स्रावी मार्ग में प्रोटीन का वर्गीकरण कोशिका विभाजन और समस्थिति बनाए रखने के लिए आवश्यक है। खोल-मध्यस्थ वर्गीकरण के अलावा, स्रावी परिवहन की प्रक्रिया में काइनेसिन वर्गीकरण में लिपिड की भूमिका एक लंबे समय से अनसुलझा मूलभूत प्रश्न है। यहाँ, हम 3डी एक साथ बहुरंगीन उच्च-रिज़ॉल्यूशन वास्तविक समय इमेजिंग का उपयोग करके यह सिद्ध करते हैं कि नव संश्लेषित ग्लाइकोसिलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल-स्थिर प्रोटीन, जिनमें बहुत लंबी सेरामाइड लिपिड इकाइयाँ होती हैं, को समूहीकृत किया जाता है और विशिष्ट अंतःप्लाज्मिक निकास स्थल में वर्गीकृत किया जाता है, जो ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन द्वारा उपयोग किए जाने वाले स्थल से भिन्न होता है। इसके अतिरिक्त, हम यह दर्शाते हैं कि अंतःप्लाज्मिक रेटिकुलम झिल्ली में सेरामाइड की श्रृंखला की लंबाई इस वर्गीकरण चयनात्मकता के लिए महत्वपूर्ण है। हमारा अध्ययन स्रावी मार्ग में लिपिड श्रृंखला की लंबाई के आधार पर प्रोटीन कार्गो को चयनात्मक निर्यात स्थलों में वर्गीकृत करने का पहला प्रत्यक्ष अंतःजीवित प्रमाण प्रदान करता है।
यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ER) में संश्लेषित प्रोटीन को स्रावी मार्ग के माध्यम से परिवहन के दौरान उनके उपयुक्त कोशिकीय गंतव्य तक पहुँचाने के लिए छाँटा जाता है (1)। कोट-मध्यस्थ छँटाई के अलावा, यह लंबे समय से अनुमान लगाया जा रहा था कि कुछ लिपिड विशिष्ट झिल्ली डोमेन में समूहित होकर विशिष्ट प्रोटीन के लिए चयनात्मक निकास बिंदु के रूप में भी कार्य कर सकते हैं (2-5)। हालाँकि, इस संभावित लिपिड-आधारित तंत्र को सिद्ध करने के लिए अभी भी प्रत्यक्ष इन विवो प्रमाणों की कमी है। इस मूलभूत समस्या को हल करने के लिए, हमने यीस्ट में अध्ययन किया कि ग्लाइकोसिलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (GPI) एंकर प्रोटीन (GPI-AP) को ER से किस प्रकार अलग-अलग निर्यात किया जाता है। GPI-AP विभिन्न प्रकार के लिपिड-संबद्ध कोशिका सतह प्रोटीन हैं (6, 7)। GPI-AP एक स्रावित प्रोटीन है जो ग्लाइकोलिपिड अंश (GPI एंकर) के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी आवरणों से जुड़ा होता है। वे जीपीआई एंकर को ईआर ल्यूमेन में रूढ़िवादी पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के रूप में स्वीकार करते हैं (8)। ​​जुड़ने के बाद, जीपीआई-एपी ईआर से प्लाज्मा झिल्ली तक गोल्जी उपकरण (5, 9) से होकर गुजरता है। जीपीआई एंकर की उपस्थिति के कारण जीपीआई-एपी स्रावी मार्ग के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन (अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन सहित) से अलग से परिवहन होता है (5, 9, 10)। यीस्ट कोशिकाओं में, जीपीआई-एपी को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में अन्य स्रावित प्रोटीन से अलग किया जाता है, और फिर कोट प्रोटीन कॉम्प्लेक्स II (COPII) द्वारा लिपटे अद्वितीय पुटिकाओं में पैक किया जाता है (6, 7)। ईआर निर्यात प्रक्रिया में इस वर्गीकरण प्रक्रिया के निर्धारक स्पष्ट नहीं हैं, लेकिन यह अनुमान लगाया जाता है कि इस तंत्र के लिए लिपिड, विशेष रूप से जीपीआई एंकर के लिपिड भाग के संरचनात्मक पुनर्निर्माण की आवश्यकता हो सकती है (5, 8)। यीस्ट में, जीपीआई के जुड़ने के तुरंत बाद जीपीआई लिपिड रीमॉडलिंग शुरू हो जाती है, और कई मामलों में, यह सेरामाइड को 26-कार्बन लंबी-श्रृंखला संतृप्त फैटी एसिड (C26:0) से बांधने का कारण बनती है (11, 12)। C26 सेरामाइड अब तक यीस्ट कोशिकाओं द्वारा उत्पादित मुख्य सेरामाइड है। यह ईआर में संश्लेषित होता है और इसका अधिकांश भाग COPII पुटिकाओं के माध्यम से गोल्जी तंत्र में निर्यात किया जाता है (13)। जीपीआई-एपी के ईआर निर्यात के लिए विशेष रूप से निरंतर सेरामाइड संश्लेषण की आवश्यकता होती है (14, 15), और बदले में, गोल्जी तंत्र में सेरामाइड का इनोसिटोल फॉस्फेट सेरामाइड (आईपीसी) में रूपांतरण जीपीआई एंकर संश्लेषण पर निर्भर करता है (16)। कृत्रिम झिल्लियों के साथ जैवभौतिकीय अध्ययनों से पता चला है कि बहुत लंबी एसिल श्रृंखला सेरामाइड अद्वितीय भौतिक गुणों वाले व्यवस्थित डोमेन बनाने के लिए संयोजित हो सकते हैं (17, 18)। ये आंकड़े इस परिकल्पना को जन्म देते हैं कि C26 सेरामाइड और C26 सेरामाइड के साथ GPI-AP अपने भौतिक गुणों का उपयोग करके अपेक्षाकृत अव्यवस्थित ER झिल्ली लिपिड वातावरण में व्यवस्थित क्षेत्रों या क्षेत्रों में संयोजित होते हैं। यह मुख्य रूप से छोटे और असंतृप्त ग्लिसरोलिपिड (C16:1 और C18:1) से बना होता है (19, 20)। ये क्षेत्र विशिष्ट ER निकास स्थलों (ERES) पर चुनिंदा रूप से केंद्रित होंगे, जहां सेरामाइड और सेरामाइड-आधारित GPI-AP को एक ही समर्पित COPII पुटिका में गोल्जी तक सह-परिवहन किया जा सकता है (5)।
इस अध्ययन में, हमने सुपर-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल रियल-टाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (एससीएलआईएम) का उपयोग करके इस लिपिड-आधारित तंत्र का सीधे परीक्षण किया है, जो एक अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक है जो एक साथ फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए प्रोटीन का निरीक्षण कर सकती है। तीन-रंग और तीन-आयामी (3डी) छवियों में जीवित कोशिकाओं में अत्यंत उच्च रिज़ॉल्यूशन और गति होती है (21, 22)।
हमने सबसे पहले SCLIM तकनीक का प्रयोग करके यह स्पष्ट किया कि S. cerevisiae में ER छोड़ने के बाद ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन से C26 सेरामाइड समूह वाले सामान्य GPI-AP को कैसे अलग किया जाता है। ER के वर्गीकरण की जाँच करने के लिए, हमने एक आनुवंशिक प्रणाली का उपयोग किया जो इन विवो में ERES में प्रवेश करने वाले नव-संश्लेषित कार्गो को सीधे देख सकती है (7, 23)। कार्गो के रूप में, हमने C26 सेरामाइड-आधारित GPI-AP Gas1 को हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) से और ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2 को निकट-अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन (iRFP) से लेबल किया, ये दोनों ही प्लाज्मा झिल्ली को लक्षित करते हैं (24-26)। sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती में, ये दोनों कार्गो गैलेक्टोज-प्रेरित प्रमोटर और एक संवैधानिक ERES मार्कर के तहत व्यक्त किए जाते हैं। अत्यधिक तापमान (37°C) पर, sec31-1 उत्परिवर्तन COPII कोट घटक Sec31 के कार्य को प्रभावित करता है, जिससे COPII अंकुरण और ER से बाहर निकलना बाधित होता है, और नव-संश्लेषित पदार्थ ER में जमा हो जाता है (23)। कम तापमान (24°C) पर ठंडा करने के बाद, sec31-1 उत्परिवर्ती कोशिकाएं स्रावी क्षेत्र से पुनः प्राप्त हो गईं, और जमा हुआ नया संश्लेषित पदार्थ ER से बाहर निकलने लगा। CLIM विज़ुअलाइज़ेशन से पता चला कि 37°C पर ऊष्मायन के बाद और फिर 24°C पर 5 मिनट के लिए मुक्त होने के बाद, नव-संश्लेषित Gas1-GFP और Mid2-iRFP का अधिकांश भाग अभी भी sec31-1 उत्परिवर्ती कोशिकाओं के ER में जमा था (चित्र 1)। चूंकि Mid2-iRFP पूरी ER झिल्ली पर वितरित होता है, और Gas1-GFP असंतत ER झिल्ली क्षेत्र में केंद्रित और एकत्रित होता है, इसलिए उनका वितरण पूरी तरह से भिन्न होता है (चित्र 1, A से C और मूवी S1)। इसके अतिरिक्त, जैसा कि चित्र 1D में दिखाया गया है, Gas1-GFP क्लस्टर में Mid2-iRFP नहीं है। ये परिणाम दर्शाते हैं कि GPI-AP और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन प्रारंभिक अवस्था में ही अलग-अलग ER झिल्ली क्षेत्रों में अलग हो गए थे। Gas1-GFP क्लस्टर mCherry के COPII कोट प्रोटीन Sec13 (चित्र 1, E और F, और मूवी S1) (23) से चिह्नित एक विशिष्ट ERES के निकट स्थित है।
