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सिंथॉन 3-(एंथ्रासेन-9-वाईएल)-2-सायनोएक्रिलोइल क्लोराइड 4 का संश्लेषण किया गया और विभिन्न नाइट्रोजन न्यूक्लियोफाइलों के साथ इसकी अभिक्रिया द्वारा कई अत्यंत सक्रिय विषमचक्रीय यौगिकों का संश्लेषण किया गया। संश्लेषित प्रत्येक विषमचक्रीय यौगिक की संरचना का स्पेक्ट्रोस्कोपिक और मौलिक विश्लेषण द्वारा गहनता से लक्षण वर्णन किया गया। तेरह नए विषमचक्रीय यौगिकों में से दस ने बहु-दवा प्रतिरोधी जीवाणुओं (MRSA) के विरुद्ध उत्साहजनक प्रभावकारिता दिखाई। इनमें से यौगिक 6, 7, 10, 13b और 14 ने लगभग 4 सेमी के अवरोध क्षेत्र के साथ उच्चतम जीवाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित की। हालांकि, आणविक डॉकिंग अध्ययनों से पता चला कि यौगिकों की पेनिसिलिन-बाइंडिंग प्रोटीन 2a (PBP2a) के प्रति अलग-अलग बंधन आत्मीयता थी, जो MRSA प्रतिरोध के लिए एक प्रमुख लक्ष्य है। कुछ यौगिक जैसे 7, 10 और 14 ने सह-क्रिस्टलीकृत क्विनाज़ोलिनोन लिगैंड की तुलना में PBP2a के सक्रिय स्थल पर उच्च बंधन आत्मीयता और अंतःक्रिया स्थिरता दिखाई। इसके विपरीत, यौगिक 6 और 13b के डॉकिंग स्कोर कम थे, लेकिन फिर भी उन्होंने महत्वपूर्ण जीवाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित की, जिसमें यौगिक 6 का MIC (9.7 μg/100 μL) और MBC (78.125 μg/100 μL) मान सबसे कम था। डॉकिंग विश्लेषण से हाइड्रोजन बॉन्डिंग और π-स्टैकिंग सहित प्रमुख अंतःक्रियाओं का पता चला, विशेष रूप से Lys 273, Lys 316 और Arg 298 जैसे अवशेषों के साथ, जिन्हें PBP2a की क्रिस्टल संरचना में सह-क्रिस्टलीकृत लिगैंड के साथ अंतःक्रिया करते हुए पहचाना गया था। ये अवशेष PBP2a की एंजाइमेटिक गतिविधि के लिए आवश्यक हैं। ये परिणाम बताते हैं कि संश्लेषित यौगिक आशाजनक एंटी-MRSA दवाओं के रूप में काम कर सकते हैं, जो प्रभावी चिकित्सीय उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए आणविक डॉकिंग को जैव-परीक्षणों के साथ संयोजित करने के महत्व को उजागर करते हैं।
इस शताब्दी के पहले कुछ वर्षों में, अनुसंधान प्रयास मुख्य रूप से आसानी से उपलब्ध प्रारंभिक सामग्रियों का उपयोग करके रोगाणुरोधी गतिविधि वाले कई नवीन विषमचक्रीय प्रणालियों के संश्लेषण के लिए नई, सरल प्रक्रियाओं और विधियों को विकसित करने पर केंद्रित थे।
एक्रिलोनाइट्राइल यौगिक कई उल्लेखनीय विषमचक्रीय प्रणालियों के संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण प्रारंभिक सामग्री माने जाते हैं क्योंकि ये अत्यधिक प्रतिक्रियाशील यौगिक होते हैं। इसके अलावा, 2-सायनोएक्रिलोइल क्लोराइड व्युत्पन्नों का हाल के वर्षों में औषधीय अनुप्रयोगों के क्षेत्र में महत्वपूर्ण उत्पादों के विकास और संश्लेषण के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, जैसे कि दवा मध्यवर्ती1,2,3, एंटी-एचआईवी, एंटीवायरल, एंटीकैंसर, एंटीबैक्टीरियल, एंटीडिप्रेसेंट और एंटीऑक्सीडेंट एजेंटों के अग्रदूत4,5,6,7,8,9,10। हाल ही में, एंथ्रासीन और इसके व्युत्पन्नों की जैविक प्रभावकारिता, जिनमें उनके एंटीबायोटिक, एंटीकैंसर11,12, एंटीबैक्टीरियल13,14,15 और कीटनाशक गुण16,17 शामिल हैं, ने बहुत ध्यान आकर्षित किया है18,19,20,21। एक्रिलोनाइट्राइल और एंथ्रासीन यौगिक युक्त रोगाणुरोधी यौगिकों को चित्र 1 और 2 में दर्शाया गया है।
विश्व स्वास्थ्य संगठन (WHO) (2021) के अनुसार, रोगाणुरोधी प्रतिरोध (AMR) स्वास्थ्य और विकास के लिए एक वैश्विक खतरा है22,23,24,25। इससे रोगियों का इलाज संभव नहीं हो पाता, जिसके परिणामस्वरूप अस्पताल में अधिक समय तक रहना पड़ता है और महंगी दवाओं की आवश्यकता होती है, साथ ही मृत्यु दर और विकलांगता भी बढ़ जाती है। प्रभावी रोगाणुरोधी दवाओं की कमी अक्सर विभिन्न संक्रमणों के उपचार में विफलता का कारण बनती है, विशेष रूप से कीमोथेरेपी और बड़ी सर्जरी के दौरान।
विश्व स्वास्थ्य संगठन की 2024 की रिपोर्ट के अनुसार, मेथिसिलिन-प्रतिरोधी स्टैफिलोकोकस ऑरियस (MRSA) और ई. कोलाई को प्राथमिकता वाले रोगजनकों की सूची में शामिल किया गया है। ये दोनों जीवाणु कई एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति प्रतिरोधी हैं, इसलिए इनसे होने वाले संक्रमणों का इलाज और नियंत्रण मुश्किल है, और इस समस्या से निपटने के लिए नए और प्रभावी रोगाणुरोधी यौगिकों को विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है। एंथ्रासीन और इसके व्युत्पन्न प्रसिद्ध रोगाणुरोधी हैं जो ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव दोनों प्रकार के जीवाणुओं पर कार्य कर सकते हैं। इस अध्ययन का उद्देश्य एक ऐसा नया व्युत्पन्न संश्लेषित करना है जो स्वास्थ्य के लिए खतरनाक इन रोगजनकों से मुकाबला कर सके।
