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हाइड्रोजन सल्फाइड (H2S) का मानव शरीर पर कई शारीरिक और रोगात्मक प्रभाव होते हैं। सोडियम हाइड्रोसल्फाइड (NaHS) का व्यापक रूप से जैविक प्रयोगों में H2S के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक औषधीय उपकरण के रूप में उपयोग किया जाता है। हालांकि NaHS विलयनों से H2S का निकलना कुछ ही मिनटों में हो जाता है, फिर भी कुछ पशु अध्ययनों में पीने के पानी में H2S के लिए दाता यौगिक के रूप में NaHS विलयनों का उपयोग किया गया है। इस अध्ययन में यह जांच की गई कि क्या चूहों/माउस की बोतलों में तैयार किया गया 30 μM NaHS सांद्रता वाला पीने का पानी कम से कम 12-24 घंटे तक स्थिर रह सकता है, जैसा कि कुछ लेखकों ने सुझाव दिया है। पीने के पानी में NaHS (30 μM) का घोल तैयार करें और इसे तुरंत चूहों/माउस की पानी की बोतलों में डालें। मेथिलीन ब्लू विधि का उपयोग करके सल्फाइड की मात्रा मापने के लिए 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 और 24 घंटे पर पानी की बोतल के ऊपरी सिरे और अंदर से नमूने एकत्र किए गए। इसके अतिरिक्त, नर और मादा चूहों को दो सप्ताह तक NaHS (30 μM) का इंजेक्शन दिया गया और पहले सप्ताह के दौरान हर दूसरे दिन और दूसरे सप्ताह के अंत में सीरम सल्फाइड सांद्रता को मापा गया। पानी की बोतल के ऊपरी सिरे से लिए गए नमूने में NaHS घोल अस्थिर था; यह 12 और 24 घंटे बाद क्रमशः 72% और 75% तक कम हो गया। पानी की बोतलों के अंदर से लिए गए नमूनों में, 2 घंटे के भीतर NaHS में कमी महत्वपूर्ण नहीं थी; हालांकि, यह 12 और 24 घंटे बाद क्रमशः 47% और 72% तक कम हो गया। NaHS इंजेक्शन ने नर और मादा चूहों के सीरम सल्फाइड स्तर को प्रभावित नहीं किया। निष्कर्षतः, पीने के पानी से तैयार किए गए NaHS घोल का उपयोग H2S दान के लिए नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि यह घोल अस्थिर है। इस प्रकार से देने पर जानवरों को NaHS की अनियमित और अपेक्षा से कम मात्रा प्राप्त होगी।
हाइड्रोजन सल्फाइड (H2S) का उपयोग सन् 1700 से विषैले पदार्थ के रूप में किया जाता रहा है; हालाँकि, अंतर्जात जैवसंकेत अणु के रूप में इसकी संभावित भूमिका का वर्णन आबे और किमुरा ने 1996 में किया था। पिछले तीन दशकों में, विभिन्न मानव प्रणालियों में H2S के कई कार्यों को स्पष्ट किया गया है, जिससे यह अहसास हुआ है कि H2S दाता अणुओं का कुछ रोगों के उपचार या प्रबंधन में नैदानिक ​​अनुप्रयोग हो सकता है; हाल ही में प्रकाशित समीक्षा के लिए चिरिनो एट अल. देखें।
सोडियम हाइड्रोसल्फाइड (NaHS) का व्यापक रूप से कई सेल कल्चर और पशु अध्ययनों में H2S के प्रभावों का आकलन करने के लिए एक औषधीय उपकरण के रूप में उपयोग किया जाता रहा है5,6,7,8। हालांकि, NaHS एक आदर्श H2S दाता नहीं है क्योंकि यह विलयन में तेजी से H2S/HS- में परिवर्तित हो जाता है, पॉलीसल्फाइड से आसानी से दूषित हो जाता है, और आसानी से ऑक्सीकृत और वाष्पीकृत हो जाता है4,9। कई जैविक प्रयोगों में, NaHS को पानी में घोला जाता है, जिसके परिणामस्वरूप निष्क्रिय वाष्पीकरण और H2S की हानि10,11,12, H2S का स्वतः ऑक्सीकरण11,12,13 और प्रकाश अपघटन14 होता है। मूल विलयन में सल्फाइड H2S के वाष्पीकरण के कारण बहुत तेजी से नष्ट हो जाता है11। एक खुले पात्र में, H2S का अर्ध-जीवन (t1/2) लगभग 5 मिनट होता है, और इसकी सांद्रता लगभग 13% प्रति मिनट कम हो जाती है10। हालाँकि NaHS विलयनों से हाइड्रोजन सल्फाइड का निकलना कुछ ही मिनटों में हो जाता है, फिर भी कुछ पशु अध्ययनों में पीने के पानी में हाइड्रोजन सल्फाइड के स्रोत के रूप में NaHS विलयनों का उपयोग 1-21 सप्ताह तक किया गया है, और NaHS युक्त विलयन को हर 12-24 घंटे में बदला गया है।15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 यह पद्धति वैज्ञानिक अनुसंधान के सिद्धांतों के अनुरूप नहीं है, क्योंकि दवाओं की खुराक अन्य प्रजातियों, विशेष रूप से मनुष्यों में उनके उपयोग के आधार पर निर्धारित की जानी चाहिए।27
