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कशेरुकी जीवों के विपरीत, कीटों में आमतौर पर नर-प्रधान यौन स्टेरॉयड हार्मोन नहीं पाए जाते हैं। एनोफेलेस गैम्बिया में, इकडेसोन स्टेरॉयड 20-हाइड्रॉक्सीइकडेसोन (20E) मादाओं द्वारा संश्लेषित होने पर अंडे के विकास को नियंत्रित करने के लिए विकसित हुआ प्रतीत होता है2 और नर द्वारा यौन रूप से स्थानांतरित होने पर संभोग प्रतिरोधी अवधि को प्रेरित करने के लिए3। चूंकि अंडे का विकास और संभोग आवश्यक प्रजनन लक्षण हैं, इसलिए यह समझना कि मादा एनोफेलेस मच्छर इन हार्मोनल संकेतों को कैसे एकीकृत करते हैं, नए मलेरिया नियंत्रण कार्यक्रमों के निर्माण में सहायक हो सकता है। यहां, हम बताते हैं कि ये प्रजनन कार्य इकडेसोन को सक्रिय/निष्क्रिय करने वाले एंजाइमों के एक जटिल नेटवर्क के माध्यम से विशिष्ट यौन स्टेरॉयड द्वारा नियंत्रित होते हैं। हमने एक नर-विशिष्ट ऑक्सीकृत इकडेसोन, 3-डीहाइड्रो-20E (3D20E) की पहचान की है, जो यौन स्थानांतरण और डीफॉस्फोरिलेशन द्वारा सक्रियण के बाद मादा की यौन ग्रहणशीलता को बंद करके पितृत्व की रक्षा करता है। विशेष रूप से, 3D20E स्थानांतरण ने प्रजनन जीन की अभिव्यक्ति को भी प्रेरित किया जो संभोग के दौरान अंडे के विकास को बनाए रखते हैं। प्लास्मोडियम संक्रमण, संक्रमित मादाओं के स्वास्थ्य को सुनिश्चित करता है। मादा से उत्पन्न 20E यौन प्रतिक्रिया उत्पन्न नहीं करता है, लेकिन 20E-अवरोधक काइनेज के अवरोध के बाद संभोग करने वाले जीवों को अंडे देने की अनुमति देता है। इस नर-विशिष्ट कीट स्टेरॉयड हार्मोन की पहचान और मादा की यौन ग्रहणशीलता, प्रजनन क्षमता और प्लास्मोडियम के साथ इसकी अंतःक्रिया को विनियमित करने में इसकी भूमिका मलेरिया फैलाने वाले मच्छरों की प्रजनन सफलता को कम करने की क्षमता का संकेत देती है।
मानव मलेरिया परजीवियों के एकमात्र वाहक, एनोफेलेस मच्छरों में व्यापक कीटनाशक प्रतिरोध के कारण मलेरिया के मामले और मौतें फिर से बढ़ रही हैं। इन मच्छरों की प्रजनन जीव विज्ञान नए मलेरिया नियंत्रण उपायों के लिए एक विशेष रूप से आकर्षक लक्ष्य है क्योंकि मादाएं केवल एक बार ही संभोग करती हैं; इस एकल संभोग को बाँझ बनाने से क्षेत्र में मच्छरों की आबादी को कम करने की अपार संभावना है।
पुरुषों से उच्च मात्रा में स्टेरॉयड हार्मोन प्राप्त करने के बाद महिलाएं यौन रूप से अक्षम हो जाती हैं। अध्ययनों से पता चला है कि आगे संभोग में कठिनाई का कारण 20-हाइड्रॉक्सीएकडाइसोन (20E) है, जो एक स्टेरॉयड हार्मोन है जिसे लार्वा अवस्था में मोल्टिंग चक्र के नियामक के रूप में जाना जाता है। पुरुषों द्वारा 20E को संश्लेषित और स्थानांतरित करने की क्षमता विशेष रूप से एनोफेलेस प्रजातियों में विकसित हुई है जो उपजाति सेलिया7 का हिस्सा हैं, जो अफ्रीका में वितरित है और इसमें मलेरिया के सबसे खतरनाक वाहक शामिल हैं, जिनमें एनोफेलेस गैम्बिया भी शामिल है। यह विशेष रूप से उल्लेखनीय है क्योंकि इन प्रजातियों में मादाएं प्रत्येक रक्त भोजन के बाद 20E का उत्पादन भी करती हैं, और 20E अंडजनन चक्र को संचालित करता है (संदर्भ 8 देखें)। हालांकि, इस बारे में बहुत कम जानकारी है कि मादाएं अपनी संभोग क्षमता से समझौता किए बिना एकडाइसोन के दो अलग-अलग स्रोतों (पुरुष स्थानांतरण और रक्तपान प्रेरण) से संकेतों को कैसे एकीकृत करती हैं। वास्तव में, यदि मादाओं द्वारा उत्पादित 20E यौन असहिष्णुता को ट्रिगर करता है, तो इससे बांझपन हो सकता है। कुंवारी-भोजन करने वाले व्यक्ति, इन मच्छरों में एक बहुत ही सामान्य व्यवहार है5।
एक संभावित स्पष्टीकरण यह है कि ए. गैम्बियाई नर एक संशोधित नर-विशिष्ट एक्डीसोन स्थानांतरित करते हैं, जो मादा प्रजनन पथ में एक सिग्नलिंग कैस्केड को सक्रिय करता है, जिसके परिणामस्वरूप संभोग अस्थिरता होती है। हालांकि, हालांकि कशेरुकी जीवों में एस्ट्रोजन और एंड्रोजन जैसे कई स्टेरॉयड हार्मोन होते हैं (संदर्भ 9 में समीक्षा की गई है), हमारी जानकारी के अनुसार, कीटों में एंड्रोजेनिक-प्रधान स्टेरॉयड की पहचान नहीं की गई है।
हमने संभावित संशोधक स्टेरॉयड की खोज में यौन रूप से परिपक्व ए. गैम्बिया के नर सहायक ग्रंथि (एमएजी) में स्टेरॉयड हार्मोन के भंडार का निर्धारण करने का प्रयास किया। पहले इस्तेमाल की गई कम विशिष्ट विधि के बजाय उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी को टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचपीएलसी-एमएस/एमएस) के साथ जोड़कर, हमने इस ऊतक में एक्डीसोन (ई) और 20ई का पता लगाया, जिससे पिछले परिणाम की पुष्टि हुई। हालांकि, नमूने में ऑक्सीकृत फॉस्फोरिलेटेड स्टेरॉयड की प्रधानता थी, जो सूत्र 3-डीहाइड्रो-20ई-22-फॉस्फेट (3D20E22P)12 (चित्र 1) के अनुरूप है। अन्य रूपों में 3-डीहाइड्रो-20ई (3D20E) और 20ई-22-फॉस्फेट (20E22P) शामिल हैं। 3D20E22P की एचपीएलसी-एमएस/एमएस सिग्नल तीव्रता इसके डीफॉस्फोरिलेटेड रूप, 3D20E, की तुलना में दो गुना और तीन गुना अधिक थी। E और 20E की तुलना में अधिक (चित्र 1)। हालांकि शरीर के अन्य भागों और निचले प्रजनन पथ (LRT; विस्तारित डेटा चित्र 1a) में भी। हमने नव विकसित (<1 दिन पुराने) नर और मादाओं में भी इक्डीस्टेरॉइड्स का विश्लेषण किया और केवल MAG में 3D20E और 3D20E22P का पता लगाया; E, 20E और 20E22P दोनों लिंगों में मौजूद थे (विस्तारित डेटा चित्र 1b)। ये आंकड़े बताते हैं कि A. gambiae के वयस्क नर अपने MAG में उच्च मात्रा में संशोधक हार्मोन उत्पन्न करते हैं जो मादाओं द्वारा संश्लेषित नहीं होते हैं।
4 दिन के कुंवारे नर और कुंवारी एवं संभोग कर चुकी मादाओं (0.5, 3 और 12 hpm) से MAG और मादा LRT (जिसमें अलिंद, वीर्य पुटिकाएँ और परोवेरियम शामिल हैं) को विच्छेदित किया गया। इन ऊतकों में एक्डीसोन का विश्लेषण HPLC-MS/MS द्वारा किया गया (औसत ± sem; अयुग्मित t-परीक्षण, दो-तरफा, झूठी खोज दर (FDR) सही; NS, महत्वपूर्ण नहीं; *P < 0.05, **P < 0.01)। 3D20E: 3 घंटे बनाम 0.5 घंटे, P = 0.035; 12 घंटे बनाम 3 घंटे, P = 0.0015; 12 घंटे बनाम 0.5 घंटे, P = 0.030। 3D20E22P: 3 घंटे बनाम 0.5 घंटे, P = 0.25; 12 घंटे बनाम 3 घंटे, P = 0.0032; 12 घंटे बनाम 0.5 घंटे, P = 0.015)। डेटा तीन जैविक प्रतिकृतियों से लिया गया है। रुचि के प्रत्येक एक्डीसोन के लिए शिखर क्षेत्र की गणना की गई और मच्छरों की संख्या द्वारा सामान्यीकृत किया गया। एक्डीसोन को निम्न रंगों द्वारा दर्शाया गया है: E, हरा; 20E, नारंगी; 20E22P, बैंगनी; 3D20E, नीला; 3D20E22P, गुलाबी। इनसेट में y-अक्ष पर पैमाने को बढ़ाकर निम्न एक्डीसोन स्तरों को दर्शाया गया है।
