेडरसन एट अल., 2016; ली एट अल., 2017)। अंत में, हमने पाया कि पीपीए के संपर्क में आए चूहों में बैक्टीरियोडेट्स (जिसे पहले फर्मिक्यूट्स के नाम से जाना जाता था) और बैक्टीरियोडेट्स का अनुपात, नियंत्रण समूह के चूहों की तुलना में काफी कम था। इसका कारण बैक्टीरियोडेट्स प्रजातियों की कुल संख्या में वृद्धि थी। यह अनुपात पहले भी आंतों के संतुलन का एक महत्वपूर्ण संकेतक माना गया है, और इस अनुपात में गड़बड़ी को विभिन्न रोगों से जोड़ा गया है (टर्पिन एट अल., 2016; ताकेज़ावा एट अल., 2021; एन एट अल., 2023), जिनमें सूजन आंत्र रोग (स्टोजानोव एट अल., 2020) भी शामिल हैं। कुल मिलाकर, बैक्टीरियोडेट्स संघ की प्रजातियाँ आहार में पीपीए की बढ़ी हुई मात्रा से सबसे अधिक प्रभावित होती प्रतीत होती हैं। इसका कारण पीपीए के प्रति अधिक सहनशीलता या पीपीए को ऊर्जा स्रोत के रूप में उपयोग करने की क्षमता हो सकती है, जो कम से कम एक प्रजाति, होयल्सेला एनोसिया (हिच एट अल., 2022) के लिए सत्य सिद्ध हो चुका है। इसके अलावा, मातृ पीपीए एक्सपोजर चूहे के बच्चों की आंत को बैक्टीरियोइडेट्स उपनिवेशण के लिए अधिक संवेदनशील बनाकर भ्रूण के विकास को बढ़ा सकता है; हालांकि, हमारे अध्ययन की संरचना ने इस तरह के आकलन की अनुमति नहीं दी।
मेटाजेनोमिक सामग्री के आकलन से पीपीए चयापचय और उत्पादन से जुड़े जीनों की प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर सामने आया। पीपीए के संपर्क में आए चूहों में पीपीए उत्पादन के लिए जिम्मेदार जीनों की प्रचुरता अधिक पाई गई, जबकि पीपीए के संपर्क में न आए चूहों में पीएए चयापचय के लिए जिम्मेदार जीनों की प्रचुरता अधिक थी (चित्र 6)। ये परिणाम बताते हैं कि सूक्ष्मजीव संरचना पर पीपीए का प्रभाव केवल इसके उपयोग के कारण नहीं हो सकता है, अन्यथा पीपीए चयापचय से जुड़े जीनों की प्रचुरता पीपीए के संपर्क में आए चूहों के आंत माइक्रोबायोम में अधिक होनी चाहिए थी। एक स्पष्टीकरण यह है कि पीपीए मुख्य रूप से अपने रोगाणुरोधी प्रभावों के माध्यम से जीवाणुओं की प्रचुरता को नियंत्रित करता है, न कि जीवाणुओं द्वारा पोषक तत्व के रूप में इसके उपयोग के माध्यम से। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि पीपीए साल्मोनेला टाइफिम्यूरियम की वृद्धि को खुराक-निर्भर तरीके से रोकता है (जैकोबसन एट अल., 2018)। पीपीए की उच्च सांद्रता के संपर्क में आने से ऐसे जीवाणुओं का चयन हो सकता है जो इसके रोगाणुरोधी गुणों के प्रति प्रतिरोधी हैं और जरूरी नहीं कि वे इसका चयापचय या उत्पादन करने में सक्षम हों। उदाहरण के लिए, कई पैराबैक्टीरॉइड्स प्रजातियों ने पीपीए नमूनों में काफी अधिक प्रचुरता दिखाई, लेकिन पीपीए चयापचय या उत्पादन से संबंधित कोई जीन नहीं पाया गया (पूरक सारणी 2, 4 और 5)। इसके अलावा, किण्वन उप-उत्पाद के रूप में पीपीए उत्पादन विभिन्न जीवाणुओं में व्यापक रूप से वितरित है (गोंजालेज-गार्सिया एट अल., 2017)। उच्च जीवाणु विविधता नियंत्रण नमूनों में पीपीए चयापचय से संबंधित जीनों की उच्च प्रचुरता का कारण हो सकती है (एवेरिना एट अल., 2020)। इसके अलावा, 1332 जीनों में से केवल 27 (2.14%) जीनों को विशेष रूप से पीपीए