बायोमेडिसिन में पूर्व-नैदानिक ​​अनुसंधान का उद्देश्य रोगी देखभाल की गुणवत्ता या उपचार परिणामों में सुधार करना है। हालांकि, अधिकांश पशु अध्ययनों के परिणाम अभी तक मनुष्यों पर लागू नहीं किए गए हैं28,29,30। इस अनुवाद संबंधी विफलता का एक कारण पशु अध्ययनों की कार्यप्रणालीगत गुणवत्ता पर ध्यान न देना है30। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य यह जांचना था कि क्या चूहे/माउस की पानी की बोतलों में तैयार किए गए 30 μM NaHS घोल पीने के पानी में 12-24 घंटे तक स्थिर रह सकते हैं, जैसा कि कुछ अध्ययनों में दावा या सुझाव दिया गया है।
इस अध्ययन में किए गए सभी प्रयोग ईरान में प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए प्रकाशित दिशानिर्देशों31 के अनुसार आयोजित किए गए थे। इस अध्ययन की सभी प्रायोगिक रिपोर्टों में ARRIVE दिशानिर्देशों32 का भी पालन किया गया था। शाहिद बेहेश्टी यूनिवर्सिटी ऑफ मेडिकल साइंसेज के एंडोक्राइन साइंसेज संस्थान की नैतिकता समिति ने इस अध्ययन में सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को मंजूरी दी थी।
जिंक एसीटेट डाइहाइड्रेट (CAS: 5970-45-6) और निर्जल फेरिक क्लोराइड (CAS: 7705-08-0) बायोकेम, केमोफार्मा (कोस्ने-सुर-लोइरे, फ्रांस) से खरीदे गए थे। सोडियम हाइड्रोसल्फाइड हाइड्रेट (CAS: 207683-19-0) और एन,एन-डाइमिथाइल-पी-फेनिलडायमाइन (DMPD) (CAS: 535-47-0) सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, मिसौरी, यूएसए) से खरीदे गए थे। आइसोफ्लुरेन पिरामल (बेथलहम, पेंसिल्वेनिया, यूएसए) से खरीदा गया था। हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) मर्क (डार्मस्टेड, जर्मनी) से खरीदा गया था।
पीने के पानी में NaHS (30 μM) का घोल तैयार करें और इसे तुरंत चूहे/माउस की पानी की बोतलों में डाल दें। यह सांद्रता H2S के स्रोत के रूप में NaHS का उपयोग करने वाले कई प्रकाशनों के आधार पर चुनी गई थी; चर्चा अनुभाग देखें। NaHS एक हाइड्रेटेड अणु है जिसमें जलयोजन जल की अलग-अलग मात्रा हो सकती है (अर्थात, NaHS•xH2O); निर्माता के अनुसार, हमारे अध्ययन में उपयोग किए गए NaHS का प्रतिशत 70.7% (अर्थात, NaHS•1.3 H2O) था, और हमने अपनी गणनाओं में इस मान को ध्यान में रखा, जहाँ हमने 56.06 g/mol के आणविक भार का उपयोग किया, जो निर्जल NaHS का आणविक भार है। जलयोजन जल (जिसे क्रिस्टलीकरण जल भी कहा जाता है) वे जल अणु हैं जो क्रिस्टलीय संरचना बनाते हैं33। हाइड्रेट्स के भौतिक और ऊष्मागतिक गुण निर्जलों से भिन्न होते हैं34।
पीने के पानी में NaHS मिलाने से पहले, विलायक का pH और तापमान माप लें। NaHS घोल को तुरंत पशु पिंजरे में रखे चूहे/माउस के पानी की बोतल में डालें। सल्फाइड की मात्रा मापने के लिए 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 और 24 घंटे पर बोतल के ऊपरी सिरे और अंदर से नमूने लिए गए। प्रत्येक नमूने के तुरंत बाद सल्फाइड का माप लिया गया। हमने ट्यूब के ऊपरी सिरे से नमूने लिए क्योंकि कुछ अध्ययनों से पता चला है कि पानी की ट्यूब के छोटे छिद्र H2S के वाष्पीकरण को कम कर सकते हैं15,19। यह बात बोतल में मौजूद घोल पर भी लागू होती है। हालांकि, पानी की बोतल के गले में मौजूद घोल के मामले में ऐसा नहीं था, जिसमें वाष्पीकरण की दर अधिक थी और वह स्वतः ऑक्सीकृत हो रहा था; वास्तव में, जानवरों ने सबसे पहले यही पानी पिया।
इस अध्ययन में नर और मादा विस्टार चूहों का प्रयोग किया गया। चूहों को मानक परिस्थितियों (तापमान 21-26 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता 32-40%) में पॉलीप्रोपाइलीन के पिंजरों (प्रति पिंजरे 2-3 चूहे) में रखा गया, जिसमें 12 घंटे प्रकाश (सुबह 7 बजे से शाम 7 बजे तक) और 12 घंटे अंधेरा (शाम 7 बजे से सुबह 7 बजे तक) था। चूहों को नल का पानी उपलब्ध था और उन्हें मानक चारा (खोरक डैम पार्स कंपनी, तेहरान, ईरान) खिलाया गया। समान आयु (6 महीने) की मादा (n=10, शरीर का वजन: 190-230 ग्राम) और नर (n=10, शरीर का वजन: 320-370 ग्राम) विस्टार चूहों को यादृच्छिक रूप से नियंत्रण और NaHS (30 μM) उपचारित समूहों (प्रति समूह n=5) में विभाजित किया गया। नमूना आकार निर्धारित करने के लिए, हमने KISS (Keep It Simple, Stupid) दृष्टिकोण का उपयोग किया, जो पिछले अनुभव और शक्ति विश्लेषण35 को जोड़ता है। हमने सबसे पहले 3 चूहों पर एक पायलट अध्ययन किया और सीरम में कुल सल्फाइड के औसत स्तर और मानक विचलन (8.1 ± 0.81 μM) का निर्धारण किया। फिर, 80% शक्ति और दो-तरफ़ा 5% सार्थकता स्तर को ध्यान में रखते हुए, हमने एक प्रारंभिक नमूना आकार (पिछले साहित्य के आधार पर n = 5) निर्धारित किया, जो प्रयोगात्मक जानवरों के नमूना आकार की गणना के लिए फेस्टिंग द्वारा सुझाए गए पूर्वनिर्धारित मान 2.02 के मानकीकृत प्रभाव आकार के अनुरूप था।