यह पता लगाने के लिए कि क्या संभोग के दौरान 3D20E22P और 3D20E स्थानांतरित होते हैं, हमने संभोग के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर मादा LRT का विच्छेदन किया। हालांकि कुंवारी मादाओं में एक्डीसोन नहीं पाया गया, हमने संभोग के तुरंत बाद (संभोग के 0.5 घंटे बाद, hpm) LRT में 3D20E22P की पर्याप्त मात्रा देखी, जो समय के साथ कम होती गई, जबकि 3D20E का स्तर काफी बढ़ गया (चित्र 1)। रासायनिक रूप से संश्लेषित 3D20E को मानक के रूप में उपयोग करते हुए, हमने निर्धारित किया कि संभोग LRT में इस स्टेरॉयड हार्मोन का स्तर 20E की तुलना में कम से कम 100 गुना अधिक था (विस्तृत डेटा तालिका 1)। इस प्रकार, 3D20E22P प्रमुख नर एक्डीसोन है जो संभोग के दौरान मादा LRT में स्थानांतरित होता है, और इसका डीफॉस्फोराइलेटेड रूप, 3D20E, संभोग के तुरंत बाद अत्यधिक प्रचुर मात्रा में हो जाता है। यह मादाओं में संभोगोत्तर एक्डीसोन की महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देता है। जीव विज्ञान।
एक नया आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) डेटासेट (चित्र 2a) तैयार करने के बाद, एक विशेष रूप से निर्मित बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन का उपयोग करके, हमने एक्डीसोन काइनेज (EcK), एक्डीसोन ऑक्सीडेज (EO), और एक्डीसोन एन्कोडिंग 20E-संशोधित फॉस्फेटेज जीन (EPP) की खोज की। प्रजनन ऊतकों में EPP की अभिव्यक्ति होती है। हमने एक संभावित EPP जीन और दो संभावित EcK जीन (EcK1 और EcK2) की पहचान की, लेकिन एक उपयुक्त संभावित EO जीन नहीं मिल पाया। विशेष रूप से, गैम्बियाई MAGs में व्यक्तिगत EPP जीन उच्च स्तर (98.9वें प्रतिशत) पर व्यक्त किए गए थे, लेकिन मादा LRTs में नहीं (चित्र 2b), जो हमारी अपेक्षाओं के विपरीत था क्योंकि इस मादा ऊतक में 3D20E22P का डीफॉस्फोराइलेशन हुआ था। इसलिए, हमारा मानना ​​है कि संभोग के दौरान नर EPP स्थानांतरित हो सकता है। वास्तव में, हमने संभोग के बाद मादा प्रोटीन को मास्क करने के लिए इन विवो स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग किया। मादा अलिंद में एमएस द्वारा पहचाना गया एक एंजाइम (चित्र 2सी और पूरक तालिका 1)। एमएजी और संभोगित (लेकिन कुंवारी नहीं) मादा एलआरटी में ईपीपी की उपस्थिति की पुष्टि विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके भी की गई थी (चित्र 2डी)।
a, प्रत्येक लिंग के प्रजनन ऊतकों में EcKs, EOs और EPPs को एन्कोड करने वाले जीनों की खोज के लिए एक विशेष रूप से निर्मित बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन। तीरों के आगे की संख्याएँ प्रत्येक चरण में नर और मादा उम्मीदवारों की संख्या दर्शाती हैं। इस विश्लेषण में एक EPP जीन (EPP) और एक EcK जीन (EcK1) की पहचान की गई है जो नर में व्यक्त होते हैं, और एक EcK जीन (EcK2) की पहचान की गई है जो दोनों लिंगों में व्यक्त होता है लेकिन इससे कोई संभावित EO जीन प्राप्त नहीं होता है। b, वर्जिन (V) और संभोग (M) Anopheles gambiae और Anopheles albicans ऊतकों में संभावित जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने वाला हीटमैप। Spca, निषेचन; MAGs, नर में सहायक ग्रंथियाँ; शरीर के अन्य भाग, जिनमें स्तन, पंख, पैर, वसा पिंड और दोनों लिंगों के आंतरिक अंग, तथा मादाओं में अंडाशय शामिल हैं। EcK2 गैम्बिया के MAG और अलिंद दोनों में उच्च स्तर पर व्यक्त होता है, जबकि EPP केवल MAG में पाया जाता है। c, 3, 12 और 24 hpm पर मादा अलिंद में नर स्खलन समूह के स्थानांतरण का प्रोटिओमिक विश्लेषण, जिसमें 67 सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन दिखाए गए हैं। सभी प्रोटीनों को लेबल (और मास्क) करने के लिए मादाओं को 15N युक्त आहार पर पाला गया था। बिना टैग वाले नरों का टैग वाली मादाओं के साथ संभोग कराया गया, और प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए 3, 12 और 24 hpm पर मादा LRT का विच्छेदन किया गया (स्खलन प्रोटीनों की पूरी सूची के लिए अनुपूरक तालिका 1 देखें)। इनसेट, इन ऊतकों के प्रोटिओमिक विश्लेषण द्वारा कुंवारे नरों के MAG में EPP, Eck1 और EcK2 का पता लगाया गया। d, संभोग की हुई मादाओं के MAG और LRT में वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा EPP का पता लगाया गया, लेकिन कुंवारी मादाओं या नर में या मादा शरीर के बाकी हिस्सों में नहीं। झिल्लियों की जांच एक साथ एंटी-एक्टिन (लोडिंग कंट्रोल) और एंटी-ईपीपी एंटीबॉडी से की गई। सभी नर कुंवारे हैं। जेल स्रोत डेटा के लिए पूरक चित्र 1 देखें। वेस्टर्न ब्लॉटिंग दो बार की गई और परिणाम समान रहे।
MAG से पृथक किए गए 3D20E22P के साथ HPLC-MS/MS द्वारा इनक्यूबेशन के बाद EPP की ecdysteroid phosphosphatase गतिविधि की पुष्टि की गई (विस्तारित डेटा चित्र 2a)। इसके अलावा, जब हमने RNA-मध्यस्थता हस्तक्षेप (RNAi) द्वारा EPP को निष्क्रिय किया, तो हमने इन नर मच्छरों के प्रजनन ऊतकों में फॉस्फेटेस गतिविधि में भारी कमी देखी (चित्र 3a), और EPP-निष्क्रिय नर मच्छरों के साथ संभोग करने वाली मादा मच्छरों में आंशिक जीन निष्क्रियता के बावजूद डीफॉस्फोराइलेटेड 3D20E का अनुपात काफी कम पाया गया (चित्र 3b) (विस्तारित डेटा चित्र 2b,c)। इसके विपरीत, हमने इन्हीं मच्छरों में 20E22P/20E अनुपात में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा, जिससे यह संकेत मिलता है कि यह एंजाइम 3D20E22P के लिए विशिष्ट है (चित्र 3b)।
a) डबल-स्ट्रैंडेड EPP RNA (dsEPP) या डबल-स्ट्रैंडेड GFP RNA (dsGFP) नियंत्रणों का उपयोग करके EPP साइलेंसिंग के कारण MAG में फॉस्फेटेज गतिविधि में कमी आई। प्रत्येक प्रतिकृति में बीस MAG पूल का उपयोग किया गया (P = 0.0046, युग्मित t-परीक्षण, दो-तरफा), जिन्हें अलग-अलग बिंदुओं द्वारा दर्शाया गया है। b) EPP-साइलेंस्ड नर के साथ संभोग करने वाली मादाओं में 3 hpm पर डीफॉस्फोराइलेटेड 3D20E का अनुपात काफी कम था (P = 0.0043, अयुग्मित t-परीक्षण, दो-तरफा), जबकि 20E स्तर अप्रभावित रहे (P = 0.063, अयुग्मित)। टी-टेस्ट, दो-तरफ़ा)। डेटा को 13, 16 और 19 मादाओं के तीन समूहों से माध्य ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया गया है। सी, ईपीपी-साइलेंस्ड नर के साथ संभोग करने वाली मादाओं में पुनः संभोग की दर काफी अधिक थी (पी = 0.0002, फिशर का सटीक परीक्षण, दो-तरफ़ा)। मादाओं को पहले उनकी संभोग स्थिति सुनिश्चित करने के लिए संभोग करने के लिए मजबूर किया गया था; दो दिन बाद, ट्रांसजेनिक शुक्राणु वाले अन्य नर मच्छरों से संपर्क कराया गया ताकि ट्रांसजीन का मात्रात्मक पीसीआर द्वारा पता लगाकर पुनः संभोग दर का आकलन किया जा सके। रक्तपान करने वाली मादा मच्छरों का ईपीपी-साइलेंस्ड नर मच्छरों से संभोग कराने पर उनकी प्रजनन क्षमता में उल्लेखनीय कमी देखी गई (पी < 0.0001; मैन-व्हिटनी परीक्षण, द्विपक्षीय) और अंडों की संख्या में थोड़ी कमी आई (पी = 0.088, मैन-व्हिटनी परीक्षण, द्विपक्षीय), जबकि प्रजनन दर अप्रभावित रही (पी = 0.94, फिशर का सटीक परीक्षण, द्विपक्षीय)। सभी पैनलों में, n जैविक रूप से स्वतंत्र मच्छर नमूनों की संख्या को दर्शाता है। एनएस, महत्वपूर्ण नहीं। *पी < 0.05, **पी < 0.01, ***पी < 0.001, ****पी < 0.001।