sec31-1 कोशिकाएं गैलेक्टोज-प्रेरित स्राव, एक लंबी एसिल श्रृंखला (C26) सेरामाइड GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, हरा) और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन Mid2-iRFP (TMP, नीला) को व्यक्त करती हैं। इस रचनात्मक ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, मैजेंटा) को 37°C पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया, फिर 24°C पर स्थानांतरित किया गया और 5 मिनट बाद SCLIM द्वारा इमेजिंग की गई। (A से C) एक समतल (A) की प्रतिनिधि मर्ज की गई या एकल 2D छवि, 10 z-खंडों (B) की 2D प्रक्षेपण छवि या कार्गो और ERES मार्करों (C) की 3D कोशिका गोलार्ध छवि को दर्शाती है। स्केल बार 1μm (A और B) है। स्केल इकाई 0.551μm (C) है। Gas1-GFP को विशिष्ट ER क्षेत्रों या समूहों में पाया गया, जबकि Mid2-iRFP को ER झिल्ली (C) में पाया गया और यह पूरे ER झिल्ली में वितरित था। (D) ग्राफ सफेद तीर रेखा (बाएं) के अनुदिश Gas1-GFP समूह में Gas1-GFP और Mid2-iRFP की सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता को दर्शाता है। AU, मनमानी इकाई। (E और F) 3D छवि को दर्शाते हैं जो वस्तुओं और ERES चिह्न को जोड़ती है। Gas1-GFP समूह विशिष्ट ERES के पास पाए गए। स्केल इकाई 0.551μm है। (F) सफेद ठोस तीर ERES से जुड़े Gas1-GFP समूह को चिह्नित करता है। मध्य और दाएँ पैनल चयनित Gas1-GFP समूह की संयुक्त आवर्धित 3D छवि और घूर्णित दृश्य दिखाते हैं।
Gas1-GFP क्लस्टर और एक विशिष्ट ERES के बीच घनिष्ठ स्थानिक संबंध यह दर्शाता है कि Gas1-GFP चुनिंदा ERES में प्रवेश कर सकता है, जो कि Mid2-iRFP द्वारा ER से बाहर निकलने के लिए उपयोग की जाने वाली चयनात्मकता से भिन्न है। इस संभावना को समझने के लिए, हमने केवल एक या दो वस्तुओं के लिए ERES अनुपात का मात्रात्मक विश्लेषण किया (चित्र 2, A से C)। हमने पाया कि अधिकांश ERES (70%) में केवल एक प्रकार का कार्गो होता है। चित्र 2C का निचला भाग केवल Gas1-GFP (चित्र 1) या केवल Mid2-iRFP (चित्र 2) वाले ERES के दो विशिष्ट उदाहरण दिखाता है। इसके विपरीत, लगभग 20% ERES में दो कार्गो होते हैं जो एक ही क्षेत्र में ओवरलैप करते हैं। यह पाया गया कि कुछ ERES (10%) में दो प्रकार के कार्गो थे, लेकिन वे स्पष्ट रूप से अलग-अलग क्षेत्रों में स्थित थे। इसलिए, यह सांख्यिकीय विश्लेषण दर्शाता है कि ER से बाहर निकलने के बाद, GPI-AP Gas1-GFP और ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो Mid2-iRFP अलग-अलग ERES में विभाजित हो जाते हैं (चित्र 2D)। यह छँटाई दक्षता पिछले जैव रासायनिक विश्लेषण (6) और आकारिकीय निर्धारण (7) के साथ बहुत सुसंगत है। हम ERES में प्रवेश करने वाले संगरोधित कार्गो के व्यवहार का भी अवलोकन कर सकते हैं (चित्र 2E और मूवी S2)। चित्र 2E दर्शाता है कि Gas1-GFP (पैनल 3) या Mid2-iRFP (पैनल 4) का केवल एक छोटा सा हिस्सा एक तरफ से ERES में प्रवेश करता है और एक विशिष्ट क्षेत्र में सीमित रहता है। चित्र 2E का पैनल 5 दर्शाता है कि Gas1-GFP और Mid2-iRFP कभी-कभी एक ही ERES में पाए जाते हैं, लेकिन वे अलग-अलग दिशाओं से प्रवेश करते हैं और अलग-अलग क्षेत्रों में केंद्रित होते हैं जो विभिन्न COPII पुटिकाओं का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। हमने यह भी पुष्टि की कि C26 सेरामाइड-आधारित GPI-AP Gas1 का चयनात्मक ERES के रूप में देखा गया पृथक्करण और वर्गीकरण विशिष्ट है क्योंकि एक अन्य ट्रांसमेम्ब्रेन स्राव कार्गो, GFP-टैग्ड प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन Axl2 (27), Mid2-iRFP के समान व्यवहार दिखाता है। (चित्र S1 और मूवी S3)। नव संश्लेषित Axl2-GFP, Mid2-iRFP की तरह ही ER झिल्ली में वितरित होता है (चित्र S1, A और B), और अधिकांश ERES में Mid2-iRFP के साथ सह-स्थानीयकृत होता है (चित्र S1, B से D)। चित्र 1. S1C के पैनल 1 और 2 में ERES के दो विशिष्ट उदाहरण दिखाए गए हैं जहाँ दो ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो एक दूसरे को ओवरलैप करते हैं। इन मामलों में, दोनों कार्गो एक साथ ERES में प्रवेश करते हैं (चित्र S1E, पैनल 3 और मूवी S3)।
गैलेक्टोज प्रेरित स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, हरा) और Mid2-iRFP (TMP, नीला) तथा निरंतर ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, मैजेंटा) को व्यक्त करने वाली sec31-1 कोशिकाओं को 37°C पर रखा गया। 30 मिनट तक इनक्यूबेट करने के बाद, स्राव अवरोध को मुक्त करने के लिए उन्हें 24°C पर स्थानांतरित किया गया और 20 मिनट बाद SCLIM से इमेजिंग की गई। (A से C) कार्गो और ERES द्वारा चिह्नित 10 z-खंडों की प्रतिनिधि 2D प्रक्षेपण छवियां (A; स्केल बार, 1μm) या 3D कोशिका गोलार्ध छवियां (B और C; स्केल इकाई, 0.456μm)। (B) में निचला पैनल और (C) में पैनल केवल ERES (मैजेंटा) में मौजूद वस्तुओं [Gas1-GFP (ग्रे) और Mid2-iRFP (हल्का नीला)] को प्रदर्शित करने के लिए संसाधित छवियों को प्रदर्शित करते हैं। (C) खुला तीर: ERES केवल एक कार्गो (1 से 4) ले जाता है। धूसर तीर: ERES में पृथक कार्गो (5) होता है। सफेद ठोस तीर: ERES में सह-स्थित कार्गो होता है। नीचे: चयनित एकल ERES में केवल Gas1-GFP (1) या Mid2-iRFP (2) होता है। स्केल बार, 100 nm। (D) (C) में वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ का मात्रात्मक विश्लेषण। ERES का औसत प्रतिशत जिसमें केवल एक कार्गो (Gas1-GFP या Mid2-iRFP), पृथक कार्गो और अतिव्यापी कार्गो होता है। तीन स्वतंत्र प्रयोगों में, 54 कोशिकाओं में n=432। त्रुटि बार = मानक विचलन। दो-तरफ़ा अयुग्मित t परीक्षण। *** P = 0.0002। (E) (C) से चिह्नित संगरोधित कार्गो के चयनित ERES की 3D छवि। Gas1-GFP (हरा) (3) या Mid2-iRFP (नीला) (4) एक तरफ से ERES (मैजेंटा) में प्रवेश करता है और ERES के भीतर एक छोटे से क्षेत्र तक ही सीमित रहता है। कभी-कभी, दोनों प्रकार के कार्गो एक ही ERES (5) में एक ही तरफ से प्रवेश करते हैं और ERES के भीतर एक पृथक क्षेत्र तक ही सीमित रहते हैं। स्केल बार, 100 एनएम।