35 इस मान को मानक विचलन (2.02 × 0.81) से गुणा करने पर, अनुमानित पता लगाने योग्य प्रभाव आकार (1.6 μM) 20% था, जो स्वीकार्य है। इसका अर्थ है कि समूहों के बीच 20% औसत परिवर्तन का पता लगाने के लिए n = 5/समूह पर्याप्त है। चूहों को एक्सेल सॉफ़्टवेयर 36 (पूरक चित्र 1) के यादृच्छिक फ़ंक्शन का उपयोग करके नियंत्रण और NaSH-उपचारित समूहों में यादृच्छिक रूप से विभाजित किया गया था। परिणाम स्तर पर ब्लाइंडिंग की गई थी, और जैव रासायनिक माप करने वाले जांचकर्ताओं को समूह आवंटन के बारे में जानकारी नहीं थी।
दोनों लिंगों के NaHS समूहों को पीने के पानी में तैयार किए गए 30 μM NaHS घोल से 2 सप्ताह तक उपचारित किया गया; हर 24 घंटे में ताजा घोल दिया गया, इस दौरान शरीर का वजन मापा गया। पहले और दूसरे सप्ताह के अंत में हर दूसरे दिन आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत सभी चूहों की पूंछ के सिरे से रक्त के नमूने एकत्र किए गए। रक्त के नमूनों को 3000 g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया, सीरम को अलग किया गया और सीरम यूरिया, क्रिएटिनिन (Cr) और कुल सल्फाइड के बाद के मापन के लिए -80°C पर संग्रहित किया गया। सीरम यूरिया का निर्धारण एंजाइमेटिक यूरेज विधि द्वारा किया गया, और सीरम क्रिएटिनिन का निर्धारण फोटोमेट्रिक जैफ विधि द्वारा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (मैन कंपनी, तेहरान, ईरान) और एक स्वचालित विश्लेषक (सेलेक्ट्रा ई, सीरियल नंबर 0-2124, नीदरलैंड) का उपयोग करके किया गया। यूरिया और Cr के लिए इंट्रा- और इंटरएसे गुणांक भिन्नता 2.5% से कम थी।
मेथिलीन ब्लू (एमबी) विधि का उपयोग पीने के पानी और NaHS युक्त सीरम में कुल सल्फाइड को मापने के लिए किया जाता है; एमबी थोक विलयनों और जैविक नमूनों में सल्फाइड मापने की सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधि है11,37। एमबी विधि का उपयोग कुल सल्फाइड पूल का अनुमान लगाने38 और जलीय चरण में H2S, HS- और S2 के रूप में अकार्बनिक सल्फाइड को मापने के लिए किया जा सकता है39। इस विधि में, जिंक एसीटेट की उपस्थिति में सल्फर को जिंक सल्फाइड (ZnS) के रूप में अवक्षेपित किया जाता है11,38। जिंक एसीटेट अवक्षेपण अन्य क्रोमोफोरस से सल्फाइड को अलग करने की सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है11। ZnS को HCl का उपयोग करके प्रबल अम्लीय परिस्थितियों में पुनः घोला गया11। सल्फाइड फेरिक क्लोराइड (Fe3+ ऑक्सीकरण एजेंट के रूप में कार्य करता है) द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया में 1:2 के स्टोइकोमेट्रिक अनुपात में DMPD के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिससे डाई MB बनता है, जिसे 670 nm40,41 पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से पता लगाया जाता है। MB विधि की पता लगाने की सीमा लगभग 1 μM11 है।
इस अध्ययन में, प्रत्येक नमूने (विलयन या सीरम) के 100 μL को एक ट्यूब में डाला गया; फिर उसमें 200 μL जिंक एसीटेट (आसुत जल में 1% w/v), 100 μL DMPD (7.2 M HCl में 20 mM) और 133 μL FeCl3 (1.2 M HCl में 30 mM) मिलाया गया। मिश्रण को 37°C पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। विलयन को 10,000 g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया, और सुपरनेटेंट के अवशोषण को 670 nm पर एक माइक्रोप्लेट रीडर (बायोटेक, MQX2000R2, विनोस्की, VT, USA) का उपयोग करके पढ़ा गया। सल्फाइड सांद्रता को ddH2O में NaHS (0–100 μM) के अंशांकन वक्र का उपयोग करके निर्धारित किया गया (पूरक चित्र 2)। माप के लिए उपयोग किए गए सभी विलयन ताज़ा तैयार किए गए थे। सल्फाइड माप के लिए इंट्रा- और इंटरएसे गुणांक भिन्नता क्रमशः 2.8% और 3.4% थी। हमने फोर्टिफाइड सैंपल विधि42 का उपयोग करके सोडियम थायोसल्फेट युक्त पेयजल और सीरम नमूनों से प्राप्त कुल सल्फाइड की मात्रा भी निर्धारित की। सोडियम थायोसल्फेट युक्त पेयजल और सीरम नमूनों के लिए रिकवरी क्रमशः 91 ± 1.1% (n = 6) और 93 ± 2.4% (n = 6) थी।
सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए विंडोज के लिए ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर संस्करण 8.0.2 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर, सैन डिएगो, कैलिफोर्निया, यूएसए, www.graphpad.com) का उपयोग किया गया। NaHS मिलाने से पहले और बाद में पीने के पानी के तापमान और pH की तुलना करने के लिए युग्मित t-परीक्षण का प्रयोग किया गया। NaHS युक्त घोल में H2S की हानि की गणना आधारभूत अवशोषण से प्रतिशत कमी के रूप में की गई, और यह आकलन करने के लिए कि हानि सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थी या नहीं, हमने एक-तरफ़ा दोहराए गए माप ANOVA और उसके बाद डनेट के बहु-तुलना परीक्षण का प्रयोग किया। शरीर के वजन, सीरम यूरिया, सीरम क्रिएटिनिन और कुल सीरम सल्फाइड की समय के साथ तुलना नियंत्रण और NaHS-उपचारित चूहों के बीच अलग-अलग लिंगों के लिए दो-तरफ़ा मिश्रित (बीच-अंदर) ANOVA और उसके बाद बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग करके की गई। दो-तरफ़ा P मान < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया।
NaHS मिलाने से पहले पीने के पानी का pH 7.60 ± 0.01 था और NaHS मिलाने के बाद यह 7.71 ± 0.03 हो गया (n = 13, p = 0.0029)। पीने के पानी का तापमान 26.5 ± 0.2 था और NaHS मिलाने के बाद घटकर 26.2 ± 0.2 हो गया (n = 13, p = 0.0128)। पीने के पानी में 30 μM NaHS का घोल तैयार करें और इसे पानी की बोतल में भरकर रखें। NaHS का घोल अस्थिर होता है और समय के साथ इसकी सांद्रता कम होती जाती है। पानी की बोतल के गले से नमूना लेने पर, पहले घंटे के भीतर ही सांद्रता में उल्लेखनीय कमी (68.0%) देखी गई, और घोल में NaHS की मात्रा 12 और 24 घंटे बाद क्रमशः 72% और 75% कम हो गई। पानी की बोतलों से प्राप्त नमूनों में, NaHS की मात्रा में कमी 2 घंटे तक उल्लेखनीय नहीं थी, लेकिन 12 और 24 घंटे बाद यह क्रमशः 47% और 72% तक कम हो गई। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि पीने के पानी में तैयार किए गए 30 μM घोल में NaHS का प्रतिशत 24 घंटे बाद प्रारंभिक मान के लगभग एक-चौथाई तक कम हो गया था, चाहे नमूना लेने का स्थान कोई भी हो (चित्र 1)।
चूहे/माउस की बोतलों में पीने के पानी में NaHS घोल (30 μM) की स्थिरता। घोल तैयार करने के बाद, पानी की बोतल के सिरे और अंदर से नमूने लिए गए। डेटा को माध्य ± मानक विचलन (n = 6/समूह) के रूप में प्रस्तुत किया गया है। * और #, समय 0 की तुलना में P < 0.05 दर्शाते हैं। पानी की बोतल की तस्वीर में सिरा (खुले भाग सहित) और बोतल का मुख्य भाग दिखाया गया है। सिरे का आयतन लगभग 740 μL है।
ताज़ा तैयार किए गए 30 μM विलयन में NaHS की सांद्रता 30.3 ± 0.4 μM (सीमा: 28.7–31.9 μM, n = 12) थी। हालाँकि, 24 घंटे बाद, NaHS की सांद्रता घटकर कम हो गई (औसत: 3.0 ± 0.6 μM)। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, अध्ययन अवधि के दौरान चूहों को जिन NaHS सांद्रताओं के संपर्क में लाया गया, वे स्थिर नहीं थीं।
मादा चूहों का शारीरिक वजन समय के साथ काफी बढ़ गया (नियंत्रण समूह में 205.2 ± 5.2 ग्राम से 213.8 ± 7.0 ग्राम और NaHS-उपचारित समूह में 204.0 ± 8.6 ग्राम से 211.8 ± 7.5 ग्राम तक); हालांकि, NaHS उपचार का शारीरिक वजन पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 3)। नर चूहों का शारीरिक वजन भी समय के साथ काफी बढ़ गया (नियंत्रण समूह में 338.6 ± 8.3 ग्राम से 352.4 ± 6.0 ग्राम और NaHS-उपचारित समूह में 352.4 ± 5.9 ग्राम से 363.2 ± 4.3 ग्राम तक); हालांकि, NaHS उपचार का शारीरिक वजन पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 3)।
NaHS (30 μM) देने के बाद मादा और नर चूहों के शारीरिक वजन में परिवर्तन। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया गया है और बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ दो-तरफ़ा मिश्रित (भीतर-बीच) विश्लेषण का उपयोग करके तुलना की गई है। प्रत्येक समूह में प्रत्येक लिंग के 5 चूहे शामिल हैं।