विश्व स्वास्थ्य संगठन (WHO) की रिपोर्ट के अनुसार, कई जीवाणु रोगजनक कई एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति प्रतिरोधी हैं, जिनमें मेथिसिलिन-प्रतिरोधी स्टैफिलोकोकस ऑरियस (MRSA) भी शामिल है, जो समुदाय और स्वास्थ्य देखभाल केंद्रों में संक्रमण का एक आम कारण है। MRSA संक्रमण से पीड़ित रोगियों में दवा-संवेदनशील संक्रमणों से पीड़ित रोगियों की तुलना में मृत्यु दर 64% अधिक पाई गई है। इसके अलावा, ई. कोलाई एक वैश्विक खतरा है क्योंकि कार्बापेनेम-प्रतिरोधी एंटरोबैक्टीरिया (यानी, ई. कोलाई) के खिलाफ रक्षा की अंतिम पंक्ति कोलिस्टिन है, लेकिन हाल ही में कई देशों में कोलिस्टिन-प्रतिरोधी बैक्टीरिया पाए गए हैं। 22,23,24,25
इसलिए, विश्व स्वास्थ्य संगठन की रोगाणुरोधी प्रतिरोध पर वैश्विक कार्य योजना26 के अनुसार, नए रोगाणुरोधी पदार्थों की खोज और संश्लेषण की तत्काल आवश्यकता है। एंथ्रासीन और एक्रिलोनाइट्राइल की जीवाणुरोधी27, कवकनाशीरोधी28, कैंसररोधी29 और एंटीऑक्सीडेंट30 एजेंटों के रूप में अपार क्षमता को कई प्रकाशित शोध पत्रों में उजागर किया गया है। इस संदर्भ में, यह कहा जा सकता है कि ये व्युत्पन्न मेथिसिलिन-प्रतिरोधी स्टैफिलोकोकस ऑरियस (MRSA) के खिलाफ उपयोग के लिए उपयुक्त उम्मीदवार हैं।
पिछले साहित्य समीक्षाओं ने हमें इन वर्गों में नए व्युत्पन्न संश्लेषित करने के लिए प्रेरित किया। इसलिए, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एंथ्रासीन और एक्रिलोनाइट्राइल अंशों वाले नए विषमचक्रीय तंत्र विकसित करना, उनकी रोगाणुरोधी और जीवाणुरोधी प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना और आणविक डॉकिंग द्वारा पेनिसिलिन-बाइंडिंग प्रोटीन 2ए (पीबीपी2ए) के साथ उनकी संभावित बंधन अंतःक्रियाओं की जांच करना था। पिछले अध्ययनों के आधार पर, वर्तमान अध्ययन ने शक्तिशाली पीबीपी2ए निरोधात्मक गतिविधि वाले आशाजनक एंटीमेथिसिलिन-प्रतिरोधी स्टैफिलोकोकस ऑरियस (एमआरएसए) एजेंटों की पहचान करने के लिए विषमचक्रीय तंत्रों के संश्लेषण, जैविक मूल्यांकन और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण को जारी रखा।31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49
हमारा वर्तमान शोध एंथ्रासीन और एक्रिलोनाइट्राइल अंशों वाले नए विषमचक्रीय यौगिकों के संश्लेषण और रोगाणुरोधी मूल्यांकन पर केंद्रित है। 3-(एंथ्रासीन-9-वाईएल)-2-सायनोएक्रिलोइल क्लोराइड 4 को तैयार किया गया और इसका उपयोग नए विषमचक्रीय प्रणालियों के निर्माण के लिए एक बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में किया गया।
यौगिक 4 की संरचना का निर्धारण स्पेक्ट्रल डेटा का उपयोग करके किया गया था। 1H-NMR स्पेक्ट्रम ने 9.26 ppm पर CH= की उपस्थिति दर्शाई, IR स्पेक्ट्रम ने 1737 cm−1 पर कार्बोनिल समूह और 2224 cm−1 पर सायनो समूह की उपस्थिति दर्शाई, और 13CNMR स्पेक्ट्रम ने भी प्रस्तावित संरचना की पुष्टि की (प्रायोगिक अनुभाग देखें)।
3-(एंथ्रासेन-9-वाईएल)-2-सायनोएक्रिलोइल क्लोराइड 4 का संश्लेषण एरोमैटिक समूहों 250, 41, 42, 53 के इथेनोलिक सोडियम हाइड्रॉक्साइड घोल (10%) के साथ हाइड्रोलिसिस द्वारा पूरा किया गया था, जिससे एसिड 354, 45, 56 प्राप्त हुए, जिन्हें फिर वाटर बाथ पर थायोनिल क्लोराइड के साथ उपचारित किया गया, जिससे एक्रिलोइल क्लोराइड व्युत्पन्न 4 उच्च उपज (88.5%) में प्राप्त हुआ, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है।
अपेक्षित जीवाणुरोधी प्रभावकारिता वाले नए विषमचक्रीय यौगिकों को बनाने के लिए, एसिल क्लोराइड 4 की विभिन्न द्विनाभिकीय संघटकों के साथ अभिक्रिया कराई गई।
एसिड क्लोराइड 4 को 0°C पर एक घंटे के लिए हाइड्राज़ीन हाइड्रेट के साथ उपचारित किया गया। दुर्भाग्यवश, पाइराज़ोलोन 5 प्राप्त नहीं हुआ। उत्पाद एक एक्रिलामाइड व्युत्पन्न था जिसकी संरचना स्पेक्ट्रल डेटा द्वारा पुष्टि की गई। इसके IR स्पेक्ट्रम में C=O के लिए 1720 cm⁻¹, C≡N के लिए 2228 cm⁻¹ और NH के लिए 3424 cm⁻¹ पर अवशोषण बैंड दिखाई दिए। 1H-NMR स्पेक्ट्रम में 9.3 ppm पर ओलेफिन प्रोटॉन और NH प्रोटॉन का एक एक्सचेंज सिंगलेट सिग्नल दिखाई दिया (प्रायोगिक अनुभाग देखें)।