चयापचय से जुड़े जीन होने का अनुमान लगाया गया था। पीपीए चयापचय से जुड़े कई जीन अन्य चयापचय मार्गों में भी शामिल होते हैं। यह आगे दर्शाता है कि पीपीए चयापचय में शामिल जीनों की प्रचुरता नियंत्रण नमूनों में अधिक थी; ये जीन उन मार्गों में कार्य कर सकते हैं जिनके परिणामस्वरूप पीपीए का उपयोग या उप-उत्पाद के रूप में निर्माण नहीं होता है। इस मामले में, पीपीए उत्पादन से जुड़े केवल एक जीन ने नमूना प्रकारों के बीच प्रचुरता में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। पीपीए चयापचय से जुड़े जीनों के विपरीत, पीपीए उत्पादन के लिए मार्कर जीनों का चयन इसलिए किया गया क्योंकि वे पीपीए उत्पादन के जीवाणु मार्ग में सीधे तौर पर शामिल होते हैं। पीपीए के संपर्क में आए चूहों में, सभी प्रजातियों में पीपीए की प्रचुरता और उत्पादन क्षमता में उल्लेखनीय वृद्धि पाई गई। यह इस पूर्वानुमान का समर्थन करता है कि पीपीए, पीपीए उत्पादकों का चयन करेंगे और इसलिए पीपीए उत्पादन क्षमता में वृद्धि का अनुमान लगाया जा सकता है। हालांकि, जीन की प्रचुरता का जीन अभिव्यक्ति से सीधा संबंध नहीं होता; इस प्रकार, यद्यपि नियंत्रण नमूनों में पीपीए चयापचय से जुड़े जीनों की प्रचुरता अधिक है, अभिव्यक्ति दर भिन्न हो सकती है (शि एट अल., 2014)। पीपीए-उत्पादक जीनों की व्यापकता और पीपीए उत्पादन के बीच संबंध की पुष्टि करने के लिए, पीपीए उत्पादन में शामिल जीनों की अभिव्यक्ति का अध्ययन आवश्यक है।
पीपीए और नियंत्रण मेटाजीनोम के कार्यात्मक एनोटेशन से कुछ अंतर सामने आए। जीन सामग्री के पीसीए विश्लेषण से पीपीए और नियंत्रण नमूनों के बीच अलग-अलग क्लस्टर दिखाई दिए (चित्र 5)। नमूने के भीतर क्लस्टरिंग से पता चला कि नियंत्रण जीन सामग्री अधिक विविध थी, जबकि पीपीए नमूने एक साथ क्लस्टर हुए। जीन सामग्री द्वारा क्लस्टरिंग प्रजाति संरचना द्वारा क्लस्टरिंग के समान थी। इस प्रकार, मार्ग की प्रचुरता में अंतर विशिष्ट प्रजातियों और उनमें मौजूद उपभेदों की प्रचुरता में परिवर्तन के अनुरूप हैं। पीपीए नमूनों में, दो मार्ग जिनकी प्रचुरता काफी अधिक थी, एमिनोशुगर/न्यूक्लियोटाइड शुगर चयापचय (ko:K21279) और कई लिपिड चयापचय मार्गों (ko:K00647, ko:K03801; अनुपूरक तालिका 3) से संबंधित थे। ko:K21279 से जुड़े जीन बैक्टेरॉइड्स जीनस से संबंधित माने जाते हैं, जो पीपीए नमूनों में प्रजातियों की काफी अधिक संख्या वाले जीनस में से एक है। यह एंजाइम कैप्सूलर पॉलीसेकेराइड्स को व्यक्त करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बच सकता है (वांग एट अल., 2008)। यह पीपीए के संपर्क में आए चूहों में देखे गए बैक्टीरियोइडेट्स की वृद्धि का कारण हो सकता है। यह पीपीए माइक्रोबायोम में देखी गई बढ़ी हुई फैटी एसिड संश्लेषण की पुष्टि करता है। बैक्टीरिया फैटी एसिड का उत्पादन करने के लिए FASIIko:K00647 (fabB) मार्ग का उपयोग करते हैं, जो मेजबान चयापचय मार्गों को प्रभावित कर सकता है (याओ और रॉक, 2015; जॉनसन एट अल., 2020), और लिपिड चयापचय में परिवर्तन तंत्रिका विकास में भूमिका निभा सकते हैं (यू एट अल., 2020)। पीपीए नमूनों में बढ़ी हुई प्रचुरता दिखाने वाला एक अन्य मार्ग स्टेरॉयड हार्मोन जैवसंश्लेषण (ko:K12343) था। इस बात के बढ़ते प्रमाण हैं कि आंत माइक्रोबायोटा की हार्मोन के स्तर को प्रभावित करने और हार्मोन से प्रभावित होने की क्षमता के बीच विपरीत संबंध है, जिससे उच्च स्टेरॉयड स्तरों के स्वास्थ्य पर दूरगामी परिणाम हो सकते हैं (टेटेल एट अल., 2018)।