अध्ययन के दौरान, नियंत्रण समूह और NaSH से उपचारित चूहों में सीरम यूरिया और क्रिएटिन फॉस्फेट की सांद्रता लगभग समान थी। इसके अलावा, NaSH उपचार का सीरम यूरिया और क्रिएटिनक्रोम की सांद्रता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा (तालिका 1)।
नियंत्रण समूह और NaHS से उपचारित नर (8.1 ± 0.5 μM बनाम 9.3 ± 0.2 μM) तथा मादा (9.1 ± 1.0 μM बनाम 6.1 ± 1.1 μM) चूहों में आधारभूत सीरम कुल सल्फाइड सांद्रता तुलनीय थी। 14 दिनों तक NaHS देने से नर या मादा चूहों में सीरम कुल सल्फाइड के स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 4)।
NaHS (30 μM) देने के बाद नर और मादा चूहों के सीरम में कुल सल्फाइड सांद्रता में परिवर्तन। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया गया है और बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ दो-तरफ़ा मिश्रित (अंदर-अंदर) विश्लेषण का उपयोग करके तुलना की गई है। प्रत्येक लिंग, n = 5/समूह।
इस अध्ययन का मुख्य निष्कर्ष यह है कि NaHS युक्त पीने का पानी अस्थिर होता है: चूहे/माउस की पानी की बोतलों के ऊपरी सिरे और अंदर से नमूना लेने के 24 घंटे बाद प्रारंभिक कुल सल्फाइड की मात्रा का लगभग एक चौथाई ही पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा, NaHS घोल में H2S की हानि के कारण चूहों को अस्थिर NaHS सांद्रता के संपर्क में लाया गया, और पीने के पानी में NaHS मिलाने से शरीर के वजन, सीरम यूरिया और क्रिएटिन क्रोमियम, या कुल सीरम सल्फाइड पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।
इस अध्ययन में, पीने के पानी में तैयार किए गए 30 μM NaHS विलयनों से H2S की हानि की दर लगभग 3% प्रति घंटा थी। एक बफ़र्ड विलयन (10 mM PBS, pH 7.4 में 100 μM सोडियम सल्फाइड) में, सल्फाइड की सांद्रता 8 घंटे में 7% तक घटने की सूचना दी गई थी11। हमने पहले NaHS के अंतःपेरिटोनियल प्रशासन का समर्थन करते हुए बताया था कि पीने के पानी में 54 μM NaHS विलयन से सल्फाइड की हानि की दर लगभग 2.3% प्रति घंटा थी (तैयारी के बाद पहले 12 घंटों में 4%/घंटा और अंतिम 12 घंटों में 1.4%/घंटा)8। पहले के अध्ययनों43 में NaHS विलयनों से H2S की निरंतर हानि पाई गई, मुख्य रूप से वाष्पीकरण और ऑक्सीकरण के कारण। बुलबुले मिलाए बिना भी, स्टॉक विलयन में सल्फाइड H2S वाष्पीकरण के कारण तेजी से नष्ट हो जाता है11। अध्ययनों से पता चला है कि तनुकरण प्रक्रिया के दौरान, जिसमें लगभग 30-60 सेकंड लगते हैं, वाष्पीकरण के कारण लगभग 5-10% H2S नष्ट हो जाता है।6 विलयन से H2S के वाष्पीकरण को रोकने के लिए, शोधकर्ताओं ने कई उपाय किए हैं, जिनमें विलयन को धीरे से हिलाना12, स्टॉक विलयन को प्लास्टिक फिल्म से ढकना6, और विलयन को हवा के संपर्क में कम से कम रखना शामिल है, क्योंकि H2S वाष्पीकरण की दर वायु-तरल इंटरफ़ेस पर निर्भर करती है।13 H2S का स्वतः ऑक्सीकरण मुख्य रूप से संक्रमण धातु आयनों, विशेष रूप से फेरिक आयरन के कारण होता है, जो पानी में अशुद्धियाँ हैं।13 H2S के ऑक्सीकरण के परिणामस्वरूप पॉलीसल्फाइड (सहसंयोजक बंधों द्वारा जुड़े सल्फर परमाणु) का निर्माण होता है।11 इसके ऑक्सीकरण से बचने के लिए, H2S युक्त विलयनों को ऑक्सीजन रहित विलायकों में तैयार किया जाता है44,45 और फिर ऑक्सीजन की कमी सुनिश्चित करने के लिए 20-30 मिनट तक आर्गन या नाइट्रोजन से शुद्ध किया जाता है।11,12,37,44,45,46 डायथाइलीनट्राइमाइनपेंटाएसिटिक अम्ल (DTPA) एक धातु चेलेटर (10–4 M) है जो वायवीय विलयनों में HS- स्व-ऑक्सीकरण को रोकता है। DTPA की अनुपस्थिति में, 25°C पर लगभग 3 घंटे में HS- की स्व-ऑक्सीकरण दर लगभग 50% होती है37,47। इसके अलावा, चूंकि 1e-सल्फाइड का ऑक्सीकरण पराबैंगनी प्रकाश द्वारा उत्प्रेरित होता है, इसलिए विलयन को बर्फ पर संग्रहित किया जाना चाहिए और प्रकाश से सुरक्षित रखा जाना चाहिए11।
चित्र 5 में दर्शाए अनुसार, NaHS जल में घुलने पर Na+ और HS-6 में विघटित हो जाता है; यह विघटन अभिक्रिया के pK1 द्वारा निर्धारित होता है, जो तापमान पर निर्भर करता है: pK1 = 3.122 + 1132/T, जहाँ T का मान 5 से 30°C तक होता है और इसे केल्विन (K) में मापा जाता है, K = °C + 273.1548। HS- का pK2 मान उच्च होता है (pK2 = 19), इसलिए pH < 96.49 पर S2- का निर्माण नहीं होता है या बहुत कम मात्रा में होता है। इसके विपरीत, HS- एक क्षार के रूप में कार्य करता है और H2O अणु से H+ ग्रहण करता है, तथा H2O एक अम्ल के रूप में कार्य करता है और H2S तथा OH- में परिवर्तित हो जाता है।