एसिड क्लोराइड 4 के दो मोलों की अभिक्रिया एक मोल फिनाइलहाइड्राज़ीन के साथ कराई गई, जिससे एन-फिनाइलएक्रिलोइलहाइड्राज़ीन व्युत्पन्न 7 अच्छी मात्रा (77%) में प्राप्त हुआ (चित्र 5)। 7 की संरचना की पुष्टि अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा द्वारा की गई, जिसमें दो C=O समूहों का अवशोषण 1691 और 1671 cm⁻¹ पर, CN समूह का अवशोषण 2222 cm⁻¹ पर और NH समूह का अवशोषण 3245 cm⁻¹ पर देखा गया। इसके 1H-NMR स्पेक्ट्रम में CH समूह 9.15 और 8.81 ppm पर तथा NH प्रोटॉन 10.88 ppm पर दिखाई दिया (प्रायोगिक अनुभाग देखें)।
इस अध्ययन में, एसिल क्लोराइड 4 की 1,3-डाइन्यूक्लियोफाइल के साथ अभिक्रिया का अध्ययन किया गया। कमरे के तापमान पर TEA को क्षार के रूप में उपयोग करते हुए, 1,4-डाइऑक्सेन में 2-अमीनोपाइरीडीन के साथ एसिल क्लोराइड 4 के उपचार से एक्रिलामाइड व्युत्पन्न 8 प्राप्त हुआ (चित्र 5), जिसकी संरचना को स्पेक्ट्रल डेटा का उपयोग करके पहचाना गया। IR स्पेक्ट्रा में 2222 cm⁻¹ पर सायनो स्ट्रेचिंग, 3148 cm⁻¹ पर NH और 1665 cm⁻¹ पर कार्बोनिल के अवशोषण बैंड दिखाई दिए; 1H NMR स्पेक्ट्रा ने 9.14 ppm पर ओलेफिन प्रोटॉन की उपस्थिति की पुष्टि की (प्रायोगिक अनुभाग देखें)।
यौगिक 4, थायोयूरिया के साथ अभिक्रिया करके पाइरिमिडिनथियोन 9 देता है; यौगिक 4, थायोसेमीकार्बाज़ाइड के साथ अभिक्रिया करके थायोपाइराज़ोल व्युत्पन्न 10 देता है (चित्र 5)। यौगिक 9 और 10 की संरचनाओं की पुष्टि स्पेक्ट्रल और मौलिक विश्लेषण द्वारा की गई (प्रायोगिक अनुभाग देखें)।
टेट्राज़ीन-3-थियोल 11 को यौगिक 4 की थियोकार्बाज़ाइड के साथ अभिक्रिया द्वारा 1,4-डिन्यूक्लियोफाइल के रूप में तैयार किया गया (चित्र 5), और इसकी संरचना की पुष्टि स्पेक्ट्रोस्कोपी और मौलिक विश्लेषण द्वारा की गई। अवरक्त स्पेक्ट्रम में, C=N बंध 1619 cm−1 पर दिखाई दिया। साथ ही, इसके 1H-NMR स्पेक्ट्रम में 7.78–8.66 ppm पर एरोमैटिक प्रोटॉन और 3.31 ppm पर SH प्रोटॉन के मल्टीप्लेट सिग्नल बरकरार रहे (प्रायोगिक अनुभाग देखें)।
एक्रिलोइल क्लोराइड 4, 1,2-डायमिनोबेंजीन, 2-एमिनोथियोफेनोल, एंथ्रानिलिक एसिड, 1,2-डायमिनोएथेन और इथेनॉलमाइन के साथ 1,4-डिन्यूक्लियोफाइल के रूप में प्रतिक्रिया करके नए हेटरोसाइक्लिक सिस्टम (13-16) बनाता है।
इन नव संश्लेषित यौगिकों की संरचनाओं की पुष्टि स्पेक्ट्रल और मौलिक विश्लेषण द्वारा की गई (प्रायोगिक अनुभाग देखें)। 2-हाइड्रॉक्सीफेनिलएक्रिलामाइड व्युत्पन्न 17 को 2-एमिनोफेनॉल के साथ एक डाइन्यूक्लियोफाइल के रूप में अभिक्रिया द्वारा प्राप्त किया गया (चित्र 6), और इसकी संरचना की पुष्टि स्पेक्ट्रल और मौलिक विश्लेषण द्वारा की गई। यौगिक 17 के अवरक्त स्पेक्ट्रम ने दर्शाया कि C=O और C≡N संकेत क्रमशः 1681 और 2226 cm⁻¹ पर दिखाई दिए। साथ ही, इसके 1H-NMR स्पेक्ट्रम में ओलेफिन प्रोटॉन का एकल संकेत 9.19 ppm पर और OH प्रोटॉन 9.82 ppm पर दिखाई दिया (प्रायोगिक अनुभाग देखें)।
डायोक्सेन को विलायक और टीईए को उत्प्रेरक के रूप में उपयोग करते हुए, कमरे के तापमान पर अम्ल क्लोराइड 4 की एक न्यूक्लियोफाइल (जैसे, एथिलएमीन, 4-टोलुइडिन और 4-मेथॉक्सीएनिलीन) के साथ अभिक्रिया से हरे रंग के क्रिस्टलीय एक्रिलामाइड व्युत्पन्न 18, 19a और 19b प्राप्त हुए। यौगिक 18, 19a और 19b के मौलिक और स्पेक्ट्रल डेटा ने इन व्युत्पन्नों की संरचनाओं की पुष्टि की (प्रायोगिक अनुभाग देखें) (चित्र 7)।
विभिन्न संश्लेषित यौगिकों की रोगाणुरोधी गतिविधि की जांच के बाद, तालिका 1 और चित्र 8 (चित्र फ़ाइल देखें) में दर्शाए गए अनुसार भिन्न परिणाम प्राप्त हुए। परीक्षण किए गए सभी यौगिकों ने ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु MRSA के विरुद्ध अलग-अलग स्तर का अवरोध दिखाया, जबकि ग्राम-नेगेटिव जीवाणु एस्चेरिचिया कोलाई ने सभी यौगिकों के प्रति पूर्ण प्रतिरोध प्रदर्शित किया। परीक्षण किए गए यौगिकों को MRSA के विरुद्ध अवरोध क्षेत्र के व्यास के आधार पर तीन श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है। पहली श्रेणी सबसे सक्रिय थी और इसमें पाँच यौगिक (6, 7, 10, 13b और 14) शामिल थे। इन यौगिकों के अवरोध क्षेत्र का व्यास लगभग 4 सेमी था; इस श्रेणी में सबसे सक्रिय यौगिक 6 और 13b थे। दूसरी श्रेणी मध्यम रूप से सक्रिय थी और इसमें अन्य पाँच यौगिक (11, 13a, 15, 18 और 19a) शामिल थे। इन यौगिकों का अवरोधन क्षेत्र 3.3 से 3.65 सेमी तक था, जिसमें यौगिक 11 का अवरोधन क्षेत्र सबसे बड़ा (3.65 ± 0.1 सेमी) था। दूसरी ओर, अंतिम समूह में तीन यौगिक (8, 17 और 19b) थे जिनकी रोगाणुरोधी गतिविधि सबसे कम (3 सेमी से कम) थी। चित्र 9 विभिन्न अवरोधन क्षेत्रों के वितरण को दर्शाता है।