इसके बाद, हमने यह आकलन किया कि क्या मादाओं में संभोग प्रतिरोध उत्पन्न करने के लिए एक्डीसोन डीफॉस्फोराइलेशन महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, ईपीपी-रहित नर के साथ संभोग करने वाली मादाओं ने अतिरिक्त (ट्रांसजेनिक) नर के संपर्क में आने पर नियंत्रण मादाओं (10.4%) की तुलना में कहीं अधिक आवृत्ति (44.9%) पर पुनः संभोग किया (चित्र 3सी)। हमने प्रजनन क्षमता में भी महत्वपूर्ण कमी (चित्र 3डी, बाएँ) और इन मादाओं द्वारा दिए गए अंडों की संख्या में थोड़ी कमी (चित्र 3डी, मध्य) देखी, जबकि मादाओं द्वारा दिए गए अंडों का प्रतिशत (संभोग द्वारा मादाओं में उत्पन्न एक अन्य प्रतिक्रिया) अप्रभावित रहा (चित्र 3डी, दाएँ)। 3D20E22P के लिए ईपीपी की देखी गई विशिष्टता को देखते हुए, ये परिणाम बताते हैं कि संभोग के दौरान स्थानांतरित ईपीपी द्वारा 3D20E का सक्रियण आगे के संभोग के लिए मादा की ग्रहणशीलता को बंद करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है, एक ऐसा व्यवहार जिसे पहले 20E के यौन स्थानांतरण के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। इसलिए, यह पुरुष-विशिष्ट हार्मोन महिला प्रजनन क्षमता को भी काफी हद तक प्रभावित करता है।
इसके बाद, हमने रासायनिक रूप से संश्लेषित 3D20E (चित्र 4a-c) और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 20E का उपयोग करके यौन रूप से परिपक्व कुंवारी मादाओं में इंजेक्शन प्रयोगों में 20E और 3D20E की गतिविधियों की तुलना की। हमने पाया कि दोनों सांद्रताओं पर संभोग के प्रति मादा संवेदनशीलता को बंद करने में 3D20E, 20E की तुलना में काफी अधिक प्रभावी था (चित्र 4d)। विशेष रूप से, LRT में 3D20E के आधे शारीरिक स्तर (इंजेक्शन के बाद 1,066 pg बनाम संभोग के बाद 2,022 pg) ने प्रतिरोधी मादाओं का एक अनुपात प्रेरित किया जो 20E के शारीरिक स्तर (इंजेक्शन के बाद 361 pg) की तुलना में 20 गुना अधिक था, जो कि उच्चतम सांद्रता 18 pg संभोग के बाद इंजेक्शन के 24 घंटे बाद था; (विस्तृत डेटा तालिका 1)। यह परिणाम इस धारणा के अनुरूप है कि 20E का यौन स्थानांतरण संभोग प्रतिरोध अवधि का कारण नहीं बनता है, और आगे माता-पिता-बच्चे के संबंध को सुनिश्चित करने में 3D20E को एक प्रमुख कारक के रूप में इंगित करता है। कुंवारी मादाओं में अंडा देने के परीक्षणों में 3D20E, 20E की तुलना में काफी अधिक सक्रिय था (चित्र 4e), यह दर्शाता है कि आंशिक EPP साइलेंसिंग के बाद हमने जो सामान्य अंडा देने की दर देखी, वह संभोग-प्रेरित मादा कारकों द्वारा उत्पादित अवशिष्ट 3D20E गतिविधि की उपस्थिति के कारण थी।
(a,b) 20E से रासायनिक रूप से संश्लेषित 3D20E (a) बहुत उच्च रूपांतरण/दक्षता के साथ (डेटा तीन स्वतंत्र संश्लेषण प्रतिक्रियाओं से माध्य ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया गया है) (b)।c, द्रव्यमान स्पेक्ट्रम (निचला आधा) संभोगित मादा LRT (ऊपरी आधा) में पाए जाने वाले एक्डीसोन से बिल्कुल मेल खाता है।d, 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; फिशर का सटीक परीक्षण, दो-तरफा) और 10% इथेनॉल (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; फिशर का सटीक परीक्षण, दो-तरफा) की तुलना में, जबकि 20E केवल उच्च खुराक पर नियंत्रण से काफी अधिक था (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; फिशर का सटीक परीक्षण, दो-तरफ़ा)। 3D20E इंजेक्शन ने 10% इथेनॉल नियंत्रणों की तुलना में कुंवारी मादाओं में काफी अधिक प्रजनन दर प्रेरित की (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; फिशर का सटीक परीक्षण, दो-तरफ़ा), जबकि 20E की तुलना नियंत्रणों से केवल उच्च खुराकों पर की गई (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; फिशर का सटीक परीक्षण, दो-तरफ़ा)। 3D20E ने उच्च खुराकों पर 20E की तुलना में काफी अधिक प्रजनन दर प्रेरित की (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; फिशर का सटीक परीक्षण, दो-तरफ़ा)। सभी पैनलों में, n जैविक रूप से स्वतंत्र मच्छरों की संख्या को दर्शाता है। नमूने.NS, महत्वपूर्ण नहीं.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. डेटा तीन प्रतिकृतियों से हैं.
पिछले अध्ययनों में, हमने पाया कि स्टेरॉयड हार्मोन का यौन स्थानांतरण MISO (मेटिंग-इंड्यूस्ड स्टिम्युलेटर ऑफ ओोजेनेसिस 11) की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जो एक मादा प्रजनन जीन है और ए. गैम्बियाई मादाओं को पी. फाल्सीपेरम संक्रमण से बचाता है। मलेरिया-ग्रस्त क्षेत्रों में एनोफेलेस की प्रजनन क्षमता के लिए MISO के महत्व को देखते हुए, हमने यह निर्धारित करने का निर्णय लिया कि कौन सा हार्मोन 3D20E या 20E इस जीन की अभिव्यक्ति को ट्रिगर करता है। हमने पाया कि जबकि 20E इंजेक्शन विशेष रूप से या अधिक शक्तिशाली रूप से कुछ न्यूक्लियर हार्मोन रिसेप्टर्स (HR), जैसे HR3 और HR4, और विशिष्ट डाउनस्ट्रीम स्टेरॉयड लक्ष्यों, जैसे योल्कोजेनिक जीन Vg14, 15, 16 को प्रेरित करता है, MISO को 3D20E द्वारा अधिक मजबूती से प्रेरित किया गया (विस्तारित डेटा चित्र 3)। इस प्रकार, इस एंड्रोजेनिक स्टेरॉयड हार्मोन का यौन स्थानांतरण उन तंत्रों को प्रेरित करता प्रतीत होता है जो मादाओं को परजीवी संक्रमण से होने वाले नुकसान से बचाते हैं। संक्रमण। इसके अलावा, 3D20E ई रिसेप्टर EcR के दोनों आइसोफॉर्म को अलग-अलग तरह से प्रभावित करता है, EcR-A को प्रेरित करता है और EcR-B को दबाता है, और HPX15 सहित अन्य संभोग-प्रेरक जीनों को अधिक मजबूती से सक्रिय करता है, जो मादा प्रजनन क्षमता को प्रभावित करता है। यह EPP-साइलेंस्ड नर के साथ संभोग करने वाली मादाओं में देखी गई महत्वपूर्ण बांझपन की व्याख्या कर सकता है (विस्तृत डेटा चित्र 3)। ये डेटा दो एक्डीसोन हार्मोन द्वारा अधिमानतः सक्रिय डाउनस्ट्रीम मार्गों के अस्तित्व का सुझाव देते हैं जो लिंग-विशिष्ट कार्य को रेखांकित कर सकते हैं।
इसके बाद, हमने अपने बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन में पहचाने गए दो EcK जीनों के कार्य का परीक्षण किया। EcK1 या EcK2 को साइलेंस करने से नर जीवों में महत्वपूर्ण मृत्यु दर देखी गई (विस्तारित डेटा चित्र 4a), जिससे पता चलता है कि एक्डीसोन फॉस्फोराइलेशन, और इस प्रकार निष्क्रियता, जीवित रहने के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि EcK2, EcK1 की तुलना में उच्च स्तर पर व्यक्त किया गया था और प्रोटिओमिक्स द्वारा MAGs में इसका पता लगाया गया था (चित्र 2b,c और पूरक तालिका 2), हमने इसे 20E के साथ इनक्यूबेट करके इसकी एक्डीस्टेरॉइड काइनेज गतिविधि को मान्य किया, जिसके परिणामस्वरूप फॉस्फोराइलेशन 20E22P (विस्तारित डेटा चित्र 2b) हुआ। 3D20E को सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करने पर, हम फॉस्फोराइलेटेड उत्पाद 3D20E22P का पता लगाने में असमर्थ रहे (विस्तारित डेटा चित्र 4c), जिससे पता चलता है कि 3D20E के बजाय 20E, फॉस्फोराइलेशन का पसंदीदा लक्ष्य हो सकता है। ईसीके2.