NaHS विलयन (30 µM) में घुलित H2S गैस का निर्माण। aq, जलीय विलयन; g, गैस; l, द्रव। सभी गणनाओं में जल का pH = 7.0 और जल का तापमान = 20 °C माना गया है। BioRender.com द्वारा निर्मित।
इस बात के प्रमाण होने के बावजूद कि NaHS विलयन अस्थिर होते हैं, कई पशु अध्ययनों में पीने के पानी में H2S दाता यौगिक के रूप में NaHS विलयन का उपयोग किया गया है15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, और हस्तक्षेप की अवधि 1 से 21 सप्ताह तक रही (तालिका 2)। इन अध्ययनों के दौरान, NaHS विलयन को प्रत्येक 12 घंटे, 15, 17, 18, 24, 25 घंटे या 24 घंटे, 19, 20, 21, 22, 23 घंटे पर बदला गया। हमारे परिणामों से पता चला कि NaHS विलयन से H2S के नुकसान के कारण चूहों को अस्थिर दवा सांद्रता के संपर्क में लाया गया, और चूहों के पीने के पानी में NaHS की मात्रा 12 या 24 घंटों में काफी उतार-चढ़ाव करती रही (चित्र 2 देखें)। इनमें से दो अध्ययनों में बताया गया कि पानी में H2S का स्तर 24 घंटे तक स्थिर रहा²² या 12 घंटे में केवल 2-3% H2S की हानि देखी गई¹⁵, लेकिन उन्होंने सहायक डेटा या माप विवरण प्रदान नहीं किए। दो अध्ययनों से पता चला है कि पानी की बोतलों का छोटा व्यास H2S के वाष्पीकरण को कम कर सकता है¹⁵,¹⁹। हालांकि, हमारे परिणामों से पता चला कि इससे पानी की बोतल से H2S की हानि 12-24 घंटे के बजाय केवल 2 घंटे तक ही विलंबित हो सकती है। दोनों अध्ययनों में यह उल्लेख किया गया है कि हम यह मान रहे हैं कि पीने के पानी में NaHS का स्तर नहीं बदला क्योंकि हमने पानी के रंग में कोई परिवर्तन नहीं देखा; इसलिए, हवा द्वारा H2S का ऑक्सीकरण महत्वपूर्ण नहीं था¹⁹,²⁰। आश्चर्यजनक रूप से, यह व्यक्तिपरक विधि समय के साथ इसकी सांद्रता में परिवर्तन को मापने के बजाय पानी में NaHS की स्थिरता का आकलन करती है।
NaHS विलयन में H2S की हानि pH और तापमान से संबंधित है। जैसा कि हमारे अध्ययन में देखा गया है, पानी में NaHS घोलने से क्षारीय विलयन बनता है50। जब NaHS पानी में घुलता है, तो घुली हुई H2S गैस का निर्माण pH मान पर निर्भर करता है6। विलयन का pH जितना कम होगा, H2S गैस अणुओं के रूप में मौजूद NaHS का अनुपात उतना ही अधिक होगा और जलीय विलयन से सल्फाइड की हानि उतनी ही अधिक होगी11। इनमें से किसी भी अध्ययन में NaHS के लिए विलायक के रूप में उपयोग किए गए पेयजल के pH का उल्लेख नहीं किया गया है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (WHO) की अनुशंसाओं के अनुसार, जिन्हें अधिकांश देशों द्वारा अपनाया गया है, पेयजल का pH 6.5–8.551 की सीमा में होना चाहिए। इस pH सीमा में, H2S के स्वतः ऑक्सीकरण की दर लगभग दस गुना बढ़ जाती है13। इस pH सीमा में पानी में NaHS घोलने से घुली हुई H2S गैस की सांद्रता 1 से 22.5 μM तक हो जाएगी, जो NaHS घोलने से पहले पानी के pH की निगरानी के महत्व पर बल देती है। इसके अतिरिक्त, उपरोक्त अध्ययन में उल्लिखित तापमान सीमा (18-26 डिग्री सेल्सियस) के परिणामस्वरूप विलयन में घुली हुई H2S गैस की सांद्रता में लगभग 10% परिवर्तन होगा, क्योंकि तापमान परिवर्तन pK1 को बदल देता है, और pK1 में छोटे परिवर्तन भी घुली हुई H2S गैस की सांद्रता पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकते हैं48। इसके अतिरिक्त, कुछ अध्ययनों की लंबी अवधि (5 महीने)22, जिसके दौरान तापमान में काफी भिन्नता की उम्मीद होती है, इस समस्या को और भी बढ़ा देती है।
एक अध्ययन को छोड़कर सभी अध्ययनों21 में पीने के पानी में 30 μM NaHS घोल का उपयोग किया गया था। उपयोग की गई खुराक (अर्थात 30 μM) को समझाने के लिए, कुछ लेखकों ने बताया कि जलीय अवस्था में NaHS, H2S गैस की बिल्कुल समान सांद्रता उत्पन्न करता है और H2S की शारीरिक सीमा 10 से 100 μM है, इसलिए यह खुराक शारीरिक सीमा के भीतर है15,16। अन्य लेखकों ने बताया कि 30 μM NaHS, प्लाज्मा में H2S के स्तर को शारीरिक सीमा, अर्थात् 5-300 μM19,20 के भीतर बनाए रख सकता है। हम पानी में NaHS की 30 μM सांद्रता (pH = 7.0, T = 20 °C) पर विचार करते हैं, जिसका उपयोग कुछ अध्ययनों में H2S के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया गया था। हम गणना कर सकते हैं कि घुली हुई H2S गैस की सांद्रता 14.7 μM है, जो प्रारंभिक NaHS सांद्रता का लगभग 50% है। यह मान समान परिस्थितियों में अन्य लेखकों द्वारा गणना किए गए मान के समान है13,48।