इसके बाद, हमने इस परिकल्पना का परीक्षण किया कि ईआर झिल्ली में मौजूद लंबी एसिल श्रृंखला सेरामाइड (C26) गैस1 के विशिष्ट क्लस्टरिंग और चयनात्मक ईआरईएस में छँटाई को संचालित करती है। इस उद्देश्य के लिए, हमने एक संशोधित यीस्ट स्ट्रेन GhLag1 का उपयोग किया, जिसमें दो अंतर्जात सेरामाइड सिंथेस Lag1 और Lac1 को GhLag1 (कपास के Lag1 समरूप) से प्रतिस्थापित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक यीस्ट स्ट्रेन प्राप्त हुआ जिसकी कोशिका झिल्ली सेरामाइड श्रृंखला जंगली प्रकार की तुलना में छोटी थी (चित्र 3A) (28)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण से पता चला कि जंगली प्रकार के स्ट्रेन में, कुल सेरामाइड का 95% बहुत लंबी (C26) श्रृंखला सेरामाइड है, जबकि GhLag1 में, सेरामाइड का 85% बहुत लंबी (C18 और C16) श्रृंखला सेरामाइड है। यद्यपि अब तक GhLag1 झिल्ली में मुख्य रूप से C18 और C16 सेरामाइड्स पाए गए हैं, लेकिन MS विश्लेषण ने यह भी पुष्टि की है कि GhLag1 स्ट्रेन में व्यक्त Gas1-GFP के GPI एंकर में C26 सेरामाइड होता है, जो वाइल्ड-टाइप लिपिड के समान है (चित्र 3A) (26)। इसलिए, इसका अर्थ है कि सेरामाइड रीमॉडलिंग एंजाइम Cwh43 C26 सेरामाइड के लिए अत्यधिक चयनात्मक है, जैसा कि चित्र 26 में दिखाया गया है, यह GhLag1 स्ट्रेन में C26 सेरामाइड की थोड़ी मात्रा से GPI एंकर को प्राथमिकता से शामिल करता है। S2 (29)। फिर भी, GhLag1 की कोशिका झिल्ली में मूल रूप से केवल C18-C16 सेरामाइड होता है, जबकि Gas1-GFP में अभी भी C26 सेरामाइड होता है। यह तथ्य इस स्ट्रेन को ER में झिल्ली सेरामाइड की एसिल श्रृंखला की लंबाई की समस्या को विशेष रूप से हल करने के लिए एक आदर्श उपकरण बनाता है। वर्ग और छँटाई की काल्पनिक भूमिका। इसके बाद, हमने सर्वप्रथम पारंपरिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के माध्यम से sec31-1 के तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती एलील वाले GhLag1 में C26 Gas1-GFP की समूहों में संचय करने की क्षमता का अध्ययन किया, जहाँ ER झिल्ली सेरामाइड में केवल लंबी (C18-C16) श्रृंखला मौजूद होती है (चित्र 3)। हमने देखा कि sec31-1 में, अधिकांश Gas1-GFP समूहों में केंद्रित था, जबकि लंबी (C18-C16) सेरामाइड ER झिल्ली वाले sec31-1 GhLag1 में Gas1-GFP मुख्य रूप से समूहों में नहीं था और पूरी ER झिल्ली में वितरित था। सटीक रूप से कहें तो, क्योंकि C26 सेरामाइड-आधारित समूहीकरण विशिष्ट ERES से निकटता से संबंधित है (चित्र 1), हमने आगे यह जांच की कि क्या इस प्रक्रिया में ER निर्यात प्रोटीन तंत्र का कार्य भी शामिल हो सकता है। जीपीआई-एपी ईआर निर्यात के लिए एक विशेष सीओपीआईआई प्रणाली का उपयोग करता है, जो जीपीआई एंकर के ग्लाइकेन भाग के टेड1 द्वारा संरचनात्मक पुनर्निर्माण के माध्यम से सक्रिय रूप से विनियमित होता है (30, 31)। पुनः संयोजक जीपीआई-ग्लाइकेन को तब ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर p24 कॉम्प्लेक्स द्वारा पहचाना जाता है, जो बदले में चुनिंदा रूप से एलएसटी1 को भर्ती करता है, जो प्रमुख सीओपीआईआई कार्गो बाइंडिंग सबयूनिट एसईसी24 का एक विशिष्ट आइसोफॉर्म है, जिससे जीपीआई-एपी-समृद्ध सीओपीआईआई वेसिकल्स का निर्माण आवश्यक हो जाता है (31-33)। इसलिए, हमने एक डबल म्यूटेंट का निर्माण किया जिसमें इन एकल प्रोटीनों (p24 कॉम्प्लेक्स घटक Emp24, जीपीआई-ग्लाइकेन पुनर्निर्माण एंजाइम टेड1 और विशिष्ट सीओपीआईआई सबयूनिट एलएसटी1) के विलोपन को sec31-1 म्यूटेंट स्ट्रेन के साथ संयोजित किया गया था, और यह अध्ययन किया कि क्या गैस1-क्लस्टर जीएफपी का निर्माण संभव है (चित्र 3)। हमने देखा कि sec31-1emp24Δ और sec31-1ted1Δ में, Gas1-GFP मुख्य रूप से असंबद्ध है और ER झिल्ली में समान रूप से वितरित है, जैसा कि पहले sec31-1 GhLag1 में देखा गया था, जबकि sec31-1lst1Δ में, Gas1-GFP sec31-1 के समान है। ये परिणाम दर्शाते हैं कि ER झिल्ली में C26 सेरामाइड की उपस्थिति के अतिरिक्त, Gas1-GFP के समूहीकरण के लिए p24 कॉम्प्लेक्स से जुड़ना भी आवश्यक है, और इसके लिए विशिष्ट Lst1 भर्ती की आवश्यकता नहीं है। इसके बाद, हमने इस संभावना का पता लगाया कि ER झिल्ली में सेरामाइड की श्रृंखला की लंबाई Gas1-GFP के p24 से जुड़ने को नियंत्रित कर सकती है। हालाँकि, हमने पाया कि झिल्ली में C18-C16 सेरामाइड की उपस्थिति p24 कॉम्प्लेक्स द्वारा पुनर्निर्मित GPI-ग्लाइकैन (आकृतियाँ S3 और S4, A और B) या GPI-AP से बंधन और GPI-AP के निर्यात की क्षमता को प्रभावित नहीं करती है। COPII सबटाइप Lst1 को भर्ती करें (आकृति S4C)। इसलिए, C26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिंग के लिए विभिन्न ER निर्यात प्रोटीन तंत्रों के साथ प्रोटीन अंतःक्रियाओं की आवश्यकता नहीं होती है, बल्कि यह लिपिड लंबाई द्वारा संचालित एक वैकल्पिक छँटाई तंत्र का समर्थन करती है। फिर, हमने विश्लेषण किया कि क्या ER झिल्ली में सेरामाइड एसिल श्रृंखला की लंबाई Gas1-GFP को चयनात्मक ERES के रूप में प्रभावी वर्गीकरण के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि लघु-श्रृंखला सेरामाइड वाले GhLag1 स्ट्रेन में Gas1 ER को छोड़कर प्लाज्मा झिल्ली में प्रवेश करता है (आकृति S5), हमारा मानना ​​है कि यदि छँटाई सेरामाइड एसिल श्रृंखला की लंबाई द्वारा संचालित होती है, तो GhLag1 स्ट्रेन में Gas1 को पुनर्निर्देशित और पार किया जा सकता है। समान झिल्ली वाले ईआरईएस उत्पाद।
(A) GhLag1 की कोशिका झिल्ली में मुख्य रूप से छोटे C18-C16 सेरामाइड होते हैं, जबकि Gas1-GFP के GPI एंकर में अभी भी वाइल्ड-टाइप कोशिकाओं के समान C26 IPC मौजूद है। ऊपर: मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) द्वारा वाइल्ड-टाइप (Wt) और GhLag1p स्ट्रेन की कोशिका झिल्ली में सेरामाइड की एसिल श्रृंखला लंबाई का विश्लेषण। डेटा कुल सेरामाइड का प्रतिशत दर्शाता है। तीन स्वतंत्र प्रयोगों का औसत। त्रुटि बार = मानक विचलन। दो-तरफ़ा अयुग्मित t परीक्षण। **** P <0.0001। नीचे का पैनल: वाइल्ड-टाइप और GhLag1p स्ट्रेन में व्यक्त Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI एंकर में मौजूद IPC की एसिल श्रृंखला लंबाई का MS विश्लेषण। डेटा कुल IPC सिग्नल का प्रतिशत दर्शाता है। पाँच स्वतंत्र प्रयोगों का औसत। त्रुटि बार = मानक विचलन। दो-तरफ़ा अयुग्मित t परीक्षण। ns, महत्वपूर्ण नहीं। P = 0.9134. (B) गैलेक्टोज-प्रेरित Gas1-GFP व्यक्त करने वाली sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ और sec31-1lst1Δ कोशिकाओं के फ्लोरेसेंस माइक्रोग्राफ को 37°C पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया और 24°C के बाद नियमित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए भेजा गया। सफेद तीर: ER Gas1-GFP क्लस्टर। खुला तीर: असंबद्ध Gas1-GFP पूरे ER झिल्ली पर वितरित है, जो ER की विशिष्ट नाभिकीय वलय रंगाई को दर्शाता है। स्केल बार, 5μm। (C) (B) में वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ का मात्रात्मक विश्लेषण। बिंदुदार Gas1-GFP संरचना वाली कोशिकाओं का औसत प्रतिशत। तीन स्वतंत्र प्रयोगों में, n≥300 कोशिकाएँ। त्रुटि बार = मानक विचलन (SD)। दो-तरफ़ा अयुग्मित t परीक्षण। **** पी ＜0.0001.