हमारे RNA-seq विश्लेषण के अनुसार, EcK2 कुंवारी मादाओं के LRT में भी उच्च स्तर पर व्यक्त होता था, जहाँ संभोग के बाद यह निष्क्रिय हो जाता था (चित्र 2b)। हमने इन आंकड़ों की पुष्टि की और निर्धारित किया कि EcK2 अभिव्यक्ति रक्तपान से प्रभावित नहीं होती है (विस्तारित डेटा चित्र 5a)। अपने प्रारंभिक MS प्रयोगों को आगे बढ़ाते हुए, हमने निर्धारित किया कि 20E22P का शिखर 20E के शिखर से निकटता से संबंधित था (रक्तपान के 22-26 घंटे बाद; विस्तारित डेटा चित्र 5b)। कुंवारी मादाओं में EcK2 को निष्क्रिय करने से रक्तपान के 26 घंटे बाद 20E और 20E22P के सापेक्ष अनुपात में 3 गुना वृद्धि हुई (विस्तारित डेटा चित्र 2c और 5c), जिससे पुष्टि होती है कि EcK2 मादाओं में 20E को भी फॉस्फोराइलेट करता है। विशेष रूप से, EcK2-रहित कुंवारी मादाओं ने पूर्ण यौन ग्रहणशीलता बनाए रखी (विस्तारित डेटा चित्र 5d,e), जो आगे यह दर्शाता है कि मादा उत्पादन 20E की उपस्थिति संभोग प्रतिरोध अवधि को प्रेरित नहीं करती है। हालांकि, इन मादाओं में नियंत्रण समूह की तुलना में अंडे देने की दर में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई, जिसमें 30% से अधिक कुंवारी मादाओं ने अंडे दिए (विस्तारित डेटा चित्र 5f)। यदि रक्तपान के बाद डबल-स्ट्रैंडेड Eck2 RNA (dsEcK2) के इंजेक्शन दिए गए, तो प्रजनन नहीं हुआ, जिस बिंदु पर रक्तपान के कारण 20E का शिखर कम हो गया था। कुल मिलाकर, ये परिणाम एक ऐसे मॉडल का समर्थन करते हैं कि रक्त चूसने के बाद उत्पादित 20E प्रजनन को प्रेरित कर सकता है, लेकिन केवल तभी जब प्रजनन अवरोध (EcK2 और संभवतः अन्य कारक) संभोग द्वारा बंद कर दिया जाता है। न तो 20E और न ही 3D20E इंजेक्शन ने कुंवारी मादाओं में EcK2 अभिव्यक्ति को बाधित किया (विस्तारित डेटा चित्र 5g), यह दर्शाता है कि अन्य कारक इस किनेज के अवरोध में मध्यस्थता करते हैं। हालांकि, रक्तपान के बाद 20E का स्तर संभोग असुविधा को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं था, लेकिन यौन रूप से स्थानांतरित उच्च मात्रा में Eck2 RNA द्वारा प्रभावी रूप से प्रेरित किया गया था। 3डी20ई.
हमारे परिणाम ए. गैम्बिया की प्रजनन सफलता को नियंत्रित करने वाले तंत्रों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं। एक मॉडल सामने आया है जिसमें नर 3D20E के उच्च स्तर का संश्लेषण करने के लिए विकसित हुए हैं, जो एक नर-विशिष्ट संशोधित एक्डीसोन है जो मादाओं को आगे संभोग के प्रति असंवेदनशील बनाकर पितृत्व सुनिश्चित करता है। साथ ही, इन मलेरिया वाहकों ने नर-विशिष्ट ईपीपी के यौन स्थानांतरण के जवाब में मादाओं में 3D20E को सक्रिय करने के लिए एक कुशल प्रणाली भी विकसित की है। हमारी जानकारी के अनुसार, यह कीटों में एक अद्वितीय और महत्वपूर्ण कार्य करने वाली नर- और मादा-प्रधान स्टेरॉयड हार्मोन प्रणाली का पहला उदाहरण है। नर-विशिष्ट एक्डीसोन कार्य की परिकल्पना की गई है लेकिन इसे निश्चित रूप से प्रदर्शित नहीं किया गया है। उदाहरण के लिए, एक काफी हद तक अस्वीकृत परिकल्पना 18 यह है कि ये कार्य 20E अग्रदूत E1 द्वारा किए जा सकते हैं। यह सर्वविदित है कि ड्रोसोफिला में, मोनोएंड्री छोटे सेक्स पेप्टाइड्स 19,20 के यौन स्थानांतरण द्वारा ट्रिगर होती है जो विशिष्ट सेक्स के माध्यम से मादा प्रजनन पथ को तंत्रिका प्रदान करने वाले न्यूरॉन्स के साथ परस्पर क्रिया करते हैं। पेप्टाइड रिसेप्टर्स21,22. ए. गैम्बिया मादाओं में 3डी20ई द्वारा नियंत्रित डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड को निर्धारित करने और यह निर्धारित करने के लिए आगे काम की आवश्यकता है कि क्या ये कैस्केड मच्छरों और ड्रोसोफिला के बीच संरक्षित किए जा सकते हैं।
हमारे अध्ययन में मादा प्रजनन क्षमता और व्यवहार पर 3D20E की महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, 3D20E संश्लेषण और सक्रियण की ओर ले जाने वाले मार्ग भविष्य में मच्छर नियंत्रण रणनीतियों के लिए नए अवसर प्रदान करते हैं, जैसे कि बाँझ कीट प्रौद्योगिकी रणनीतियों में प्रतिस्पर्धी बाँझ नर का उत्पादन, जंगली रिलीज के लिए उपयोग या कुंवारी प्रजनन में 3D20E की नकल करना। 3D20E का नर-विशिष्ट कार्य संभवतः तब विकसित हुआ होगा जब A. gambiae और अन्य Cellia प्रजातियों ने अपने वीर्य को संभोग प्लग में जमा करने की क्षमता प्राप्त कर ली, क्योंकि यह बड़ी संख्या में हार्मोन और हार्मोन-सक्रिय एंजाइमों के कुशल स्थानांतरण की अनुमति देता है। बदले में, एकलिंगी क्रिया को लागू करने वाला 3D20E विकास मादाओं (MISO की उच्च अभिव्यक्ति के माध्यम से) को उच्च मलेरिया प्रसार वाले क्षेत्रों में अपनी प्रजनन क्षमता को बढ़ावा देने के लिए एक तंत्र प्रदान करता है, जो अप्रत्यक्ष रूप से प्लास्मोडियम संचरण में योगदान देता है। यह देखते हुए कि मादा 20E को मादा एनोफेलेस मच्छरों में P. falciparum के अस्तित्व और विकास पर गहरा प्रभाव दिखाया गया है,24 नर और मादा दोनों स्टेरॉयड हार्मोन अब मार्ग मच्छर-परजीवी अंतःक्रियाओं के प्रमुख पहलू बन गए हैं।
ए. गैम्बियाई जी3 स्ट्रेन को मानक कीट परिस्थितियों (26-28 डिग्री सेल्सियस, 65-80% सापेक्ष आर्द्रता, 12:12 घंटे प्रकाश/अंधेरा फोटोपेरियोड) में पाला गया। लार्वा को मछली के पाउडर वाले भोजन (टेट्रामिन ट्रॉपिकल फ्लेक्स, कोई पेलेट्स और टेट्रा पॉन्ड स्टिक्स को 7:7:2 के अनुपात में) से खिलाया गया। वयस्क मच्छरों को 10% डेक्सट्रोज घोल और साप्ताहिक रूप से मानव रक्त (अध्ययन के लिए रक्त घटक) दिया गया। प्यूपा अवस्था में माइक्रोस्कोपी द्वारा सिरों की जांच करने के बाद नर और मादा को अलग करके कुंवारे मच्छर प्राप्त किए गए। डीएसरेड ट्रांसजीन वाले नर मच्छरों का वर्णन पहले किया जा चुका है।
पूर्व में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार जबरन संभोग प्रयोग किए गए। प्राकृतिक संभोग के लिए, 4 दिन की कुंवारी मादाओं को यौन रूप से परिपक्व कुंवारे नरों के साथ 1:3 के अनुपात में दो रातों के लिए रखा गया। उन प्रयोगों के लिए जिनमें नरों को dsEPP का इंजेक्शन दिया गया था, सह-पिंजरे में रखने का समय इंजेक्शन के बाद 3-4 दिनों के साथ मेल खाता था, जब फॉस्फेटेज गतिविधि अधिकतम रूप से शांत हो गई थी (विस्तृत डेटा चित्र 2b)।
मच्छर के ऊतकों, बचे हुए मृत शरीरों (शरीर के शेष भाग), या पूरे शरीर को 100% मेथनॉल में विच्छेदित किया गया और बीडर (2 मिमी कांच के मनके, 2,400 आरपीएम, 90 सेकंड) से समरूपीकृत किया गया। ऊतक की मात्रा और मेथनॉल की मात्रा इस प्रकार थी: शरीर का शेष भाग, 1,000 µl में 50; MAG, 50–100 80 µl में; मादा LRT, 25–50 80 µl में। अवक्षेप को मेथनॉल की समान मात्रा के साथ दूसरे मेथनॉल निष्कर्षण के लिए उपयोग किया गया। कोशिका मलबे को अपकेंद्रीकरण द्वारा हटा दिया गया। दोनों निष्कर्षणों से प्राप्त मेथनॉल को मिलाया गया और नाइट्रोजन प्रवाह के तहत सुखाया गया, फिर पानी में 80% मेथनॉल की निम्नलिखित मात्राओं में पुनः निलंबित किया गया: शरीर का शेष भाग, 50 µl; MAG और मादा LRT, 30 µl।