हमारे अध्ययन में, NaHS के सेवन से शरीर के वजन में कोई परिवर्तन नहीं हुआ; यह परिणाम नर चूहों22,23 और नर चूहों18 पर किए गए अन्य अध्ययनों के परिणामों के अनुरूप है; हालांकि, दो अध्ययनों में बताया गया है कि NaSH ने नेफ्रेक्टोमाइज्ड चूहों में घटे हुए शरीर के वजन को बहाल किया24,26, जबकि अन्य अध्ययनों में शरीर के वजन पर NaSH के सेवन के प्रभाव की जानकारी नहीं दी गई है15,16,17,19,20,21,25। इसके अलावा, हमारे अध्ययन में, NaSH के सेवन से सीरम यूरिया और क्रिएटिन क्रोमियम के स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, जो एक अन्य रिपोर्ट25 के परिणामों के अनुरूप है।
अध्ययन में पाया गया कि पीने के पानी में 2 सप्ताह तक NaHS मिलाने से नर और मादा चूहों के कुल सीरम सल्फाइड सांद्रता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। यह निष्कर्ष सेन एट अल. (16) के परिणामों के अनुरूप है: पीने के पानी में 30 μM NaHS के साथ 8 सप्ताह के उपचार से नियंत्रण समूह के चूहों के प्लाज्मा सल्फाइड स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा; हालांकि, उन्होंने बताया कि इस हस्तक्षेप से गुर्दे निकाले गए चूहों के प्लाज्मा में घटे हुए H2S स्तर बहाल हो गए। ली एट अल. (22) ने यह भी बताया कि पीने के पानी में 30 μM NaHS के साथ 5 महीने के उपचार से वृद्ध चूहों के प्लाज्मा मुक्त सल्फाइड स्तर में लगभग 26% की वृद्धि हुई। अन्य अध्ययनों में पीने के पानी में NaHS मिलाने के बाद परिसंचारी सल्फाइड में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया है।
सात अध्ययनों में सिग्मा NaHS15,16,19,20,21,22,23 के उपयोग की जानकारी दी गई, लेकिन उनमें जलयोजन जल के बारे में कोई विस्तृत विवरण नहीं दिया गया, और पाँच अध्ययनों में NaHS की तैयारी विधियों में प्रयुक्त स्रोत का उल्लेख नहीं किया गया17,18,24,25,26। NaHS एक जलयोजित अणु है और इसमें जलयोजन जल की मात्रा भिन्न हो सकती है, जिससे किसी दिए गए मोलर सांद्रता का विलयन तैयार करने के लिए आवश्यक NaHS की मात्रा प्रभावित होती है। उदाहरण के लिए, हमारे अध्ययन में NaHS की मात्रा NaHS•1.3 H2O थी। इसलिए, इन अध्ययनों में NaHS की वास्तविक सांद्रता रिपोर्ट की गई सांद्रता से कम हो सकती है।
“इतने कम समय तक रहने वाला यौगिक इतना दीर्घकालिक प्रभाव कैसे डाल सकता है?” पोज़गे एट अल.21 ने चूहों में कोलाइटिस पर NaHS के प्रभावों का मूल्यांकन करते समय यह प्रश्न पूछा। उन्हें उम्मीद है कि भविष्य के अध्ययन इस प्रश्न का उत्तर दे पाएंगे और उनका अनुमान है कि NaHS के प्रभाव को मध्यस्थ करने वाले H2S और डाइसल्फाइड के अलावा NaHS विलयनों में अधिक स्थिर पॉलीसल्फाइड भी हो सकते हैं21। एक अन्य संभावना यह है कि विलयन में शेष NaHS की बहुत कम सांद्रता भी लाभकारी प्रभाव डाल सकती है। वास्तव में, ओलसन एट अल. ने प्रमाण प्रस्तुत किया कि रक्त में H2S का माइक्रोमोलर स्तर शारीरिक नहीं है और यह नैनोमोलर सीमा में होना चाहिए या पूरी तरह से अनुपस्थित होना चाहिए13। H2S प्रोटीन सल्फेशन के माध्यम से कार्य कर सकता है, जो एक प्रतिवर्ती पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो कई प्रोटीनों के कार्य, स्थिरता और स्थान को प्रभावित करता है52,53,54। वास्तव में, शारीरिक परिस्थितियों में, कई यकृत प्रोटीनों का लगभग 10% से 25% सल्फिलेटेड होता है53। दोनों अध्ययनों में NaHS19,23 के तीव्र विनाश को स्वीकार किया गया है, लेकिन आश्चर्यजनक रूप से कहा गया है कि "हमने पीने के पानी में NaHS की सांद्रता को प्रतिदिन बदलकर नियंत्रित किया।"23 एक अध्ययन में गलती से कहा गया है कि "NaHS एक मानक H2S दाता है और आमतौर पर नैदानिक ​​अभ्यास में H2S को प्रतिस्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है।"18