इस समस्या को सीधे हल करने के लिए, हमने sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती एलील के साथ GhLag1 में Gas1-GFP और Mid2-iRFP का SCLIM विज़ुअलाइज़ेशन किया (चित्र 4 और मूवी S4)। ER को 37°C पर बनाए रखने और बाद में 24°C पर छोड़ने के बाद, नव संश्लेषित Gas1-GFP का अधिकांश भाग क्लस्टर में नहीं था और पारंपरिक माइक्रोस्कोप द्वारा देखे जाने पर ER झिल्ली में वितरित था (चित्र 4, A और B)। इसके अलावा, ERES का एक बड़ा प्रतिशत (67%) इसमें सह-स्थित दो प्रकार के कार्गो को शामिल करता है (चित्र 4D)। चित्र 4C के पैनल 1 और 2 ओवरलैपिंग Gas1-GFP और Mid2-GFP के साथ ERES के दो विशिष्ट उदाहरण दिखाते हैं। इसके अलावा, दोनों कार्गो एक ही ERES में भर्ती किए गए थे (चित्र 4E, पैनल 3 और मूवी S4)। इसलिए, हमारे परिणाम बताते हैं कि ईआर झिल्ली में सेरामाइड एसिल श्रृंखला की लंबाई ईआर प्रोटीन के एकत्रीकरण और वर्गीकरण का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है।
Sec31-1 GhLag1 कोशिकाएं, जिनमें गैलेक्टोज-प्रेरित स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, हरा) और Mid2-iRFP (TMP, नीला) तथा स्थायी ERES-लेबल वाले Sec13-mCherry (ERES, मैजेंटा) मौजूद हैं, को 37°C पर इनक्यूबेट करें। 30 मिनट तक इनक्यूबेट करने के बाद, स्रावों को मुक्त करने के लिए तापमान को 24°C तक कम करें और 20 मिनट बाद SCLIM से इमेजिंग करें। (A से C) कार्गो और ERES द्वारा चिह्नित 10 z-खंडों की प्रतिनिधि 2D प्रक्षेपण छवियां (A; स्केल बार, 1μm) या 3D कोशिका गोलार्ध छवियां (B और C; स्केल इकाई, 0.45μm) दर्शाई गई हैं। (B) का निचला पैनल और (C) का पैनल केवल ERES (मैजेंटा) में मौजूद वस्तुओं [Gas1-GFP (ग्रे) और Mid2-iRFP (हल्का नीला)] को प्रदर्शित करने के लिए संसाधित छवियों को प्रदर्शित करते हैं। (C) सफेद रंग से भरा तीर: ERES, वस्तुओं का ओवरलैप। खुला तीर: ERES में केवल एक वस्तु है। निचला पैनल: चयनित ERES में (C) में चिह्नित ओवरलैपिंग वस्तुएं (1 और 2) हैं। स्केल बार, 100 nm। (D) (C) में वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ का मात्रात्मक विश्लेषण। sec31-1 और sec31-1 GhLag1 इकाइयों में, केवल एक कार्गो (Gas1-GFP या Mid2-iRFP) शामिल है, और पृथक कार्गो और ओवरलैपिंग कार्गो के लिए ERES का औसत प्रतिशत। तीन स्वतंत्र प्रयोगों में, 54 कोशिकाओं (sec31-1) में n = 432 और 47 कोशिकाओं (sec31-1 GhLag1) में n = 430। त्रुटि बार = मानक विचलन (SD)। दो-तरफ़ा अयुग्मित t परीक्षण। *** P = 0.0002 (sec31-1) और ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)। (E) चयनित ERES की 3D छवि, जिसमें (C) में चिह्नित ओवरलैपिंग कार्गो (3) दिखाया गया है। Gas1-GFP (हरा) और Mid2-iRFP (नीला) एक ही तरफ से ERES (मैजेंटा) की ओर आते हैं और उसी ERES प्रतिबंधित क्षेत्र में रहते हैं। स्केल बार, 100 nm।
यह अध्ययन प्रत्यक्ष रूप से जीवित अवस्था में इस बात का प्रमाण देता है कि लिपिड-आधारित प्रोटीन कार्गो स्रावी मार्ग में चयनात्मक निर्यात स्थलों में वर्गीकृत होते हैं, और वर्गीकरण चयनात्मकता के लिए एसिल श्रृंखला की लंबाई के महत्व को उजागर करता है। SCLIM नामक एक शक्तिशाली और अत्याधुनिक सूक्ष्मदर्शी तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने खमीर में नव संश्लेषित Gas1-GFP (एक प्रमुख प्लाज्मा झिल्ली GPI-AP जिसमें एक बहुत लंबी एसिल श्रृंखला (C26) सेरामाइड लिपिड भाग होता है) का प्रदर्शन किया। अलग-अलग ER में समूहीकृत क्षेत्र विशिष्ट ERES से जुड़े होते हैं, जबकि पार-झिल्ली स्रावित प्रोटीन ER झिल्ली में वितरित होते हैं (चित्र 1)। इसके अतिरिक्त, ये दोनों प्रकार के पदार्थ चुनिंदा रूप से अलग-अलग ERES में प्रवेश करते हैं (चित्र 2)। झिल्ली में कोशिकीय सेरामाइड की एसिल श्रृंखला की लंबाई C26 से घटकर C18-C16 हो जाती है, Gas1-GFP क्लस्टर अलग ER क्षेत्र में विघटित हो जाता है, और Gas1-GFP को उसी ERES के माध्यम से ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के साथ ER छोड़ने के लिए पुनर्निर्देशित किया जाता है (चित्र 3 और चित्र 3)। 4)।
हालांकि जीपीआई-एपी ईआर से बाहर निकलने के लिए एक विशेष प्रोटीन तंत्र का उपयोग करता है, हमने पाया कि सी26 सेरामाइड-निर्भर पृथक्करण विभेदक प्रोटीन अंतःक्रियाओं पर निर्भर नहीं करता है जो ईआरईएस विशेषज्ञता को जन्म दे सकता है (चित्र एस4 और एस5)। इसके बजाय, हमारे निष्कर्ष लिपिड-आधारित प्रोटीन क्लस्टरिंग और उसके बाद अन्य कार्गो के बहिष्करण द्वारा संचालित एक वैकल्पिक वर्गीकरण तंत्र का समर्थन करते हैं। हमारे अवलोकन बताते हैं कि एक विशिष्ट ईआरईएस से जुड़े गैस1-जीएफपी क्षेत्र या क्लस्टर में ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन मिड2-आईआरएफपी की कमी होती है, जो दर्शाता है कि सी26 सेरामाइड-निर्भर जीपीआई-एपी क्लस्टर संबंधित ईआरईएस में उनके प्रवेश को सुगम बनाएगा, और साथ ही, ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावों को इस विशेष ईआरईएस में प्रवेश करने से रोकेगा (चित्र 1 और 2)। इसके विपरीत, ईआर झिल्ली में सी18-सी16 सेरामाइड की उपस्थिति जीपीआई-एपी को क्षेत्र या क्लस्टर बनाने का कारण नहीं बनती है, इसलिए वे ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन को उसी ईआरईएस में बाहर नहीं करते हैं या प्रतिस्थापित नहीं करते हैं (चित्र 3 और 4)। इसलिए, हम यह प्रस्ताव करते हैं कि C26 सेरामाइड विशिष्ट ERES से जुड़े प्रोटीनों के क्लस्टरिंग को सुविधाजनक बनाकर पृथक्करण और वर्गीकरण को बढ़ावा देता है।
C26 सेरामाइड पर निर्भर इस क्लस्टरिंग को एक विशिष्ट ER क्षेत्र में कैसे प्राप्त किया जा सकता है? झिल्ली सेरामाइड की पार्श्व रूप से अलग होने की प्रवृत्ति के कारण GPI-AP और C26 सेरामाइड, ER झिल्ली के अधिक अनियमित लिपिड वातावरण में छोटे और तात्कालिक रूप से व्यवस्थित लिपिड बना सकते हैं, जिसमें छोटे और असंतृप्त ग्लिसरोलिपिड होते हैं। गुणवत्ता क्लस्टर (17, 18)। ये छोटे अस्थायी क्लस्टर p24 कॉम्प्लेक्स से जुड़ने के बाद बड़े, अधिक स्थिर क्लस्टर में विलीन हो सकते हैं (34)। इसके अनुरूप, हमने दिखाया कि C26 Gas1-GFP को बड़े दृश्यमान क्लस्टर बनाने के लिए p24 कॉम्प्लेक्स के साथ परस्पर क्रिया करने की आवश्यकता होती है (चित्र 3)। p24 कॉम्प्लेक्स खमीर में चार अलग-अलग p24 ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन से बना एक विषमयुग्मजी ऑलिगोमर है (35), जो बहुसंयोजक बंधन प्रदान करता है, जिससे छोटे GPI-AP क्लस्टर का क्रॉस-लिंकिंग हो सकता है, जिससे बड़े स्थिर क्लस्टर उत्पन्न होते हैं (34)। जीपीआई-एपी के प्रोटीन एक्टोडोमेन के बीच परस्पर