परीक्षण किए गए यौगिकों की रोगाणुरोधी गतिविधि की आगे की जांच में प्रत्येक यौगिक के लिए MIC और MBC का निर्धारण शामिल था। परिणाम थोड़े भिन्न थे (जैसा कि सारणी 2, 3 और चित्र 10 (चित्र फ़ाइल देखें) में दिखाया गया है), जिसमें यौगिक 7, 11, 13a और 15 को स्पष्ट रूप से सर्वोत्तम यौगिकों के रूप में पुनः वर्गीकृत किया गया। इन यौगिकों के MIC और MBC मान समान रूप से सबसे कम (39.06 μg/100 μL) थे। यद्यपि यौगिक 7 और 8 के MIC मान कम (9.7 μg/100 μL) थे, लेकिन उनके MBC मान अधिक (78.125 μg/100 μL) थे। इसलिए, उन्हें पहले उल्लेखित यौगिकों की तुलना में कमजोर माना गया। हालांकि, ये छह यौगिक परीक्षण किए गए यौगिकों में सबसे प्रभावी थे, क्योंकि उनके MBC मान 100 μg/100 μL से कम थे।
अन्य परीक्षण किए गए यौगिकों की तुलना में यौगिक (10, 14, 18 और 19b) कम सक्रिय थे क्योंकि उनके MBC मान 156 से 312 μg/100 μL के बीच थे। दूसरी ओर, यौगिक (8, 17 और 19a) सबसे कम आशाजनक थे क्योंकि उनके MBC मान सबसे अधिक थे (क्रमशः 625, 625 और 1250 μg/100 μL)।
अंत में, तालिका 3 में दर्शाए गए सहनशीलता स्तरों के अनुसार, परीक्षण किए गए यौगिकों को उनकी क्रियाविधि के आधार पर दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: जीवाणुनाशक प्रभाव वाले यौगिक (7, 8, 10, 11, 13a, 15, 18, 19b) और जीवाणुरोधी प्रभाव वाले यौगिक (6, 13b, 14, 17, 19a)। इनमें से, यौगिक 7, 11, 13a और 15 को प्राथमिकता दी जाती है, जो बहुत कम सांद्रता (39.06 μg/100 μL) पर जीवाणुनाशक गतिविधि प्रदर्शित करते हैं।
जांचे गए तेरह यौगिकों में से दस ने एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी मेथिसिलिन-प्रतिरोधी स्टैफिलोकोकस ऑरियस (MRSA) के खिलाफ क्षमता दिखाई। इसलिए, अधिक एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी रोगजनकों (विशेष रूप से रोगजनक ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया को कवर करने वाले स्थानीय आइसोलेट्स) और रोगजनक यीस्ट के साथ आगे की जांच की सिफारिश की जाती है, साथ ही प्रत्येक यौगिक की सुरक्षा का आकलन करने के लिए साइटोटॉक्सिक परीक्षण भी किया जाना चाहिए।
मेथिसिलिन-प्रतिरोधी स्टैफिलोकोकस ऑरियस (MRSA) में पेनिसिलिन-बाइंडिंग प्रोटीन 2a (PBP2a) के अवरोधक के रूप में संश्लेषित यौगिकों की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए आणविक डॉकिंग अध्ययन किए गए। PBP2a जीवाणु कोशिका भित्ति के जैवसंश्लेषण में शामिल एक प्रमुख एंजाइम है, और इस एंजाइम का अवरोध कोशिका भित्ति निर्माण में बाधा डालता है, जिसके परिणामस्वरूप अंततः जीवाणु का विघटन और कोशिका मृत्यु होती है। डॉकिंग परिणाम तालिका 4 में सूचीबद्ध हैं और पूरक डेटा फ़ाइल में अधिक विस्तार से वर्णित हैं। परिणामों से पता चलता है कि कई यौगिकों ने PBP2a के लिए, विशेष रूप से Lys 273, Lys 316 और Arg 298 जैसे प्रमुख सक्रिय स्थल अवशेषों के लिए, प्रबल बंधन क्षमता प्रदर्शित की। हाइड्रोजन बॉन्डिंग और π-स्टैकिंग सहित अंतःक्रियाएं सह-क्रिस्टलीकृत क्विनाज़ोलिनोन लिगैंड (CCL) के समान थीं, जो इन यौगिकों की शक्तिशाली अवरोधक के रूप में क्षमता को दर्शाती हैं।
आणविक डॉकिंग डेटा, अन्य कम्प्यूटेशनल मापदंडों के साथ, इस बात का प्रबल संकेत देता है कि PBP2a अवरोध इन यौगिकों की देखी गई जीवाणुरोधी गतिविधि के लिए जिम्मेदार प्रमुख तंत्र था। डॉकिंग स्कोर और रूट मीन स्क्वायर डेविएशन (RMSD) मानों ने बंधन आत्मीयता और स्थिरता को और अधिक स्पष्ट किया, जिससे इस परिकल्पना का समर्थन होता है। जैसा कि तालिका 4 में दिखाया गया है, जबकि कई यौगिकों ने अच्छी बंधन आत्मीयता प्रदर्शित की, कुछ यौगिकों (जैसे, 7, 9, 10 और 14) के डॉकिंग स्कोर सह-क्रिस्टलीकृत लिगैंड की तुलना में अधिक थे, जो दर्शाता है कि PBP2a के सक्रिय स्थल अवशेषों के साथ उनकी मजबूत अंतःक्रिया हो सकती है। हालांकि, सबसे अधिक जैवसक्रिय यौगिक 6 और 13b ने अन्य लिगैंड्स की तुलना में थोड़े कम डॉकिंग स्कोर (क्रमशः -5.98 और -5.63) दिखाए। इससे पता चलता है कि यद्यपि डॉकिंग स्कोर का उपयोग बंधन आत्मीयता की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है, अन्य कारक (जैसे, लिगैंड स्थिरता और जैविक वातावरण में आणविक अंतःक्रिया) भी जीवाणुरोधी गतिविधि को निर्धारित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। विशेष रूप से, सभी संश्लेषित यौगिकों के RMSD मान 2 Å से कम थे, जो इस बात की पुष्टि करते हैं कि उनके डॉकिंग पोज़ सह-क्रिस्टलीकृत लिगैंड के बंधन विन्यास के साथ संरचनात्मक रूप से सुसंगत हैं, जो शक्तिशाली PBP2a अवरोधक के रूप में उनकी क्षमता का और समर्थन करते हैं।