उपरोक्त चर्चा से पता चलता है कि NaHS वाष्पीकरण, ऑक्सीकरण और प्रकाश अपघटन के माध्यम से विलयन से नष्ट हो जाता है, और इसलिए विलयन से H2S के नुकसान को कम करने के लिए कुछ सुझाव दिए गए हैं। सबसे पहले, H2S का वाष्पीकरण गैस-तरल इंटरफ़ेस13 और विलयन के pH11 पर निर्भर करता है; इसलिए, वाष्पीकरण से होने वाले नुकसान को कम करने के लिए, पानी की बोतल का गला जितना संभव हो उतना छोटा बनाया जा सकता है जैसा कि पहले बताया गया है15,19, और वाष्पीकरण से होने वाले नुकसान को कम करने के लिए पानी के pH को एक स्वीकार्य ऊपरी सीमा (यानी, 6.5-8.551) तक समायोजित किया जा सकता है11। दूसरा, पीने के पानी में ऑक्सीजन के प्रभाव और संक्रमण धातु आयनों की उपस्थिति के कारण H2S का स्वतः ऑक्सीकरण होता है13, इसलिए आर्गन या नाइट्रोजन44,45 के साथ पीने के पानी का विऑक्सीकरण और धातु चेलेटर्स37,47 का उपयोग सल्फाइड के ऑक्सीकरण को कम कर सकता है। तीसरा, H2S के प्रकाश अपघटन को रोकने के लिए, पानी की बोतलों को एल्यूमीनियम पन्नी से लपेटा जा सकता है; यह प्रक्रिया स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन55 जैसे प्रकाश-संवेदनशील पदार्थों पर भी लागू होती है। अंत में, अकार्बनिक सल्फाइड लवण (NaHS, Na2S, और CaS) को पहले की रिपोर्टों के अनुसार पीने के पानी में घोलने के बजाय गैवेज के माध्यम से दिया जा सकता है56,57,58; अध्ययनों से पता चला है कि चूहों को गैवेज के माध्यम से दिए गए रेडियोधर्मी सोडियम सल्फाइड का अवशोषण अच्छी तरह से होता है और यह लगभग सभी ऊतकों में वितरित हो जाता है59। आज तक, अधिकांश अध्ययनों में अकार्बनिक सल्फाइड लवणों को इंट्रापेरिटोनियल रूप से दिया गया है; हालाँकि, नैदानिक ​​​​स्थितियों में इस मार्ग का उपयोग शायद ही कभी किया जाता है60। दूसरी ओर, मनुष्यों में मौखिक मार्ग प्रशासन का सबसे सामान्य और पसंदीदा मार्ग है61। इसलिए, हम मौखिक गैवेज द्वारा कृन्तकों में H2S दाताओं के प्रभावों का मूल्यांकन करने की अनुशंसा करते हैं।
एक सीमा यह है कि हमने जलीय विलयन और सीरम में सल्फाइड का मापन MB विधि का उपयोग करके किया। सल्फाइड मापने की विधियों में आयोडीन अनुमापन, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री, विद्युत रासायनिक विधि (पोटेंशियोमेट्री, एम्पेरोमेट्री, कूलोमेट्रिक विधि और एम्पेरोमेट्रिक विधि) और क्रोमैटोग्राफी (गैस क्रोमैटोग्राफी और उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी) शामिल हैं, जिनमें से सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधि MB स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधि है।62 जैविक नमूनों में H2S मापने के लिए MB विधि की एक सीमा यह है कि यह सभी सल्फर युक्त यौगिकों को मापती है, न कि मुक्त H2S को।63 क्योंकि यह अम्लीय परिस्थितियों में की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप जैविक स्रोत से सल्फर का निष्कर्षण होता है।64 हालांकि, अमेरिकन पब्लिक हेल्थ एसोसिएशन के अनुसार, MB पानी में सल्फाइड मापने की मानक विधि है।65 इसलिए, यह सीमा NaHS युक्त विलयनों की अस्थिरता पर हमारे मुख्य परिणामों को प्रभावित नहीं करती है। इसके अलावा, हमारे अध्ययन में, NaHS युक्त जल और सीरम नमूनों में सल्फाइड माप की पुनर्प्राप्ति क्रमशः 91% और 93% थी। ये मान पहले से रिपोर्ट की गई सीमाओं (77-92)66 के अनुरूप हैं, जो स्वीकार्य विश्लेषणात्मक परिशुद्धता42 को दर्शाते हैं। यह उल्लेखनीय है कि हमने पूर्व-नैदानिक ​​अध्ययनों में केवल नर चूहों पर अत्यधिक निर्भरता से बचने के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) के दिशानिर्देशों67 के अनुसार नर और मादा दोनों चूहों का उपयोग किया और जहाँ तक संभव हो, नर और मादा दोनों चूहों को शामिल किया68। इस बिंदु पर अन्य लोगों69,70,71 ने भी जोर दिया है।
निष्कर्षतः, इस अध्ययन के परिणाम दर्शाते हैं कि पीने के पानी से तैयार किए गए NaHS विलयनों का उपयोग H2S उत्पन्न करने के लिए नहीं किया जा सकता है, क्योंकि वे अस्थिर होते हैं। इस प्रकार प्रयोग करने से जानवरों को NaHS की अस्थिर और अपेक्षित स्तर से कम मात्रा का सामना करना पड़ेगा; इसलिए, ये निष्कर्ष मनुष्यों पर लागू नहीं हो सकते हैं।
वर्तमान अध्ययन के दौरान उपयोग किए गए और/या विश्लेषण किए गए डेटासेट उचित अनुरोध पर संबंधित लेखक से प्राप्त किए जा सकते हैं।
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