इस अध्ययन की कुछ सीमाएँ और विचारणीय बिंदु हैं। एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि हमने जानवरों का शारीरिक मूल्यांकन नहीं किया। इसलिए, यह सीधे तौर पर निष्कर्ष निकालना संभव नहीं है कि माइक्रोबायोम में परिवर्तन किसी बीमारी से संबंधित हैं या नहीं। एक अन्य विचारणीय बिंदु यह है कि इस अध्ययन में शामिल चूहों को वही आहार दिया गया जो उनकी माताओं को दिया गया था। भविष्य के अध्ययनों से यह निर्धारित किया जा सकता है कि पीपीए युक्त आहार से पीपीए रहित आहार में परिवर्तन करने से माइक्रोबायोम पर इसके प्रभाव में सुधार होता है या नहीं। हमारे अध्ययन की एक सीमा, कई अन्य अध्ययनों की तरह, सीमित नमूना आकार है। यद्यपि वैध निष्कर्ष निकाले जा सकते हैं, लेकिन परिणामों का विश्लेषण करते समय एक बड़ा नमूना आकार अधिक सांख्यिकीय शक्ति प्रदान करेगा। हम आंत के माइक्रोबायोम में परिवर्तन और किसी भी बीमारी के बीच संबंध के बारे में निष्कर्ष निकालने में भी सतर्क हैं (याप एट अल., 2021)। आयु, लिंग और आहार सहित भ्रमित करने वाले कारक सूक्ष्मजीवों की संरचना को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं। ये कारक जटिल बीमारियों के साथ आंत के माइक्रोबायोम के संबंध के बारे में साहित्य में देखी गई विसंगतियों की व्याख्या कर सकते हैं (जॉनसन एट अल., 2019; लैगोड और नासर, 2023)। उदाहरण के लिए, बैक्टीरियोइडेट्स जीनस के सदस्यों की संख्या एएसडी से पीड़ित जानवरों और मनुष्यों में बढ़ी या घटी हुई पाई गई है (एंजेलिस एट अल., 2013; कुशक एट अल., 2017)। इसी प्रकार, सूजन आंत्र रोग से पीड़ित रोगियों में आंत की संरचना के अध्ययन में इन्हीं टैक्सोन में वृद्धि और कमी दोनों पाई गई हैं (वाल्टर्स एट अल., 2014; फोर्ब्स एट अल., 2018; उपाध्याय एट अल., 2023)। लिंग पूर्वाग्रह के प्रभाव को सीमित करने के लिए, हमने लिंगों का समान प्रतिनिधित्व सुनिश्चित करने का प्रयास किया ताकि अंतर संभवतः आहार के कारण ही हों। कार्यात्मक एनोटेशन की एक चुनौती अनावश्यक जीन अनुक्रमों को हटाना है। हमारी जीन क्लस्टरिंग विधि के लिए 95% अनुक्रम पहचान और 85% लंबाई समानता, साथ ही गलत क्लस्टरिंग को समाप्त करने के लिए 90% संरेखण कवरेज की आवश्यकता होती है। हालांकि, कुछ मामलों में, हमने समान एनोटेशन (जैसे, MUT) वाले COGs देखे (चित्र 6)। यह निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है कि क्या ये ऑर्थोलॉग अलग-अलग हैं, विशिष्ट वंशों से जुड़े हैं, या क्या यह जीन क्लस्टरिंग दृष्टिकोण की एक सीमा है। कार्यात्मक एनोटेशन की एक अन्य सीमा संभावित गलत वर्गीकरण है; जीवाणु जीन mmdA प्रोपियोनेट संश्लेषण में शामिल एक ज्ञात एंजाइम है, लेकिन KEGG इसे प्रोपियोनेट चयापचय मार्ग से नहीं जोड़ता है। इसके विपरीत, scpB और mmcD ऑर्थोलॉग संबंधित हैं। निर्दिष्ट नॉकआउट के बिना