हालांकि डॉकिंग स्कोर और आरएमएस मान उपयोगी पूर्वानुमान प्रदान करते हैं, लेकिन इन डॉकिंग परिणामों और रोगाणुरोधी गतिविधि के बीच संबंध पहली नज़र में हमेशा स्पष्ट नहीं होता है। यद्यपि पीबीपी2ए अवरोध को रोगाणुरोधी गतिविधि को प्रभावित करने वाले एक प्रमुख कारक के रूप में दृढ़ता से समर्थित किया जाता है, फिर भी कई अंतर यह संकेत देते हैं कि अन्य जैविक गुण भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यौगिक 6 और 13बी ने उच्चतम रोगाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित की, जिसमें अवरोध क्षेत्र का व्यास 4 सेमी था और एमआईसी (9.7 μg/100 μL) और एमबीसी (78.125 μg/100 μL) मान सबसे कम थे, इसके बावजूद कि यौगिक 7, 9, 10 और 14 की तुलना में उनके डॉकिंग स्कोर कम थे। इससे पता चलता है कि यद्यपि पीबीपी2ए अवरोध रोगाणुरोधी गतिविधि में योगदान देता है, फिर भी बैक्टीरिया के वातावरण में घुलनशीलता, जैव उपलब्धता और अंतःक्रियात्मक गतिशीलता जैसे कारक भी समग्र गतिविधि को प्रभावित करते हैं। चित्र 11 में उनके डॉकिंग पोज़ दिखाए गए हैं, जिससे पता चलता है कि अपेक्षाकृत कम बाइंडिंग स्कोर होने के बावजूद, दोनों यौगिक PBP2a के प्रमुख अवशेषों के साथ परस्पर क्रिया करने में सक्षम हैं, जिससे अवरोधक कॉम्प्लेक्स को संभावित रूप से स्थिरता मिलती है। इससे यह स्पष्ट होता है कि हालांकि मॉलिक्यूलर डॉकिंग PBP2a अवरोधन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है, इन यौगिकों के वास्तविक रोगाणुरोधी प्रभावों को पूरी तरह से समझने के लिए अन्य जैविक कारकों पर भी विचार करना आवश्यक है।
पीबीपी2ए (पीडीबी आईडी: 4सीजेएन) की क्रिस्टल संरचना का उपयोग करते हुए, मेथिसिलिन-प्रतिरोधी स्टैफिलोकोकस ऑरियस (एमआरएसए) के पेनिसिलिन-बाइंडिंग प्रोटीन 2ए (पीबीपी2ए) के साथ डॉक किए गए सबसे सक्रिय यौगिकों 6 और 13बी के 2डी और 3डी इंटरैक्शन मैप तैयार किए गए। ये मैप इन यौगिकों के पुनः डॉक किए गए सह-क्रिस्टलीकृत क्विनाज़ोलिनोन लिगैंड (सीसीएल) के साथ इंटरैक्शन पैटर्न की तुलना करते हैं, जिसमें हाइड्रोजन बॉन्डिंग, π-स्टैकिंग और आयनिक इंटरैक्शन जैसे प्रमुख इंटरैक्शन को उजागर किया गया है।
यौगिक 7 के लिए भी ऐसा ही पैटर्न देखा गया, जिसका डॉकिंग स्कोर अपेक्षाकृत उच्च (-6.32) था और अवरोध क्षेत्र का व्यास (3.9 सेमी) यौगिक 10 के समान था। हालांकि, इसका एमआईसी (39.08 μg/100 μL) और एमबीसी (39.06 μg/100 μL) काफी अधिक था, जिससे पता चलता है कि जीवाणुरोधी प्रभाव दिखाने के लिए इसे उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है। इससे यह संकेत मिलता है कि यद्यपि यौगिक 7 ने डॉकिंग अध्ययनों में मजबूत बंधन क्षमता दिखाई, फिर भी जैव उपलब्धता, कोशिकीय अवशोषण या अन्य भौतिक रासायनिक गुण इसकी जैविक प्रभावकारिता को सीमित कर सकते हैं। यद्यपि यौगिक 7 में जीवाणुनाशक गुण थे, फिर भी यह यौगिक 6 और 13b की तुलना में जीवाणु वृद्धि को रोकने में कम प्रभावी था।
यौगिक 10 ने उच्चतम डॉकिंग स्कोर (-6.40) के साथ अधिक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया, जो PBP2a के प्रति मजबूत बंधन क्षमता को दर्शाता है। हालांकि, इसके अवरोध क्षेत्र का व्यास (3.9 सेमी) यौगिक 7 के समान था, और इसका MBC (312 μg/100 μL) यौगिक 6, 7 और 13b की तुलना में काफी अधिक था, जो कमजोर जीवाणुनाशक गतिविधि को दर्शाता है। इससे पता चलता है कि अच्छे डॉकिंग अनुमानों के बावजूद, यौगिक 10 अन्य सीमित कारकों जैसे घुलनशीलता, स्थिरता या जीवाणु झिल्ली की कम पारगम्यता के कारण MRSA को मारने में कम प्रभावी था। ये परिणाम इस बात की पुष्टि करते हैं कि यद्यपि PBP2a अवरोध जीवाणुरोधी गतिविधि में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, यह परीक्षण किए गए यौगिकों के बीच देखी गई जैविक गतिविधि में अंतर को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं करता है। ये अंतर बताते हैं कि इसमें शामिल जीवाणुरोधी तंत्रों को पूरी तरह से समझने के लिए आगे के प्रायोगिक विश्लेषण और गहन जैविक मूल्यांकन की आवश्यकता है।