क्रिया भी उनके एकत्रीकरण में योगदान दे सकती है, जैसा कि स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं में उनके गोल्गी परिवहन के दौरान दिखाया गया है (36)। हालांकि, जब ईआर झिल्ली में C18-C16 सेरामाइड मौजूद होता है, तो जब p24 कॉम्प्लेक्स Gas1-GFP से जुड़ता है, तो बड़े अलग-अलग समूह नहीं बनेंगे। अंतर्निहित तंत्र लंबी एसिल श्रृंखला सेरामाइड के विशिष्ट भौतिक और रासायनिक गुणों पर निर्भर हो सकता है। कृत्रिम झिल्लियों के जैवभौतिकीय अध्ययन से पता चलता है कि हालांकि लंबी (C24) और छोटी (C18-C16) दोनों एसिल श्रृंखला सेरामाइड चरण पृथक्करण का कारण बन सकते हैं, केवल लंबी एसिल श्रृंखला सेरामाइड (C24) ही उच्च वक्रता और फिल्म को मोड़ने को बढ़ावा दे सकती है ताकि फिल्म को पारस्परिक संदर्भ के माध्यम से नया आकार दिया जा सके (17, 37, 38)। यह दिखाया गया है कि TMED2 का ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स, जो Emp24 का मानव समरूप है, साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल्स में C18 सेरामाइड-आधारित स्फिंगोमायलिन के साथ चुनिंदा रूप से परस्पर क्रिया करता है (39)। आणविक गतिशीलता (MD) सिमुलेशन का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि C18 और C26 दोनों सेरामाइड Emp24 ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स के साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल्स के आसपास जमा होते हैं, और उनकी प्राथमिकताएँ समान होती हैं (चित्र S6)। यह ध्यान देने योग्य है कि यह इंगित करता है कि Emp24 का ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स झिल्ली में लिपिड के असममित वितरण का कारण बन सकता है। यह स्तनधारी कोशिकाओं पर आधारित एक हालिया परिणाम है। इसी तरह के MD सिमुलेशन ईथर लिपिड की उपस्थिति भी दर्शाते हैं (40)। इसलिए, हम अनुमान लगाते हैं कि ER26 के दो लोब्यूल्स में C26 सेरामाइड स्थानीय रूप से समृद्ध है। जब ल्यूमिनल लोब्यूल्स में GPI-AP सीधे मल्टीवैलेंट p24 से जुड़ता है और साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल्स में p24 के चारों ओर C26 सेरामाइड का संचय होता है, तो यह साथ में होने वाले प्रोटीन एकत्रीकरण को बढ़ावा दे सकता है और उंगलियों (41) के माध्यम से झिल्ली वक्रता उत्पन्न होती है, जिससे GPI-AP ERES के निकटवर्ती अलग-अलग क्षेत्रों में विभाजित हो जाता है, जो ER झिल्ली के अत्यधिक घुमावदार क्षेत्रों को भी बढ़ावा देता है (42)। पिछली रिपोर्टों ने प्रस्तावित तंत्र का समर्थन किया (43, 44)। प्लाज्मा झिल्ली पर सेरामाइड-आधारित ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स (GSL) से ऑलिगोलेक्टिन, रोगजनकों या एंटीबॉडी का मल्टीवैलेंट बंधन बड़े GSL एकत्रीकरण को ट्रिगर करता है, चरण पृथक्करण को बढ़ाता है और झिल्ली विरूपण और आंतरिककरण का कारण बनता है (44)। इवाबुची आदि (43) यह पाया गया कि लंबी (सी24) लेकिन छोटी (सी16) एसिल श्रृंखलाओं की उपस्थिति में, जीएसएल लैक्टोसिलसेरामाइड से बंधे बहुसंयोजक लिगैंड ने बड़े समूहों और झिल्ली अंतर्वलन के गठन को प्रेरित किया, और पत्रकों पर साइटोप्लाज्म लिन-मध्यस्थ संकेत संचरण युग्मित न्यूट्रोफिल में एसिल श्रृंखलाओं द्वारा अंतःविभाजित होता है।
स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं में, एपिकल प्लाज्मा झिल्ली के स्तर तक एंटी-गोल्गी नेटवर्क (TGN) की सांद्रता GPI-AP के पृथक्करण और छँटाई को नियंत्रित करती है (10, 45)। यह एकत्रीकरण GPI-AP ऑलिगोमेराइज़ेशन द्वारा संचालित होता है (36), लेकिन यह खमीर में पाई जाने वाली सेरामाइड श्रृंखला की लंबाई पर भी निर्भर हो सकता है। यद्यपि स्तनधारी GPI-AP में ईथर लिपिड-आधारित एंकर होता है, और इसकी रासायनिक संरचना बहुत लंबी एसिल श्रृंखला सेरामाइड से बहुत अलग होती है, एक हालिया अध्ययन में पाया गया है कि दोनों लिपिड में विकासवादी रूप से समान भौतिक और रासायनिक गुण और कार्य होते हैं (40)। इसलिए, स्तनधारी कोशिकाओं में ईथर लिपिड भाग खमीर में C26 सेरामाइड के समान हो सकता है, और इसकी भूमिका झिल्ली में लंबी श्रृंखला वाले सेरामाइड के साथ जुड़कर GPI-AP के एकत्रीकरण और छँटाई को बढ़ावा देना है। हालांकि इस संभावना का प्रत्यक्ष परीक्षण अभी बाकी है, पिछले निष्कर्षों से पता चलता है कि लंबी एसिल श्रृंखला सेरामाइड का गोल्जी बॉडी तक परिवहन साइटोप्लाज्मिक ट्रांसफर प्रोटीन द्वारा नहीं होता है, बल्कि यीस्ट की तरह जीपीआई एंकर के संश्लेषण पर निर्भर करता है। इसलिए, विकासवादी रूप से संरक्षित तंत्र एक ही परिवहन पुटिका में बहुत लंबी एसिल श्रृंखला सेरामाइड और जीपीआई-एपी (13, 16, 20, 46, 47) का चयनात्मक सह-परिवहन करने में सक्षम प्रतीत होता है।
यीस्ट और स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका प्रणालियों में, GPI-AP का एकत्रीकरण और अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन से पृथक्करण, कोशिका सतह तक पहुँचने से पहले ही हो जाता है। पलाडिनो एट अल. (48) ने पाया कि स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं के TGN पर, GPI-AP का समूहीकरण न केवल GPI-AP के शीर्ष प्लाज्मा झिल्ली में चयनात्मक वर्गीकरण के लिए आवश्यक है, बल्कि यह GPI-AP के समूहीकरण संगठन और इसकी जैविक गतिविधि को भी नियंत्रित करता है। कोशिका सतह। यीस्ट में, इस अध्ययन से पता चला कि ER पर C26 सेरामाइड-निर्भर GPI-AP समूह प्लाज्मा झिल्ली पर GPI-AP के समूह संगठन और कार्यात्मक गतिविधि को नियंत्रित कर सकता है (24, 49)। इस मॉडल के अनुरूप, GhLag1 कोशिकाएं GPI अवरोधकों या कोशिका भित्ति की अखंडता को प्रभावित करने वाली दवाओं के प्रति एलर्जिक होती हैं (28), और खमीर कोशिकाओं के मिलन में प्रक्षेपित टिप सेरामाइड के कार्यात्मक Gas1-GFP क्लस्टर (49) की आवश्यकता GPI-AP त्रुटि को इंगित करती है। हालांकि, लिपिड की लंबाई पर आधारित छँटाई विधि द्वारा ER से कोशिका सतह के कार्यात्मक संगठन को प्रोग्राम किया गया है या नहीं, इसका आगे परीक्षण करना हमारे भविष्य के शोध का विषय होगा।
इस कार्य में उपयोग किए गए सैकरोमाइसिस सेरेविसी उपभेदों को तालिका S1 में सूचीबद्ध किया गया है। जीवित कोशिका इमेजिंग के लिए SCLIM के MMY1583 और MMY1635 उपभेदों का निर्माण W303 की पृष्ठभूमि में किया गया था। फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के साथ Sec13-mCherry को व्यक्त करने वाले इन उपभेदों का निर्माण pFA6a प्लास्मिड को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) आधारित विधि द्वारा किया गया था (23)। GAL1 प्रमोटर के नियंत्रण में फ्लोरोसेंट प्रोटीन से लेबल किए गए Mid2-iRFP को व्यक्त करने वाले उपभेद का निर्माण निम्नानुसार किया गया था। pKTiRFP-KAN वेक्टर (E. O'Shea का उपहार, Addgene प्लास्मिड संख्या 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; अनुसंधान संसाधन पहचानकर्ता (RRID): Addgene_64687) से iRFP-KanMx अनुक्रम का PCR प्रवर्धन किया गया और इसे अंतर्जात Mid2 के C-टर्मिनस में डाला गया। मिड2-आईआरएफपी जीनोम अनुक्रम को प्रवर्धित और जीएएल1 प्रमोटर में क्लोन करने के बाद, इसे एकीकरण प्लास्मिड pRS306 के नॉट आई-सैक आई साइट में एकीकृत किया गया। परिणामस्वरूप प्राप्त प्लास्मिड pRGS7 को Pst I से रैखिकीकृत करके URA3 लोकस में एकीकृत किया गया।