बड़ी संख्या में जीन जीन की प्रचुरता का आकलन करते समय PPA-संबंधित जीनों की पहचान करने में असमर्थता का कारण बन सकते हैं। भविष्य के अध्ययनों को मेटाट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण से लाभ होगा, जो आंत माइक्रोबायोटा की कार्यात्मक विशेषताओं की गहरी समझ प्रदान कर सकता है और जीन अभिव्यक्ति को संभावित अनुगामी प्रभावों से जोड़ सकता है। विशिष्ट न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों या सूजन आंत्र रोगों से संबंधित अध्ययनों के लिए, माइक्रोबायोम संरचना में परिवर्तनों को इन विकारों से जोड़ने के लिए जानवरों के शारीरिक और व्यवहारिक आकलन की आवश्यकता है। रोगाणु-मुक्त चूहों में आंत माइक्रोबायोम का प्रत्यारोपण करने वाले अतिरिक्त अध्ययन भी यह निर्धारित करने के लिए उपयोगी होंगे कि क्या माइक्रोबायोम रोग का चालक है या विशेषता है।
संक्षेप में, हमने यह प्रदर्शित किया कि आहार में मौजूद पीपीए आंत के माइक्रोबायोटा की संरचना को बदलने में एक कारक के रूप में कार्य करता है। पीपीए एफडीए द्वारा अनुमोदित एक परिरक्षक है जो विभिन्न खाद्य पदार्थों में व्यापक रूप से पाया जाता है और लंबे समय तक इसके संपर्क में रहने से आंत के सामान्य फ्लोरा में गड़बड़ी हो सकती है। हमने कई बैक्टीरिया की संख्या में परिवर्तन पाया, जिससे पता चलता है कि पीपीए आंत के माइक्रोबायोटा की संरचना को प्रभावित कर सकता है। माइक्रोबायोटा में परिवर्तन से कुछ चयापचय प्रक्रियाओं के स्तर में परिवर्तन हो सकता है, जिससे शरीर में ऐसे शारीरिक परिवर्तन हो सकते हैं जो मेजबान के स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है कि क्या आहार में मौजूद पीपीए का सूक्ष्मजीव संरचना पर प्रभाव डिस्बायोसिस या अन्य बीमारियों का कारण बन सकता है। यह अध्ययन भविष्य के अध्ययनों के लिए आधार तैयार करता है कि आंत की संरचना पर पीपीए का प्रभाव मानव स्वास्थ्य को कैसे प्रभावित कर सकता है।
इस अध्ययन में प्रस्तुत डेटासेट ऑनलाइन रिपॉजिटरी में उपलब्ध हैं। रिपॉजिटरी का नाम और अभिगम संख्या इस प्रकार है: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431।
इस पशु अध्ययन को सेंट्रल फ्लोरिडा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल एवं उपयोग समिति (UCF-IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था (पशु उपयोग परमिट संख्या: PROTO202000002)। यह अध्ययन स्थानीय कानूनों, विनियमों और संस्थागत आवश्यकताओं का अनुपालन करता है।
एनजी: अवधारणा निर्माण, डेटा संकलन, औपचारिक विश्लेषण, जांच, कार्यप्रणाली, सॉफ्टवेयर, दृश्यीकरण, लेखन (मूल मसौदा), लेखन (समीक्षा और संपादन)। एलए: अवधारणा निर्माण, डेटा संकलन, कार्यप्रणाली, संसाधन, लेखन (समीक्षा और संपादन)। एसएच: औपचारिक विश्लेषण, सॉफ्टवेयर, लेखन (समीक्षा और संपादन)। एसए: जांच, लेखन (समीक्षा और संपादन)। मुख्य निर्णायक: जांच, लेखन (समीक्षा और संपादन)। एसएन: अवधारणा निर्माण, परियोजना प्रशासन, संसाधन, पर्यवेक्षण, लेखन (समीक्षा और संपादन)। टीए: अवधारणा निर्माण, परियोजना प्रशासन, पर्यवेक्षण, लेखन (समीक्षा और संपादन)।
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