तालिका 4 और पूरक डेटा फ़ाइल में दिए गए आणविक डॉकिंग परिणाम डॉकिंग स्कोर और रोगाणुरोधी गतिविधि के बीच जटिल संबंध को उजागर करते हैं। यद्यपि यौगिक 6 और 13b के डॉकिंग स्कोर यौगिक 7, 9, 10 और 14 की तुलना में कम हैं, फिर भी वे उच्चतम रोगाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित करते हैं। उनके अंतःक्रिया मानचित्र (चित्र 11 में दर्शाए गए) बताते हैं कि कम बंधन स्कोर होने के बावजूद, वे PBP2a के प्रमुख अवशेषों के साथ महत्वपूर्ण हाइड्रोजन बंध और π-स्टैकिंग अंतःक्रियाएँ बनाते हैं जो एंजाइम-अवरोधक परिसर को जैविक रूप से लाभकारी तरीके से स्थिर कर सकते हैं। 6 और 13b के अपेक्षाकृत कम डॉकिंग स्कोर के बावजूद, उनकी बढ़ी हुई रोगाणुरोधी गतिविधि से पता चलता है कि अवरोधक क्षमता का आकलन करते समय घुलनशीलता, स्थिरता और कोशिकीय अवशोषण जैसे अन्य गुणों को डॉकिंग डेटा के साथ-साथ ध्यान में रखा जाना चाहिए। यह नए यौगिकों की चिकित्सीय क्षमता का सटीक आकलन करने के लिए डॉकिंग अध्ययनों को प्रायोगिक रोगाणुरोधी विश्लेषण के साथ संयोजित करने के महत्व को दर्शाता है।
इन परिणामों से यह स्पष्ट होता है कि यद्यपि आणविक डॉकिंग बंधन आत्मीयता का पूर्वानुमान लगाने और अवरोध के संभावित तंत्रों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, फिर भी रोगाणुरोधी प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए इस पर पूरी तरह से निर्भर नहीं रहना चाहिए। आणविक डेटा से पता चलता है कि PBP2a अवरोध रोगाणुरोधी गतिविधि को प्रभावित करने वाला एक प्रमुख कारक है, लेकिन जैविक गतिविधि में परिवर्तन से संकेत मिलता है कि चिकित्सीय प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए अन्य भौतिक रासायनिक और औषधीय गुणों को अनुकूलित करना आवश्यक है। भविष्य के अध्ययनों को यौगिक 7 और 10 की रासायनिक संरचना को अनुकूलित करने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए ताकि जैव उपलब्धता और कोशिकीय अवशोषण में सुधार हो सके और यह सुनिश्चित किया जा सके कि मजबूत डॉकिंग अंतःक्रियाएं वास्तविक रोगाणुरोधी गतिविधि में परिवर्तित हों। अतिरिक्त जैव परीक्षण और संरचना-गतिविधि संबंध (SAR) विश्लेषण सहित आगे के अध्ययन, इन यौगिकों के PBP2a अवरोधक के रूप में कार्य करने के तरीके को समझने और अधिक प्रभावी रोगाणुरोधी एजेंट विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण होंगे।
3-(एंथ्रासेन-9-वाईएल)-2-सायनोएक्रिलोइल क्लोराइड 4 से संश्लेषित यौगिकों ने विभिन्न स्तरों की रोगाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित की, जिनमें से कई यौगिकों ने मेथिसिलिन-प्रतिरोधी स्टैफिलोकोकस ऑरियस (MRSA) के महत्वपूर्ण अवरोधन को दर्शाया। संरचना-गतिविधि संबंध (SAR) विश्लेषण ने इन यौगिकों की रोगाणुरोधी प्रभावकारिता के अंतर्निहित प्रमुख संरचनात्मक विशेषताओं को उजागर किया।
एक्रिलोनाइट्राइल और एंथ्रासीन दोनों समूहों की उपस्थिति रोगाणुरोधी गतिविधि को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण सिद्ध हुई। एक्रिलोनाइट्राइल में मौजूद अत्यधिक प्रतिक्रियाशील नाइट्राइल समूह जीवाणु प्रोटीन के साथ परस्पर क्रिया को सुगम बनाने के लिए आवश्यक है, जिससे यौगिक के रोगाणुरोधी गुणों में योगदान होता है। एक्रिलोनाइट्राइल और एंथ्रासीन दोनों युक्त यौगिकों ने लगातार अधिक मजबूत रोगाणुरोधी प्रभाव प्रदर्शित किए। एंथ्रासीन समूह की एरोमैटिसिटी ने इन यौगिकों को और अधिक स्थिर किया, जिससे संभवतः उनकी जैविक गतिविधि में वृद्धि हुई।
विषमचक्रीय वलयों के समावेश से कई व्युत्पन्न यौगिकों की जीवाणुरोधी प्रभावकारिता में उल्लेखनीय सुधार हुआ। विशेष रूप से, बेंज़ोथियाज़ोल व्युत्पन्न 13b और एक्रिलहाइड्राज़ाइड व्युत्पन्न 6 ने लगभग 4 सेमी के अवरोध क्षेत्र के साथ उच्चतम जीवाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित की। इन विषमचक्रीय व्युत्पन्न यौगिकों ने अधिक महत्वपूर्ण जैविक प्रभाव दिखाए, जो यह दर्शाता है कि विषमचक्रीय संरचना जीवाणुरोधी प्रभावों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसी प्रकार, यौगिक 9 में पाइरिमिडिनथियोन, यौगिक 10 में थियोपाइराज़ोल और यौगिक 11 में टेट्राज़ीन वलय ने यौगिकों के जीवाणुरोधी गुणों में योगदान दिया, जो विषमचक्रीय संशोधन के महत्व को और अधिक उजागर करता है।