Gas1-GFP संलयन जीन को सेंट्रोमियर (CEN) प्लास्मिड में GAL1 प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है, जिसका निर्माण निम्नानुसार किया गया है। Gas1-GFP अनुक्रम को pRS416-GAS1-GFP प्लास्मिड (24) (L. Popolo द्वारा प्रदत्त) से PCR द्वारा प्रवर्धित किया गया और CEN प्लास्मिड pBEVY-GL LEU2 (C. Miller द्वारा प्रदत्त) के Xma I–Xho I स्थल में क्लोन किया गया; Addgene प्लास्मिड संख्या 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225)। परिणामी प्लास्मिड का नाम pRGS6 रखा गया। Axl2-GFP संलयन जीन को भी pBEVY-GL LEU2 वेक्टर के GAL1 प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है, और इसका निर्माण निम्नानुसार है। pRS304-p2HSE-Axl2-GFP प्लास्मिड (23) से Axl2-GFP अनुक्रम को PCR द्वारा प्रवर्धित किया गया और pBEVY-GL LEU2 वेक्टर के Bam HI-Pst I स्थल में क्लोन किया गया। परिणामी प्लास्मिड का नाम pRGS12 रखा गया। इस अध्ययन में प्रयुक्त ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का अनुक्रम तालिका S2 में सूचीबद्ध है।
इस स्ट्रेन को 0.2% एडेनिन और 2% ग्लूकोज [वाईपी-डेक्सट्रोज (वाईपीडी)], 2% रैफिनोज [वाईपी-रैफिनोज] युक्त यीस्ट एक्सट्रेक्ट प्रोटीन पी (वाईपी) माध्यम (1% यीस्ट एक्सट्रेक्ट और 2% प्रोटीन ईपीटी) [वाईपीआर] या 2% गैलेक्टोज [वाईपी-गैलेक्टोज (वाईपीजी)] कार्बन स्रोत के रूप में, या एक सिंथेटिक न्यूनतम माध्यम (0.15% यीस्ट नाइट्रोजन बेस और 0.5% अमोनियम सल्फेट) में पोषण के लिए आवश्यक उपयुक्त अमीनो एसिड और बेस की पूर्ति के लिए, और 2% ग्लूकोज (सिंथेटिक ग्लूकोज न्यूनतम माध्यम) या 2% गैलेक्टोज (सिंथेटिक गैलेक्टोज न्यूनतम माध्यम) कार्बन स्रोत के रूप में युक्त माध्यम में पूरक किया गया था।
वास्तविक समय इमेजिंग के लिए, तापमान-संवेदनशील sec31-1 उत्परिवर्ती कोशिकाओं को, जिनमें GAL1 प्रमोटर के अंतर्गत कंस्ट्रक्ट व्यक्त किया गया था, YPR माध्यम में 24°C पर रात भर मध्य-लॉग चरण तक उगाया गया। 24°C पर 1 घंटे के लिए YPG में प्रेरण के बाद, कोशिकाओं को 37°C पर 30 मिनट के लिए SG में इनक्यूबेट किया गया, और फिर स्राव अवरोध से मुक्त करने के लिए 24°C पर स्थानांतरित किया गया। कॉनकैनावेलिन A का उपयोग करके कोशिकाओं को कांच की स्लाइड पर स्थिर किया गया और SCLIM द्वारा इमेजिंग की गई। SCLIM, Olympus IX-71 इनवर्टेड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और UPlanSApo 100×1.4 न्यूमेरिकल एपर्चर ऑयल लेंस (Olympus), हाई-स्पीड और हाई-सिग्नल-टू-नॉइज़ रेश्यो रोटेटिंग डिस्क कन्फोकल स्कैनर (Yokogawa Electric), कस्टम स्पेक्ट्रोमीटर और कस्टम कूलिंग का एक संयोजन है। सिस्टम का इमेज इंटेंसिफायर (Hamamatsu Photonics) ×266.7 के अंतिम आवर्धन के साथ एक मैग्नीफाइंग लेंस सिस्टम और इलेक्ट्रॉनों को गुणा करने वाला एक चार्ज-कपल्ड डिवाइस कैमरा (Hamamatsu Photonics) (21) प्रदान कर सकता है। इमेज अधिग्रहण कस्टम सॉफ्टवेयर (Yokogawa Electric) द्वारा किया जाता है। 3D छवियों के लिए, हमने ऑब्जेक्टिव लेंस को लंबवत रूप से कंपन करने के लिए एक कस्टम-निर्मित पीजोइलेक्ट्रिक एक्चुएटर का उपयोग किया, और 100 nm की दूरी पर ऑप्टिकल भागों को एक स्टैक में एकत्र किया। Z-स्टैक छवि को 3D वोक्सेल डेटा में परिवर्तित किया जाता है, और रोटेटिंग डिस्क कन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग किए जाने वाले सैद्धांतिक पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शन का उपयोग वेलोसिटी सॉफ़्टवेयर (पेर्किनएल्मर) द्वारा डीकनवोल्यूशन प्रोसेसिंग के लिए किया जाता है। वेलोसिटी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सह-स्थान विश्लेषण के लिए स्वचालित रूप से थ्रेशोल्डिंग करके, कार्गो सहित ERES को मापा गया। मेटामॉर्फ सॉफ़्टवेयर (मॉलिक्यूलर डिवाइसेस) का उपयोग करके लाइन स्कैन विश्लेषण किया गया।
सांख्यिकीय सार्थकता निर्धारित करने के लिए ग्राफ़पैड प्रिज्म सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। दो-पूंछ वाले स्टूडेंट के टी-परीक्षण और सामान्य एक-तरफ़ा विश्लेषण ऑफ़ वेरिएंस (एनोवा) परीक्षण के लिए, समूहों के बीच अंतर को P <0.05 (*) पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालने वाला माना जाता है।
Gas1-GFP के फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए, लॉग फेज कोशिकाओं को YPD में रात भर उगाया गया और सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा एकत्रित किया गया, फॉस्फेट बफर्ड सलाइन से दो बार धोया गया, और कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर रखा गया, और फिर पहले बताए गए तरीके से माइक्रोस्कोप के नीचे जांच की गई (24)। एक्विजिशन के लिए ऑब्जेक्टिव लेंस, L5 (GFP) फिल्टर, हमामात्सु कैमरा और एप्लीकेशन सूट X (LAS X) सॉफ्टवेयर से लैस लीका DMi8 माइक्रोस्कोप (HCX PL APO 1003/1.40 ऑयल PH3 CS) का उपयोग किया गया।
नमूनों को 65°C पर 10 मिनट के लिए SDS सैंपल बफर के साथ विकृत किया गया, और फिर SDS-पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (PAGE) द्वारा अलग किया गया। इम्यूनोब्लॉटिंग विश्लेषण के लिए, प्रति लेन 10 μl नमूना लोड किया गया। प्राथमिक एंटीबॉडी: खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-Gas1 का 1:3000 के अनुपात में, खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-Emp24 का 1:500 के अनुपात में, और खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-GFP (H. Riezman द्वारा उपहार स्वरूप प्राप्त) का 1:3000 के अनुपात में उपयोग किया गया। माउस मोनोक्लोनल एंटी-Pgk1 एंटीबॉडी का 1:5000 के अनुपात में उपयोग किया गया (J. de la Cruz द्वारा उपहार स्वरूप प्राप्त)। द्वितीयक एंटीबॉडी: हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (HRP) संयुग्मित बकरी एंटी-खरगोश इम्यूनोग्लोबुलिन G (IgG) का 1:3000 के अनुपात में उपयोग किया गया (Pierce)। एचआरपी-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी का उपयोग 1:3000 के तनुकरण पर किया गया (पियर्स)। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया क्षेत्र का अवलोकन सुपरसिग्नल वेस्ट पिको अभिकर्मक (थर्मो फिशर साइंटिफिक) की केमिलुमिनेसेंस विधि द्वारा किया गया।