नमूनों का विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमीटर (ID-X, थर्मो फिशर) पर किया गया, जो LC उपकरण (वैन्क्विश, थर्मो फिशर) से जुड़ा हुआ था। 5 µl नमूने को 25 °C पर रखे गए 3 µm, 100 × 4.6 mm कॉलम (इंस्पायर C8, डिकमा) पर इंजेक्ट किया गया। LC के लिए मोबाइल चरण A (जल, 0.1% फॉर्मिक एसिड) और B (एसीटोनिट्राइल, 0.1% फॉर्मिक एसिड) थे। LC ग्रेडिएंट इस प्रकार था: 1 मिनट के लिए 5% B, फिर 11 मिनट में 100% B तक बढ़ाया गया। 100% पर 8 मिनट के बाद, कॉलम को 4 मिनट के लिए 5% B पर पुनः संतुलित किया गया। प्रवाह दर 0.3 ml min⁻¹ थी। MS स्रोत में आयनीकरण सकारात्मक और नकारात्मक मोड में गर्म इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण द्वारा किया जाता है।
मास स्पेक्ट्रोमीटर पूर्ण एमएस मोड में 60,000 रिज़ॉल्यूशन पर 350 से 680 के एम/जेड रेंज में डेटा मापता है। एमएस/एमएस डेटा [एम + एच]+ (सभी लक्ष्य), [एम - एच2ओ + एच]+ (सभी लक्ष्य), और [एम - एच]- (फॉस्फोरिलेटेड लक्ष्य) पर प्राप्त किया गया था। एमएस/एमएस डेटा का उपयोग उन लक्ष्यों के एक्डीसोन गुणों की पुष्टि करने के लिए किया गया था जिनके लिए कोई मानक उपलब्ध नहीं था। गैर-लक्षित एक्डीस्टेरॉइड्स की पहचान करने के लिए, 15% से अधिक सापेक्ष प्रचुरता वाले सभी एचपीएलसी पीक के लिए एमएस/एमएस डेटा का विश्लेषण किया गया था। शुद्ध मानकों (20ई, 3डी20ई) से बनाए गए मानक वक्रों का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी ताकि एक विशिष्ट नमूने (अन्य सभी लक्ष्य) की पूर्ण मात्रा या तनुकरण की गणना की जा सके और एक पुरुष में पाई गई मात्रा के साथ उनकी समतुल्यता की गणना की जा सके। 3डी20ई के लिए, निम्नलिखित एडक्ट्स के योग का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी: [एम + टीएफए]-, [एम + सीओओएच]-, [एम + ना]+। [M + Cl]-, [M + NO3]- डेटा को ट्रेसफाइंडर (संस्करण 4.1) का उपयोग करके निकाला और मात्रा निर्धारित किया गया। MS/MS डेटा का विश्लेषण Xcalibur (संस्करण 4.4) का उपयोग करके किया गया। E, 20E और 3D20E के MS स्पेक्ट्रा की तुलना संबंधित मानकों से की गई। 3D20E22P का विश्लेषण गिरार्ड अभिकर्मक के साथ व्युत्पन्न करके किया गया। 20E22P का विश्लेषण m/z अनुपात द्वारा किया गया।
3D20E22P को MAG से शुद्ध किया गया। शुद्धिकरण प्रक्रिया विश्लेषणात्मक पैमाने पर अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ (Acquity, Waters) का उपयोग करके क्वाड्रुपोल मास-बेस्ड डिटेक्टर (QDa, Acquity, Waters) के साथ HPLC-MS/MS विश्लेषण के समान LC स्थितियों के तहत की गई। अंश संग्रह तब शुरू हुआ जब 3D20E22P के अनुरूप m/z को पहले से निर्धारित प्रतिधारण समय पर पता लगाया गया। इसके बाद, निकाले गए यौगिकों की शुद्धता की जाँच HPLC-MS/MS द्वारा ऊपर वर्णित विधि के अनुसार की गई।
निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, TRI अभिकर्मक (थर्मो फिशर) का उपयोग करके 10-12 प्रजनन ऊतकों या शरीर के अन्य भागों (सिर रहित) से कुल RNA निकाला गया। RNA को TURBO DNase (थर्मो फिशर) से उपचारित किया गया। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, मोलोनी म्यूरिन ल्यूकेमिया वायरस रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (M-MLV RT; थर्मो फिशर) का उपयोग करके cDNA का संश्लेषण किया गया। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक PCR (RT-qPCR; विस्तारित डेटा तालिका 2) के लिए प्राइमर पहले प्रकाशित24 किए गए थे या प्राइमर-BLAST26 का उपयोग करके डिज़ाइन किए गए थे, जिसमें 70-150 bp आकार के और एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनों को कवर करने वाले उत्पादों को प्राथमिकता दी गई थी या प्राइमर जोड़ी प्राइमर अलग-अलग एक्सॉन को कवर करते थे। RT-qPCR के लिए तीन से चार जैविक प्रतिकृतियों से cDNA नमूनों को पानी में चार गुना पतला किया गया। मात्रा निर्धारण 15 µl प्रतिकृति प्रतिक्रियाओं में किया गया जिसमें 1× PowerUp SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर), प्राइमर और 5 µl पतला किया हुआ मिश्रण शामिल था। सीडीएनए. प्रतिक्रियाएँ क्वांटस्टूडियो 6 प्रो रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर) पर चलाई गईं और डिज़ाइन और विश्लेषण (संस्करण 2.4.3) का उपयोग करके डेटा एकत्र और विश्लेषण किया गया। जैसा कि इस अध्ययन में प्रदर्शित किया गया है, सापेक्ष मात्रा को राइबोसोमल जीन RpL19 (AGAP004422) के लिए सामान्यीकृत किया गया था, जिसकी अभिव्यक्ति रक्त खिलाने 27 या संभोग 3 के साथ महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदली।
आरएनए की गुणवत्ता की जांच एजिलेंट बायोएनालाइजर 2100 (एजिलेंट) का उपयोग करके की गई। इलुमिना पेयर्ड-एंड लाइब्रेरी को एमआईटी और हार्वर्ड के ब्रॉड इंस्टीट्यूट में तैयार और रन किया गया। सीक्वेंसिंग रीड्स को डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ HISAT2 (संस्करण 2.0.5) का उपयोग करके ए. गैम्बिया जीनोम (PEST स्ट्रेन, संस्करण 4.12) के साथ संरेखित किया गया। मैपिंग गुणवत्ता (MAPQ) स्कोर <30 वाले रीड्स को सैमटूल्स (संस्करण 1.3.1) का उपयोग करके हटा दिया गया। जीनों से मैप किए गए रीड्स की संख्या को डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ htseq-count (संस्करण 0.9.1) का उपयोग करके गिना गया। सामान्यीकृत रीड काउंट की गणना की गई और R (संस्करण 4.0.3) में DESeq2 पैकेज (संस्करण 1.28.1) का उपयोग करके विभेदक जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया।