संश्लेषित यौगिकों में से, यौगिक 6 और 13b अपनी उत्कृष्ट जीवाणुरोधी गतिविधियों के लिए विशेष रूप से उल्लेखनीय थे। यौगिक 6 की न्यूनतम अवरोधक सांद्रता (MIC) 9.7 μg/100 μL थी, और न्यूनतम जीवाणुनाशक सांद्रता (MBC) 78.125 μg/100 μL थी, जो मेथिसिलिन-प्रतिरोधी स्टैफिलोकोकस ऑरियस (MRSA) को नष्ट करने की इसकी उत्कृष्ट क्षमता को दर्शाती है। इसी प्रकार, यौगिक 13b का अवरोध क्षेत्र 4 सेमी था और इसके MIC और MBC मान कम थे, जो इसकी प्रबल जीवाणुरोधी गतिविधि की पुष्टि करते हैं। ये परिणाम इन यौगिकों की जैव-प्रभावकारिता निर्धारित करने में एक्रिलोहाइड्राजाइड और बेंजोथियाज़ोल कार्यात्मक समूहों की महत्वपूर्ण भूमिका को उजागर करते हैं।
इसके विपरीत, यौगिक 7, 10 और 14 ने मध्यम जीवाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित की, जिनके अवरोध क्षेत्र 3.65 से 3.9 सेमी तक थे। इन यौगिकों को जीवाणुओं को पूरी तरह से नष्ट करने के लिए उच्च सांद्रता की आवश्यकता थी, जैसा कि उनके अपेक्षाकृत उच्च एमआईसी और एमबीसी मानों से स्पष्ट होता है। यद्यपि ये यौगिक, यौगिक 6 और 13बी की तुलना में कम सक्रिय थे, फिर भी उन्होंने महत्वपूर्ण जीवाणुरोधी क्षमता दिखाई, जिससे पता चलता है कि विषमचक्रीय वलय में एक्रिलोनाइट्राइल और एंथ्रासीन अंशों का समावेश उनके जीवाणुरोधी प्रभाव में योगदान देता है।
इन यौगिकों की क्रियाविधि भिन्न-भिन्न है, कुछ जीवाणुनाशक गुण प्रदर्शित करते हैं और कुछ जीवाणु अवरोधक प्रभाव दिखाते हैं। यौगिक 7, 11, 13a और 15 जीवाणुनाशक हैं और जीवाणुओं को पूर्णतः नष्ट करने के लिए कम सांद्रता की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, यौगिक 6, 13b और 14 जीवाणु अवरोधक हैं और कम सांद्रता पर जीवाणुओं की वृद्धि को रोक सकते हैं, लेकिन जीवाणुओं को पूर्णतः नष्ट करने के लिए अधिक सांद्रता की आवश्यकता होती है।
कुल मिलाकर, संरचना-गतिविधि संबंध विश्लेषण से महत्वपूर्ण जीवाणुरोधी गतिविधि प्राप्त करने के लिए एक्रिलोनाइट्राइल और एंथ्रासीन घटकों तथा विषमचक्रीय संरचनाओं को शामिल करने के महत्व पर प्रकाश डाला गया है। ये परिणाम बताते हैं कि इन संरचनात्मक घटकों का अनुकूलन और घुलनशीलता तथा झिल्ली पारगम्यता में सुधार के लिए आगे के संशोधनों की खोज से अधिक प्रभावी MRSA-रोधी दवाओं के विकास में मदद मिल सकती है।
सभी अभिकर्मकों और विलायकों को मानक प्रक्रियाओं (अल गोम्हूरिया, मिस्र) का उपयोग करके शुद्ध और सुखाया गया। गलनांक गैलेनकैंप इलेक्ट्रॉनिक गलनांक उपकरण का उपयोग करके निर्धारित किए गए और बिना किसी संशोधन के रिपोर्ट किए गए। अवरक्त (IR) स्पेक्ट्रा (cm⁻1) ऐन शम्स विश्वविद्यालय के विज्ञान संकाय के रसायन विभाग में थर्मो इलेक्ट्रॉन निकोलेट iS10 FTIR स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) पर पोटेशियम ब्रोमाइड (KBr) पेलेट्स का उपयोग करके रिकॉर्ड किए गए।
1H NMR स्पेक्ट्रा 300 मेगाहर्ट्ज पर जेमिनी NMR स्पेक्ट्रोमीटर (जेमिनी मैन्युफैक्चरिंग एंड इंजीनियरिंग, अनाहेम, कैलिफोर्निया, यूएसए) और ब्रूकर 300 मेगाहर्ट्ज NMR स्पेक्ट्रोमीटर (ब्रूकर मैन्युफैक्चरिंग एंड इंजीनियरिंग, इंक.) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे। टेट्रामेथिलसिलैन (टीएमएस) को ड्यूटेरेटेड डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ-डी₆) के साथ आंतरिक मानक के रूप में उपयोग किया गया था। NMR माप काहिरा विश्वविद्यालय, विज्ञान संकाय, गीज़ा, मिस्र में किए गए थे। मौलिक विश्लेषण (सीएचएन) पर्किन-एल्मर 2400 मौलिक विश्लेषक का उपयोग करके किया गया था और प्राप्त परिणाम परिकलित मानों के साथ अच्छी तरह से मेल खाते हैं।
अम्ल 3 (5 मिमोल) और थायोनिल क्लोराइड (5 मिली) के मिश्रण को 65 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे तक जल स्नान में गर्म किया गया। अतिरिक्त थायोनिल क्लोराइड को कम दाब पर आसवन द्वारा हटा दिया गया। परिणामी लाल ठोस को एकत्र किया गया और बिना किसी और शुद्धिकरण के उपयोग किया गया। गलनांक: 200-202 डिग्री सेल्सियस, उपज: 88.5%। आईआर (केबीआर, ν, सेमी−1): 2224 (सी≡एन), 1737 (सी=ओ)। 1एच-एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, डीएमएसओ-डी6) δ (पीपीएम): 9.26 (एस, 1एच, सीएच=), 7.27-8.57 (एम, 9एच, हेट्रोएरोमैटाइजेशन)। 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 115.11 (C≡N), 124.82–130.53 (CH एंथ्रासीन), 155.34, 114.93 (CH=C–C=O), 162.22 (C=O); HRMS (ESI) m/z [M + H]+: 291.73111. विश्लेषक. C18H10ClNO (291.73) के लिए परिकलित: C, 74.11; H, 3.46; N, 4.80. प्राप्त: C, 74.41; H, 3.34; N, 4.66%.