(31) में वर्णित अनुसार, संवर्धित ER अंश पर एक प्राकृतिक इम्यूनोप्रेसिपिटेशन प्रयोग किया गया। संक्षेप में, यीस्ट कोशिकाओं को TNE बफर [50 mM ट्रिस-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM फेनिलमिथाइलसल्फोनील फ्लोराइड और प्रोटीज अवरोधक मिश्रण] से 600 nm (OD600) पर 100 ऑप्टिकल घनत्व पर दो बार धोया गया। इसे कांच के मोतियों से तोड़ा गया, और फिर कोशिका के मलबे और कांच के मोतियों को सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा हटा दिया गया। इसके बाद सुपरनेटेंट को 4°C पर 15 मिनट के लिए 17,000 g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। पेलेट को TNE में पुनः निलंबित किया गया और डिजिटलिस सैपोनिन को 1% की अंतिम सांद्रता तक मिलाया गया। सस्पेंशन को 4°C पर घुमाते हुए 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया, और फिर 4°C पर 13,000 g पर 60 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा अघुलनशील घटकों को अलग कर दिया गया। Gas1-GFP इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के लिए, पहले नमूने को खाली एगारोज बीड्स (क्रोमोटेक) के साथ 4°C पर 1 घंटे के लिए प्री-इनक्यूबेट किया गया, और फिर GFP-Trap_A (क्रोमोटेक) के साथ 4°C पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। इम्यूनोप्रेसिपिटेटेड बीड्स को 0.2% डाइगॉक्सिजेनिन युक्त TNE से पांच बार धोया गया, SDS सैंपल बफर से निकाला गया, SDS-PAGE पर अलग किया गया, और इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा विश्लेषण किया गया।
(31) में वर्णित अनुसार, संवर्धित ER अंश पर क्रॉस-लिंकिंग निर्धारण किया गया। संक्षेप में, संवर्धित ER अंश को 0.5 mM डाइथियोबिस (सक्सिनिमिडिल प्रोपियोनेट) (पियर्स, थर्मो फिशर साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, IL, USA; 20°C, 20 मिनट) के साथ इनक्यूबेट किया गया। ग्लाइसिन (50 mM अंतिम सांद्रता, 5 मिनट, 20°C) मिलाकर क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया को रोक दिया गया।
जैसा कि पहले वर्णित है (50), वाइल्ड-टाइप और GhLag1 स्ट्रेन में सेरामाइड का MS विश्लेषण किया गया। संक्षेप में, कोशिकाओं को 30°C पर YPD में घातीय चरण (3 से 4 OD600 यूनिट/ml) तक बढ़ाया गया, और 25×107 कोशिकाओं को एकत्रित किया गया। उनके चयापचय को ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड से बुझाया गया। निष्कर्षण विलायक [इथेनॉल, पानी, ईथर, पाइरिडीन और 4.2 N अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (15:15:5:1:0.018 v/v)] और 1.2 nmol आंतरिक मानक C17 सेरामाइड (860517, अवंती पोलर लिपिड) का उपयोग किया गया। अर्क के हल्के क्षारीय जल अपघटन के लिए मोनोमेथिलामाइन अभिकर्मक [मेथेनॉल, पानी, n-ब्यूटेनॉल और मेथिलामाइन घोल (4:3:1:5 v/v)] का उपयोग किया गया, और फिर लवण-मुक्त करने के लिए जल-संतृप्त n-ब्यूटेनॉल का उपयोग किया गया। अंत में, अर्क को एक धनात्मक मोड विलायक [क्लोरोफॉर्म/मेथेनॉल/जल (2:7:1) + 5 mM अमोनियम एसीटेट] में पुनः निलंबित किया गया और मास स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्ट किया गया। स्फिंगोलिपिड अणुओं की पहचान और मात्रा निर्धारण के लिए बहु-प्रतिक्रिया निगरानी (MRM) की गई। लिपिड विश्लेषण के लिए TSQ वैंटेज तृतीयक क्वाड्रुपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) एक रोबोटिक नैनोफ्लो आयन स्रोत नैनोमेट HD (एडवियन बायोसाइंसेज, इथाका, न्यूयॉर्क) से सुसज्जित है। प्रत्येक सेरामाइड श्रेणी के लिए टक्कर ऊर्जा को अनुकूलित किया गया है। MS डेटा धनात्मक मोड में प्राप्त किया गया था। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए, लिपिड सिग्नल तीन स्वतंत्र मापों का माध्यिका है।
(31) में वर्णित अनुसार, Gas1-GFP व्यक्त करने वाली कोशिकाओं (800×107) को प्राकृतिक इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के अधीन किया गया। शुद्ध Gas1-GFP को SDS-PAGE द्वारा अलग किया गया और पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली पर स्थानांतरित किया गया। प्रोटीन को एमाइड ब्लैक से PVDF को रंगकर देखा गया। Gas1-GFP बैंड को PVDF से काटकर मेथनॉल से 5 बार और लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-MS (LC-MS) ग्रेड पानी से एक बार धोया गया। झिल्ली पट्टी को 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0) बफर और 500μl ताज़ा घुले हुए 1 M सोडियम नाइट्राइट मिश्रण के साथ 37°C पर 3 घंटे तक इनक्यूबेट करने पर, लिपिड अंश Gas1-GFP से मुक्त हो जाता है और ग्लूकोसामाइन और इनोसिटोल के बीच इनोसिन फॉस्फेट सेरामाइड का लाइस्ड रिलीज होता है (51)। इसके बाद, झिल्ली पट्टी को LC-MS ग्रेड के पानी से चार बार धोया गया, कमरे के तापमान पर सुखाया गया और विश्लेषण तक -80°C पर नाइट्रोजन वातावरण में संग्रहित किया गया। नियंत्रण के रूप में, प्रत्येक प्रयोग के लिए PVDF झिल्ली के एक खाली नमूने का उपयोग किया गया। Gas1-GFP से निकाले गए लिपिड का विश्लेषण फिर MS द्वारा वर्णित विधि (50) के अनुसार किया गया। संक्षेप में, GPI-लिपिड युक्त PVDF पट्टियों को 75μl नेगेटिव मोल्ड सॉल्वेंट [क्लोरोफॉर्म/मेथेनॉल (1:2) + 5 mM अमोनियम एसीटेट] में पुनः निलंबित किया गया और स्फिंगोलिपिड प्रजातियों के इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI)-MRM/MS विश्लेषण (TSQ Vantage) से गुजारा गया। इस मामले में, MS डेटा नेगेटिव आयन मोड में प्राप्त किया गया।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, जीपीआई एंकर के लिपिड भाग को [3H]-इनोसिटोल-लेबल वाले जीपीआई-एपी (16) से अलग किया गया था। लिपिड को विलायक प्रणाली (55:45:10 क्लोरोफॉर्म-मेथेनॉल-0.25% केसीएल) का उपयोग करके पतली-परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग किया गया था और एफएलए-7000 (फुजीफिल्म) का उपयोग करके देखा गया था।