एक्डीसोन-संशोधित जीन उम्मीदवारों की पहचान सबसे पहले PSI-BLAST एल्गोरिदम (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) का उपयोग करके A. gambiae जीनोम में खोज करके की गई, जिसमें निम्नलिखित क्वेरी प्रोटीन अनुक्रमों के साथ डिफ़ॉल्ट मान पैरामीटर का उपयोग किया गया: Bombyx mori (एक्सेशन नंबर NP_001038956.1), Musca domestica (एक्सेशन नंबर XP_005182020.1, XP_005175332.1 और XP_011294434.1) और Microplitis demolitor (एक्सेशन नंबर XP_008552646.1 और XP_008552645.1) से EcK, B. mori (एक्सेशन नंबर NP_001036900) से, Drosophila melanogaster (एक्सेशन नंबर) से। एनपी_651202), एपिस मेलिफेरा (एक्सेशन नंबर XP_394838) और एसीर्थोसिफॉन पिसम (एक्सेशन नंबर XP_001947166); और बी. मोरी (एक्सेशन नंबर XP_001947166) एनपी_001177919.1 और एनपी_001243996.1) से ईपीपी और डी. मेलानोगास्टर (एक्सेशन नंबर एनपी_572986.1) का ईओ (चरण 1)। इसके बाद, गैम्बिया में प्रजनन ऊतक (मादा एलआरटी या एमएजी) में उच्च mRNA अभिव्यक्ति (>100 खंड/किलोबेस एक्सॉन प्रति मिलियन मैप किए गए रीड्स (एफपीकेएम) या >85%) के आधार पर हिट्स को फ़िल्टर करें (चरण 2)। विशिष्टता में सुधार के लिए, हमने उन संभावित एंजाइमों का चयन किया जो ए. एल्बिमानस के प्रजनन ऊतक में भी व्यक्त होते हैं, जो कि एनोफेल्स प्रजाति है और संभोग के दौरान एक्डीसोन का संश्लेषण या स्थानांतरण नहीं करती है। संभावित जीनों को ए. एल्बिमानस के प्रजनन ऊतक में कम अभिव्यक्ति (<100 FPKM या <85वें प्रतिशतक) के आधार पर फ़िल्टर किया गया (चरण 3)। अंतिम फ़िल्टर (चरण 4) के रूप में, संभावित जीनों को निम्नलिखित में से कम से कम एक शर्त को पूरा करना आवश्यक है: (1) विभेदक रूप से व्यक्त जीनों के विश्लेषण के अनुसार संभोग के बाद महत्वपूर्ण रूप से अप-विनियमित (P < 0.05) और (2) गैर-प्रजनन ऊतकों में (< 85% या <100 FPKM)।
संपूर्ण जीव समस्थानिक लेबलिंग प्राप्त करने के लिए हमने पूर्व वर्णित विधियों 28,29,30 में संशोधन किया। संक्षेप में, जंगली प्रकार के सैकरोमाइसिस सेरेविसी टाइप II (YSC2, सिग्मा) का परीक्षण यीस्ट नाइट्रोजन आधारित (BD Difco, DF0335) माध्यम में किया गया, जिसमें (वजन/आयतन) 2% ग्लूकोज (G7528, सिग्मा), 1.7% अमीनो अम्ल-मुक्त और अमोनियम सल्फेट (संवर्धन माध्यम) और 5% 15N अमोनियम सल्फेट (NLM-713, >99%, कैम्ब्रिज आइसोटोप लेबोरेटरीज) नाइट्रोजन के एकमात्र स्रोत के रूप में मौजूद थे। सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा यीस्ट को पुनर्प्राप्त किया गया और मच्छर के लार्वा को प्यूपा बनने तक इच्छानुसार भोजन दिया गया। चौथे चरण की मृत्यु दर को रोकने के लिए मछली के भोजन (0.5 मिलीग्राम प्रति 300 लार्वा) का पूरक दिया गया। संभोग के दौरान स्थानांतरित नर प्रोटीओम का विश्लेषण करने के लिए केवल मादाओं का उपयोग अचिह्नित नर के साथ संभोग प्रयोगों में किया गया।
4-6 दिन पुरानी 15N-टैग वाली कुंवारी मादाओं को समान आयु के बिना टैग वाले कुंवारे नरों के साथ संभोग कराया गया। सफल संभोग की पुष्टि एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत संभोग प्लग का पता लगाकर की गई। 3, 12 और 24 hpm पर, 45-55 संभोगित मादाओं के अलिंद को 50 µl अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर (pH 7.8) में विच्छेदित किया गया और मूसल से समरूपीकृत किया गया। समरूप को सेंट्रीफ्यूज किया गया और सुपरनेटेंट को 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में 0.1% रैपिगेस्ट (186001860, वाटर्स) के 50 µl के साथ मिलाया गया। प्रत्येक नमूने से सुपरनेटेंट और पेलेट को सूखी बर्फ पर तुरंत जमा दिया गया और रात भर में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में मैककॉस प्रयोगशाला में भेज दिया गया, जहां LC-MS/MS के लिए नमूना तैयार किया गया। पेलेट को 50 µl अमोनियम बाइकार्बोनेट में पुनः निलंबित करें। 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में 0.1% रैपिजेस्ट के µl को वाटर बाथ में सोनिकेट किया गया। पेलेट और सुपरनेटेंट की प्रोटीन सांद्रता को बीसीए परख द्वारा मापा गया। नमूनों को 5 mM डाइथियोथ्रिटोल (DTT; सिग्मा) से अपचयित किया गया, 15 mM आयोडोएसिटामाइड (सिग्मा) से एल्काइलेटेड किया गया और 37 °C (1:0:50) पर 1 घंटे के लिए ट्रिप्सिनाइजेशन (ट्रिप्सिन:सब्सट्रेट अनुपात) के साथ इनक्यूबेट किया गया। 200 mM HCl मिलाकर रैपिजेस्ट को लाइस किया गया, इसके बाद 37 °C पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया और मलबे को हटाने के लिए 4 °C पर 14,000 rpm पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। नमूनों को ड्यूल-मोड सॉलिड-फेज एक्सट्रैक्शन (ओएसिस MCX कार्ट्रिज, वाटर्स) द्वारा धोया गया और 0.1% में पुनः सस्पेंड किया गया। अंतिम प्रोटीन सांद्रता 0.33 µg µl-1 के लिए फॉर्मिक एसिड का उपयोग किया गया। इसी प्रकार, असंबद्ध MAG प्रोटीओम का विश्लेषण कुंवारे पुरुषों से किया गया। प्रत्येक नमूने के लिए दो विश्लेषणात्मक प्रतिकृतियों का विश्लेषण किया गया। इसके बाद, प्रत्येक के 1 µg का विश्लेषण 25-cm फ्यूज्ड सिलिका 75-μm कॉलम का उपयोग करके किया गया, जिसमें 4-cm फ्यूज्ड सिलिका Kasil1 (PQ) फ्रिट ट्रैप था, जो Jupiter C12 रिवर्स-फेज रेजिन (Phenomenex) से भरा हुआ था, और 180 मिनट की लिक्विड क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया गया। नमूना डाइजेस्ट – एमएस/एमएस को क्यू-एक्जेक्टिव एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर) पर नैनोएक्विटी यूपीएलसी सिस्टम (वाटर्स) के साथ चलाया गया। प्रत्येक रन के लिए उत्पन्न डेटा-संबंधित अधिग्रहण डेटा को प्रोटियोविज़ार्ड (संस्करण 3.0.20287) का उपयोग करके और कॉमेट31 (संस्करण 3.2) का उपयोग करके एनोफेल्स गैम्बिया (वेक्टरबेस संस्करण 54), एनोफेल्स कोलुज़ी से प्रोटीन अनुक्रमों वाले एफएएसटीए डेटाबेस के विरुद्ध mzML प्रारूप में परिवर्तित किया गया। माली-एनआईएच (वेक्टरबेस संस्करण 54), सैकरोमाइसिस सेरेविसिया (यूनिप्रोट, मार्च 2021), ए. गैम्बिया आरएनए-सीक्वेंसिंग और ज्ञात मानव संदूषकों के तीन-फ्रेम अनुवादों पर खोज की गई। पेप्टाइड मैप-मैच्ड एफडीआर को 0.01 की सीमा के साथ परकोलेटर32 (संस्करण 3.05) का उपयोग करके निर्धारित किया गया, और प्रोटीन पार्सिमोनी का उपयोग करके पेप्टाइड्स को प्रोटीन पहचान में संयोजित किया गया। लाइमलाइट33 (संस्करण 2.2.0) में, प्रत्येक रन में प्रत्येक प्रोटीन के लिए गणना किए गए सामान्यीकृत स्पेक्ट्रल प्रचुरता कारक (एनएसएएफ) का उपयोग करके सापेक्ष प्रोटीन प्रचुरता का अनुमान लगाया गया था, जैसा कि पहले वर्णित किया गया है। प्रत्येक प्रोटीन के सापेक्ष एनएसएएफ को दो अलग-अलग जैविक प्रतिकृतियों के नमूनों में औसत किया गया था। 15N लेबलिंग ने मादा प्रोटीओम को सफलतापूर्वक छिपा दिया, हालांकि लेबल किए गए वर्जिन से थोड़ी मात्रा में बिना लेबल वाला प्रोटीन पाया जा सकता था। हमने केवल तकनीकी रन में मादा कच्चे नमूनों में नर प्रोटीन की कमी (1-5 स्पेक्ट्रा) का पता लगाया, जहां कच्चे नमूनों को नर/मैथुन नमूनों के बाद चलाया गया था, एचपीएलसी "कैरी ओवर" के परिणामस्वरूप। लेबल किए गए वर्जिन से 'संदूषक' के रूप में पाए जाने वाले कभी-कभार प्रोटीन अनुपूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।
जेनस्क्रिप्ट में दो एंटीजेनिक पेप्टाइड, QTTDRVAPAPDQQQ (आइसोटाइप PA के अंतर्गत) और MESDGTTPSGDSEQ (आइसोटाइप PA और PB के अंतर्गत) मौजूद थे। इन दोनों पेप्टाइडों को मिलाकर, वाहक प्रोटीन KLH से संयुग्मित किया गया और न्यूजीलैंड खरगोशों में इंजेक्ट किया गया। चौथे इंजेक्शन के बाद खरगोशों को मार दिया गया और एफिनिटी प्यूरिफिकेशन द्वारा कुल IgG को पृथक किया गया। सबसे अधिक EPP-विशिष्ट खरगोश से प्राप्त IgG का उपयोग आगे वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए किया गया।
वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए, 4 दिन के कुंवारे नर मच्छरों और कुंवारी या जबरन संभोग कराई गई मादा मच्छरों (<10 संभोग के बाद) से प्राप्त MAG (n = 10, जहाँ n जैविक रूप से स्वतंत्र मच्छर नमूनों की संख्या को दर्शाता है) और मादा LRT (n = 30) नमूनों में प्रोटीन निष्कर्षण बफर (50 mM ट्रिस, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% सोडियम डीऑक्सीकोलेट; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (रोश)) को अलग-अलग मिलाया गया। नमूनों को विच्छेदन के तुरंत बाद बीडर (2 मिमी कांच के मनके, 2,400 rpm, 90 सेकंड) से समरूपीकृत किया गया। 4 °C पर 20,000 g पर अपकेंद्रीकरण द्वारा अघुलनशील मलबे को हटा दिया गया। प्रोटीनों की मात्रा ब्रैडफोर्ड परख (बायो-रैड) द्वारा निर्धारित की गई। फिर, 20 µg MAG प्रोटीन, 40 µg एलआरटी प्रोटीन के 20 µg और अवशिष्ट बल्क प्रोटीन को एमओपीएस बफर का उपयोग करके 10% बिस्-ट्रिस नुपेज द्वारा विकृत और पृथक किया गया। प्रोटीन को आईब्लॉट2 ट्रांसफर सिस्टम (थर्मो फिशर) का उपयोग करके पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड झिल्ली पर स्थानांतरित किया गया। झिल्लियों को 1× पीबीएस-टी (पीबीएस में 0.1% ट्विन-20) में दो बार धोया गया और फिर 22°C पर 1 घंटे के लिए ओडिसी ब्लॉकिंग बफर (ली-कोर) में अवरुद्ध किया गया। झिल्लियों को 4°C पर रात भर कस्टम खरगोश एंटी-ईपीपी पॉलीक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी (ब्लॉकिंग बफर में 1:700) और चूहे एंटी-एक्टिन मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी MAC237 (एबीम; 1:4,000) के साथ हिलाया गया। झिल्लियों को पीबीएस-टी से धोया गया और फिर द्वितीयक एंटीबॉडी (गधा एंटी-खरगोश 800CW और बकरी एंटी-चूहा 680LT (ली-कोर)) के साथ इनक्यूबेट किया गया। झिल्लियों को 0.01% SDS और 0.2% Tween-20 युक्त ब्लॉकिंग बफर में 22°C पर 1 घंटे के लिए रखा गया (दोनों का अनुपात 1:20,000 था)। झिल्लियों को PBS-T से धोया गया और ओडिसी CLx स्कैनर से उनकी इमेजिंग की गई। इमेज को इमेज स्टूडियो (संस्करण 5.2) में एकत्र और संसाधित किया गया। EPP-RA आइसोफॉर्म (82 kDa) के अनुरूप एक विशिष्ट बैंड का पता नहीं चला।
ईपीपी (हिस्टिडीन फॉस्फेटेस डोमेन युक्त आइसोफॉर्म एजीएपी002463-आरबी के रूप में, एनसीबीआई संरक्षित डोमेन खोज 34) और ईसीके2 (एजीएपी002181) के कोडिंग क्षेत्रों को पीटी-21ए (+) प्लास्मिड (नोवाजेन मिलिपोर सिग्मा) में क्लोन किया गया था; प्राइमर्स को विस्तारित डेटा तालिका 2 में सूचीबद्ध किया गया है। pET-21a(+)-EcK2 कंस्ट्रक्ट के C-टर्मिनल 6xHis टैग से पहले आठ GS4 लिंकर (एक साथ) डाले गए थे। रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन का उत्पादन NEBExpress सेल-फ्री E. coli प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रिया (न्यू इंग्लैंड बायो लैब्स) का उपयोग करके किया गया था। रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन को NEBExpress Ni स्पिन कॉलम (न्यू इंग्लैंड बायो लैब्स) का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। डाइहाइड्रोफोलेट रिडक्टेस (DHFR) नियंत्रण प्रोटीन का उत्पादन NEBExpress सेल-फ्री E. coli प्रोटीन संश्लेषण किट से DNA टेम्पलेट का उपयोग करके किया गया था। प्रोटीन को 50% ग्लिसरॉल में PBS में -20 °C पर 3 महीने तक संग्रहित किया गया था।
ईपीपी और ऊतक अर्क की फॉस्फेटेज गतिविधि को 4-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट (pNPP; सिग्मा-एल्ड्रिच) का उपयोग करके मापा गया। प्रतिक्रिया बफर में 25 mM ट्रिस, 50 mM एसिटिक एसिड, 25 mM बिस्-ट्रिस, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA और 1 mM DTT शामिल थे। ऊतक को प्रतिक्रिया बफर में समरूप बनाया गया और कोशिका मलबे को सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा हटा दिया गया। 2.5 mg/ml pNPP युक्त प्रतिक्रिया बफर में एंजाइम या ऊतक अर्क मिलाकर प्रतिक्रिया शुरू करें। प्रतिक्रिया मिश्रण को कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट किया गया, और pNPP से परिवर्तित pNP की मात्रा को विभिन्न समयों पर 405 nm पर अवशोषण को मापकर निर्धारित किया गया।
इन विट्रो EcK गतिविधि के लिए, प्रोटीन को 0.2 मिलीग्राम 20E या 3D20E के साथ 200 µl बफर (pH 7.5) में 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP और 10 mM MgCl2 युक्त घोल में 27 °C पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। अभिक्रिया को 800 µl मेथनॉल मिलाकर रोक दिया गया, फिर इसे -20 °C पर 1 घंटे के लिए ठंडा किया गया, और फिर 4 °C पर 20,000 g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। इसके बाद सुपरनेटेंट का विश्लेषण HPLC-MS/MS द्वारा किया गया। नियंत्रण समूह में उपयोग किए गए प्रोटीनों को ऊष्मा-निष्क्रिय करने के लिए, प्रोटीनों को PBS में 50% ग्लिसरॉल में 95°C पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया।
इन विट्रो ईपीपी गतिविधि के लिए, प्रोटीन को 3D20E22P (जो 18 युग्म MAG में पाई जाने वाली मात्रा के समतुल्य है, जिसे HPLC-MS/MS द्वारा शुद्ध किया गया है) के साथ 100 µl बफर (pH 7.5) में 25 mM ट्रिस, 50 mM एसिटिक एसिड, 25 mM बिस्-ट्रिस, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA और 1 mM DTT युक्त घोल में 27 °C पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। अभिक्रिया को 400 µl मेथनॉल मिलाकर रोक दिया गया और -20 °C पर 1 घंटे के लिए ठंडा किया गया, फिर 4 °C पर 20,000 g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। सुपरनेटेंट का विश्लेषण HPLC-MS/MS द्वारा किया गया।
मिश्रित लिंग वाले सिरविहीन मच्छर के शवों से तैयार सीडीएनए से ईपीपी (362 बीपी), ईसीके1 (एजीएपी004574, 365 बीपी) और ईसीके2 (556 बीपी) के लिए पीसीआर खंडों को प्रवर्धित किया गया था। ईजीएफपी नियंत्रण (495 बीपी) के पीसीआर खंड को पहले वर्णित पीसीआर2.1-ईजीएफपी से प्रवर्धित किया गया था; पीसीआर प्राइमर्स को विस्तारित डेटा तालिका 2 में सूचीबद्ध किया गया है। पीसीआर खंड को pL4440 प्लास्मिड पर उल्टे T7 प्रमोटरों के बीच डाला गया था। प्लास्मिड संरचनाओं को NEB 5-α सक्षम E. coli (न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) से प्राप्त किया गया था और उपयोग से पहले डीएनए अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया गया था (सम्मिलित अनुक्रम के लिए पूरक डेटा 1 देखें)। T7 प्रमोटर (विस्तारित डेटा तालिका 2) से मेल खाने वाले प्राइमर्स का उपयोग pL4440-आधारित प्लास्मिड से सम्मिलित को प्रवर्धित करने के लिए किया गया था। पीसीआर उत्पाद के आकार की पुष्टि एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा की गई थी। dsRNA को मेगास्क्रिप्ट T7 ट्रांसक्रिप्शन किट (थर्मो फिशर) का उपयोग करके पीसीआर टेम्पलेट्स से प्रतिलेखित किया गया था और पहले वर्णित संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार शुद्ध किया गया था।