0°C पर, यौगिक 4 (2 mmol, 0.7 g) को निर्जल डाइऑक्सेन (20 ml) में घोला गया और उसमें हाइड्रजीन हाइड्रेट (2 mmol, 0.16 ml, 80%) बूंद-बूंद करके मिलाया गया तथा 1 घंटे तक हिलाया गया। अवक्षेपित ठोस को छानकर एकत्रित किया गया और एथेनॉल से क्रिस्टलीकृत करके यौगिक 6 प्राप्त किया गया।
हरे क्रिस्टल, गलनांक 190-192℃, उपज 69.36%; IR (KBr) ν=3424 (NH), 2228 (C≡N), 1720 (C=O), 1621 (C=N) cm−1. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 9.3 (br s, H, NH, विनिमय योग्य), 7.69-8.51 (m, 18H, हेट्रोएरोमैटिक), 9.16 (s, 1H, CH=), 8.54 (s, 1H, CH=); C33H21N3O (475.53) के लिए परिकलित मान: C, 83.35; H, 4.45; N, 8.84. प्राप्त: C, 84.01; H, 4.38; एन, 8.05%।
4 (2 मिमोल, 0.7 ग्राम) को 20 मिलीलीटर निर्जल डाइऑक्सेन विलयन (जिसमें ट्राईएथिलामाइन की कुछ बूंदें हों) में घोलें, फेनिलहाइड्राज़ीन/2-अमीनोपाइरिडीन (2 मिमोल) मिलाएं और कमरे के तापमान पर क्रमशः 1 और 2 घंटे तक हिलाएं। अभिक्रिया मिश्रण को बर्फ या पानी में डालें और तनु हाइड्रोक्लोरिक अम्ल से अम्लीकृत करें। पृथक ठोस को छान लें और एथेनॉल से क्रिस्टलीकरण करके 7 प्राप्त करें तथा बेंजीन से क्रिस्टलीकरण करके 8 प्राप्त करें।
हरे क्रिस्टल, गलनांक 160-162℃, उपज 77%; IR (KBr, ν, cm−1): 3245 (NH), 2222 (C≡N), 1691 (C=O), 1671 (C=O) cm−1. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm): 10.88 (s, 1H, NH, विनिमय योग्य), 9.15 (s, 1H, CH=), 8.81 (s, 1H, CH=), 6.78-8.58 (m, 23H, हेट्रोएरोमैटिक); C42H26N4O2 (618.68) के लिए परिकलित मान: C, 81.54; H, 4.24; N, 9.06. प्राप्त: C, 81.96; एच, 3.91; एन, 8.91%।
4 (2 mmol, 0.7 g) को 20 ml निर्जल डाइऑक्सेन विलयन (जिसमें ट्राईएथिलामाइन की कुछ बूंदें थीं) में घोला गया, 2-अमीनोपाइरीडीन (2 mmol, 0.25 g) मिलाया गया और मिश्रण को कमरे के तापमान पर 2 घंटे तक हिलाया गया। अभिक्रिया मिश्रण को बर्फ के पानी में डाला गया और तनु हाइड्रोक्लोरिक अम्ल से अम्लीकृत किया गया। बने हुए अवक्षेप को छानकर बेंजीन से पुनः क्रिस्टलीकृत किया गया, जिससे 8 के हरे क्रिस्टल प्राप्त हुए जिनका गलनांक 146-148 °C और उपज 82.5% थी; अवरक्त स्पेक्ट्रम (KBr) ν: 3148 (NH), 2222 (C≡N), 1665 (C=O) cm−1. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm): 8.78 (s, H, NH, विनिमय योग्य), 9.14 (s, 1H, CH=), 7.36-8.55 (m, 13H, हेट्रोएरोमैटाइजेशन); C23H15N3O (348.38) के लिए परिकलित: C, 79.07; H, 4.33; N, 12.03. प्राप्त: C, 78.93; H, 3.97; N, 12.36%.
यौगिक 4 (2 मिमोल, 0.7 ग्राम) को 20 मिलीलीटर शुष्क डाइऑक्सेन (जिसमें ट्राईएथिलामाइन की कुछ बूंदें और 2 मिमोल थायोयूरिया/सेमीकार्बाज़ाइड मिला हुआ था) में घोला गया और 2 घंटे तक रिफ्लक्स के तहत गर्म किया गया। विलायक को निर्वात में वाष्पीकृत किया गया। अवशेष को डाइऑक्सेन से क्रिस्टलीकृत करके एक मिश्रण प्राप्त किया गया।