Gas1-GFP (600×107) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को TNE बफर से दो बार धोया गया, फिर कांच के मोतियों से तोड़ा गया और कोशिका मलबे और कांच के मोतियों को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। इसके बाद, सुपरनेटेंट को 4°C पर 1 घंटे के लिए 17,000 g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। पेलेट को TNE में धोया गया और 0.2% डिजिटलिस सैपोनिन युक्त TNE में 1 U PI-PLC (इनविट्रोजन) के साथ 37°C पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। एंजाइम उपचार के बाद, झिल्ली को 4°C पर 1 घंटे के लिए 17,000 g पर सेंट्रीफ्यूज करके हटा दिया गया। Gas1-GFP को इम्यूनोप्रेसिपिटेट करने के लिए, सुपरनेटेंट को GFP-Trap_A (क्रोमोटेक) के साथ 4°C पर रात भर इनक्यूबेट किया गया। SDS-PAGE द्वारा अलग किए गए शुद्ध Gas1-GFP को कूमासी ब्रिलियंट ब्लू से रंगा गया। गैस1-जीएफपी स्टेनिंग बैंड को एक्वाडक्ट के चारों ओर मौजूद धूसर भाग से अलग किया गया, और फिर आयोडोएसिटामाइड के साथ एल्किलीकरण और डाइथियोथ्रिटोल के साथ अपचयन के बाद, ट्रिप्सिन के साथ इन-जेल पाचन किया गया। ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स और जीपीआई-ग्लाइकैन युक्त पेप्टाइड्स को निकालकर सुखाया गया। सूखे पेप्टाइड को 20 μl पानी में घोला गया। एक भाग (8 μl) को एलसी में इंजेक्ट किया गया। विशिष्ट ग्रेडिएंट स्थितियों के तहत पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए एक ऑक्टाडेसिलसिलैन (ओडीएस) कॉलम (डेवेलोसिल 300ओडीएस-एचजी-5; आंतरिक व्यास 150 मिमी × 1.0 मिमी; नोमुरा केमिकल, आइची प्रीफेक्चर, जापान) का उपयोग किया गया। मोबाइल चरण विलायक ए (0.08% फॉर्मिक एसिड) और विलायक बी (80% एसीटोनिट्राइल में 0.15% फॉर्मिक एसिड) थे। एसेला एचपीएलसी प्रणाली (थर्मो फिशर साइंटिफिक, बोस्टन, मैसाचुसेट्स) का उपयोग करके, कॉलम को विलायक ए के साथ 55 मिनट के भीतर 50 μl min-1 की प्रवाह दर पर 5 मिनट के लिए एल्यूट किया गया, और फिर विलायक बी की सांद्रता को 40% तक बढ़ाया गया। (संयुक्त राज्य अमेरिका)। एलुएट को लगातार ईएसआई आयन स्रोत में डाला गया, और ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स और जीपीआई-ग्लाइकैन युक्त पेप्टाइड्स का विश्लेषण एलटीक्यू ऑर्बिट्रैप एक्सएल (हाइब्रिड लीनियर आयन ट्रैप-ऑर्बिट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर; थर्मो फिशर साइंटिफिक) द्वारा किया गया। एमएस सेटअप में, केशिका स्रोत का वोल्टेज 4.5 kV पर सेट किया गया था, और स्थानांतरण केशिका का तापमान 300°C पर रखा गया था। केशिका वोल्टेज और ट्यूब लेंस वोल्टेज क्रमशः 15 V और 50 V पर सेट किए गए थे। MS डेटा धनात्मक आयन मोड (60,000 का रिज़ॉल्यूशन; 10 पार्ट्स प्रति मिलियन की द्रव्यमान सटीकता) में 300/m/z द्रव्यमान/आवेश अनुपात (m/z) 3000 की द्रव्यमान सीमा में प्राप्त किया गया था। MS/MS डेटा LTQ Orbitrap XL में आयन ट्रैप के माध्यम से प्राप्त किया जाता है [पहले 3 अंक जिन पर डेटा निर्भर करता है, टक्कर प्रेरित पृथक्करण (CID)]।
MD सिमुलेशन GROMACS (52) सॉफ्टवेयर और MARTINI 2 फोर्स फील्ड (53-55) का उपयोग करके किए गए थे। इसके बाद, CHARMM GUI मेम्ब्रेन बिल्डर (56, 57) का उपयोग करके डायोलियोइलफॉस्फेटिडिलकोलीन (DOPC) और Cer C18 या DOPC और Cer C26 युक्त एक द्विपरत का निर्माण किया गया। Cer C26 की टोपोलॉजी और निर्देशांक स्फिंगोसिन टेल से अतिरिक्त बीड्स को हटाकर DXCE से प्राप्त किए गए थे। नीचे वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके दोहरी परत को संतुलित करें और इसे चलाएं, फिर Emp24 युक्त एक प्रणाली बनाने के लिए सिस्टम के अंतिम निर्देशांक का उपयोग करें। यीस्ट Emp24 (अवशेष 173 से 193) के ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन को विजुअल MD (VMD) टूल मॉलिक्यूलर स्ट्रक्चर (58) का उपयोग करके एक α-हेलिक्स के रूप में निर्मित किया गया था। फिर, अतिव्यापी लिपिड को हटाने के बाद, प्रोटीन को मोटे तौर पर दानेदार बनाया गया और CHARMM GUI का उपयोग करके द्विपरत में डाला गया। अंतिम प्रणाली में 1202 DOPC और 302 Cer C26 या 1197 DOPC और 295 Cer C18 और Emp24 शामिल हैं। प्रणाली को 0.150M की सांद्रता तक आयनित करें। दो द्विपरत संरचनाओं के लिए चार स्वतंत्र प्रतिकृतियां बनाई गईं।
लिपिड बाइलेयर को CHARMM GUI प्रक्रिया का उपयोग करके संतुलित किया जाता है, जिसमें 405,000 चरणों को न्यूनतम करना और फिर संतुलित करना शामिल है, जहां स्थिति संबंधी बाधाओं को धीरे-धीरे कम किया जाता है और समाप्त किया जाता है, और समय चरण को 0.005 ps से बढ़ाकर 0.02 ps किया जाता है। संतुलन स्थापित होने के बाद, यह 0.02 ps के समय चरण के साथ 6 µs का परिणाम देता है। Emp24 डालने के बाद, सिस्टम को न्यूनतम और संतुलित करने के लिए उसी CHARMM GUI प्रक्रिया का उपयोग करें, और फिर उत्पादन में 8 सेकंड के लिए चलाएं।
सभी प्रणालियों के लिए, संतुलन प्रक्रिया के दौरान, दाब को बेरेंडसेन बैरोस्टेट (59) द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और उत्पादन प्रक्रिया के दौरान, दाब को पैरिनेलो-रहमान बैरोस्टेट (60) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। सभी मामलों में, औसत दाब 1 बार होता है और एक अर्ध-आइसोट्रोपिक दाब युग्मन योजना का उपयोग किया जाता है। संतुलन और उत्पादन प्रक्रिया में, प्रोटीन, लिपिड और विलायक कणों के तापमान को क्रमशः युग्मित करने के लिए गति पुन: अंशांकन के साथ एक थर्मोस्टेट (61) का उपयोग किया जाता है। संपूर्ण संचालन के दौरान, लक्ष्य तापमान 310K होता है। गैर-बंधन अंतःक्रिया की गणना 0.005 बफर सहनशीलता के साथ वर्लेट योजना का उपयोग करके युग्मन सूची बनाकर की जाती है। कूलम्ब पद की गणना अभिक्रिया क्षेत्र और 1.1 एनएम की कट-ऑफ दूरी का उपयोग करके की जाती है। वेंडर वाल्स पद 1.1 एनएम की कट-ऑफ दूरी के साथ एक कट-ऑफ योजना का उपयोग करता है, और विभव बहाव (62) के लिए वर्लेट कट-ऑफ योजना का उपयोग किया जाता है।
वीएमडी का उपयोग करते हुए, डीओपीसी फॉस्फेट बीड्स या सेरामाइड एएम1 बीड्स और प्रोटीन के बीच कटऑफ तरंगदैर्ध्य 0.7 एनएम है, और प्रोटीन के साथ परस्पर क्रिया करने वाले लिपिड की संख्या की गणना की जाती है। निम्नलिखित सूत्र के अनुसार, (63) में दिए गए अनुसार क्षय-संवर्धन (डीई) कारक की गणना करें: डीई कारक = (प्रोटीन में कुल लिपिड की मात्रा 0.7) प्रोटीन में 0.7 (कुल लिपिड में सेरामाइड की मात्रा)
रिपोर्ट किया गया मान औसत के रूप में प्राप्त किया गया है, और त्रुटि बार SE की चार स्वतंत्र प्रतियां हैं। DE कारक की सांख्यिकीय सार्थकता की गणना t परीक्षण [(औसत DE - कारक - 1) / SE] द्वारा की जाती है। एकतरफा वितरण से P मान की गणना करें।
ट्रेस के अंतिम 250 ns के भीतर Emp24 युक्त सिस्टम का 2D पार्श्व घनत्व मानचित्र निकालने के लिए GROMACS टूल का उपयोग किया गया। सेरामाइड के संवर्धन/कमी मानचित्र को प्राप्त करने के लिए, Cer के घनत्व मानचित्र को Cer और DOPC के मानचित्र के योग से विभाजित किया गया, और फिर शरीर में Cer की सांद्रता से विभाजित किया गया। समान रंग मानचित्र पैमाने का उपयोग किया गया।
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