dsRNA इंजेक्शन के लिए, 1,380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) को 10 ng nl-1 की सांद्रता पर वयस्क नर या मादा (Nanoject III, Drummond) के वक्ष में अंडे से निकलने के 1 दिन के भीतर इंजेक्ट किया गया। जीन नॉकडाउन स्तरों को RNA निष्कर्षण, cDNA संश्लेषण और RT-qPCR द्वारा कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियों में निर्धारित किया गया। ecdysone इंजेक्शन के लिए, 4 दिन की कुंवारी या 6 दिन की कुंवारी रक्त-पोषित मादाओं को 20E या 3D20E (Nanoject III, Drummond) के 0.13, 0.21, या 0.63 µg की सांद्रता पर क्रमशः 1.3, 2.1 की सांद्रता पर इंजेक्ट किया गया, जो प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है, या 6.3 ng nl-1 की सांद्रता पर। पानी में 10% (वॉल्यूम/वॉल्यूम) इथेनॉल; 10% इथेनॉल में 100 एन.एल. 3D20E22P (जो MAGs के एक जोड़े में पाई जाने वाली मात्रा के 75% के बराबर है)। मच्छरों को यादृच्छिक रूप से इंजेक्शन समूह में रखा गया।
प्रजनन संबंधी परीक्षणों के लिए, तीन दिन की मादा मच्छरों को मानव रक्त का भरपूर सेवन कराया गया। आंशिक रूप से पोषित या अपोषित मच्छरों को अलग कर दिया गया। उपचार के आधार पर, मादा मच्छरों को रक्तपान के कम से कम 48 घंटे बाद चार रातों के लिए अलग-अलग प्रजनन प्यालों में रखा गया। अंडों की गिनती स्टीरियोस्कोप (स्टेमी 508, ज़ीस) के तहत की गई; संभोग कर चुकी मादा मच्छरों के लिए, जिन अंडों से लार्वा निकले उन्हें उपजाऊ माना गया।
संभोग परीक्षणों के लिए, उपचार के आधार पर मादाओं को संभोग के प्रति प्रतिरोध विकसित करने के लिए कम से कम 2 दिन का समय दिया गया, और बाद में समान आयु के जंगली-प्रकार के नर को उसी पिंजरे में डाला गया। दो रात बाद, मादा निषेचित पुटिकाओं को विच्छेदित किया गया और 10 mM ट्रिस-एचसीएल, 1 mM ईडीटीए और 25 mM NaCl (pH 8.2) युक्त बफर में फ्रीज-थॉ और सोनिकेशन द्वारा जीनोमिक डीएनए को मुक्त किया गया। नमूनों को 55°C पर 15 मिनट के लिए प्रोटीनएज़ K (0.86 µg µl-1) के साथ इनक्यूबेट किया गया, इसके बाद 95°C पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। कच्चे जीनोमिक डीएनए की तैयारी को 10 गुना पतला किया गया और Y गुणसूत्र अनुक्रमों का qPCR पता लगाने के लिए उपयोग किया गया; प्राइमर विस्तारित डेटा तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं। Y गुणसूत्र अनुक्रम की अनुपस्थिति संभोग न होने का संकेत देती है।
पुनः संभोग परीक्षणों के लिए, जबरन संभोग कराई गई मादाओं की जांच संभोग प्लग की उपस्थिति के लिए की गई ताकि संभोग की स्थिति की पुष्टि हो सके और उन्हें नर की अनुपस्थिति में संभोग के प्रति प्रतिरोधक क्षमता विकसित करने के लिए 2 दिन का समय दिया गया, जैसा कि पहले वर्णित है 36। इसके बाद, DsRed ट्रांसजेनिक शुक्राणु वाले नर को मादा पिंजरों में डाला गया। दो रात बाद, मादाओं से निषेचन पुटिकाओं को विच्छेदित किया गया, और ऊपर वर्णित अनुसार जीनोमिक डीएनए तैयार किया गया और DsRed ट्रांसजीन का पता लगाने के लिए qPCR का उपयोग किया गया; प्राइमर विस्तारित डेटा तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं। DsRed ट्रांसजीन की अनुपस्थिति ने संकेत दिया कि कोई पुनः संभोग नहीं हुआ।
3D20E का संश्लेषण पूर्व वर्णित विधि³⁷ के अनुसार किया गया। संक्षेप में, 10 मिलीग्राम 20E (सिग्मा-एल्ड्रिच) को 10 मिलीलीटर पानी में घोला गया, इसके बाद 30 मिलीग्राम प्लैटिनम ब्लैक (पाउडर रूप में, सिग्मा-एल्ड्रिच) मिलाया गया। अभिक्रिया मिश्रण में ऑक्सीजन की हल्की धारा लगातार प्रवाहित की गई और इसे कमरे के तापमान पर हिलाया गया। 6 घंटे बाद, अभिक्रिया को रोकने के लिए 30 मिलीलीटर मेथनॉल मिलाया गया। उत्प्रेरक कणों को हटाने के लिए मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज किया गया। सुपरनेटेंट को कमरे के तापमान पर निर्वात में सुखाया गया। सूखे अभिक्रिया उत्पाद को HPLC-MS/MS विश्लेषण के लिए 10% इथेनॉल और मेथनॉल में घोला गया। रूपांतरण दर (20E से 3D20E में) लगभग 97% थी (चित्र 4b), और संश्लेषित 3D20E का MS स्पेक्ट्रम संभोगित मादाओं में पाए गए स्पेक्ट्रम से मेल खाता था (चित्र 4c)।
विवरण में किए गए सांख्यिकीय परीक्षणों का विशिष्ट विवरण शामिल है। फिशर के सटीक परीक्षण, मैन्टेल-कॉक्स परीक्षण और स्टूडेंट के टी-परीक्षण के लिए ग्राफपैड (संस्करण 9.0) का उपयोग किया गया था। कॉकरन-मैन्टेल-हेन्ज़ेल परीक्षण एक कस्टम आर स्क्रिप्ट (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test पर उपलब्ध) का उपयोग करके किए गए थे। डेटा वितरण की सामान्यता का परीक्षण 0.05 के महत्व सीमा के साथ शापिरो-विल्क परीक्षण का उपयोग करके किया गया था। जब डेटा सामान्यता परीक्षण में विफल रहा, तो मैन-व्हिटनी परीक्षण किया गया। उत्तरजीविता डेटा का विश्लेषण मैन्टेल-कॉक्स परीक्षण का उपयोग करके किया गया था। आरएनए-सीक्वेंसिंग जीन-स्तर विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए DESeq2 पैकेज (संस्करण 1.28.1) का उपयोग किया गया था। ग्राफ पर क्षैतिज पट्टी माध्यिका को दर्शाती है। सभी परीक्षणों के लिए P = 0.05 के महत्व मान को सीमा के रूप में उपयोग किया गया था।
अध्ययन की रूपरेखा के बारे में अधिक जानकारी के लिए, इस लेख से जुड़े नेचर रिसर्च रिपोर्ट के सारांश को देखें।
एमएस प्रोटिओमिक डेटा को प्राइड पार्टनर रिपॉजिटरी (https://www.ebi.ac.uk/pride/) के माध्यम से प्रोटिओमेक्सचेंज कंसोर्टियम (http://proteomecentral.proteomexchange.org) में डेटासेट पहचानकर्ता PXD032157 के साथ जमा किया गया था।
आरएनए-सीक्वेंसिंग डेटासेट को जीन एक्सप्रेशन कॉम्प्रिहेंसिव लाइब्रेरी (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) में सीरियल रिकॉर्ड GSE198665 के तहत जमा किया गया है।
वर्तमान अध्ययन के दौरान उत्पन्न और/या विश्लेषण किए गए अतिरिक्त डेटासेट उचित अनुरोध पर संबंधित लेखकों से प्राप्त किए जा सकते हैं। यह लेख स्रोत डेटा प्रदान करता है।
डी लूफ, ए. एक्डीस्टेरॉइड्स: उपेक्षित कीट सेक्स स्टेरॉयड? मेल: ब्लैक बॉक्स. कीट विज्ञान.13, 325–338 (2006).
एनोफेल्स स्टीफेंस में रेडफर्न, सीपीएफ 20-हाइड्रॉक्सीएक्डीसोन और डिम्बग्रंथि विकास। जे. कीट शरीर विज्ञान। 28, 97-109 (1982)।