हमने पहले बताया था कि लिवर फाइब्रोसिस से पीड़ित रोगियों में आंत से उत्पन्न ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट इंडोल-3-प्रोपियोनिक एसिड (IPA) का सीरम स्तर कम होता है। इस अध्ययन में, हमने सीरम IPA स्तरों के संबंध में मोटे लिवर में ट्रांसक्रिप्टोम और डीएनए मिथाइलोम की जांच की, साथ ही इन विट्रो में हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं (HSCs) के फेनोटाइपिक निष्क्रियता को प्रेरित करने में IPA की भूमिका का भी अध्ययन किया।
इस अध्ययन में टाइप 2 मधुमेह मेलिटस (T2DM) से रहित 116 मोटापे से ग्रस्त रोगियों (आयु 46.8 ± 9.3 वर्ष; बीएमआई: 42.7 ± 5.0 kg/m²) को शामिल किया गया, जिन्होंने कुओपियो बेरिएट्रिक सर्जरी सेंटर (KOBS) में बेरिएट्रिक सर्जरी करवाई थी। परिसंचारी IPA स्तरों का मापन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) द्वारा किया गया, लिवर ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण कुल RNA अनुक्रमण द्वारा किया गया, और DNA मेथाइलेशन विश्लेषण इनफिनियम ह्यूमनमेथाइलेशन450 बीडचिप का उपयोग करके किया गया। इन विट्रो प्रयोगों के लिए मानव हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं (LX-2) का उपयोग किया गया।
सीरम IPA का स्तर यकृत में अपोप्टोटिक, माइटोफैजिक और दीर्घायुता मार्गों में शामिल जीनों की अभिव्यक्ति से संबंधित था। AKT सेरीन/थ्रेओनीन काइनेज 1 (AKT1) जीन यकृत ट्रांसक्रिप्ट और डीएनए मेथाइलेशन प्रोफाइल में सबसे प्रचुर मात्रा में और प्रमुख परस्पर क्रिया करने वाला जीन था। IPA उपचार ने एपोप्टोसिस को प्रेरित किया, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कम किया और LX-2 कोशिकाओं के फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस और जीवित रहने को नियंत्रित करने वाले जीनों की अभिव्यक्ति को संशोधित करके कोशिका आकारिकी और माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता को बदल दिया।
कुल मिलाकर, ये आंकड़े इस बात का समर्थन करते हैं कि आईपीए में संभावित चिकित्सीय प्रभाव हैं और यह एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकता है और एचएससी फेनोटाइप को एक निष्क्रिय अवस्था की ओर स्थानांतरित कर सकता है, जिससे एचएससी सक्रियण और माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में हस्तक्षेप करके यकृत फाइब्रोसिस को रोकने की संभावना बढ़ जाती है।
मोटापा और मेटाबोलिक सिंड्रोम की व्यापकता मेटाबोलिक रूप से संबंधित फैटी लिवर रोग (MASLD) की बढ़ती घटनाओं से जुड़ी हुई है; यह रोग सामान्य आबादी के 25% से 30% लोगों को प्रभावित करता है [1]। MASLD के कारणों में से मुख्य परिणाम लिवर फाइब्रोसिस है, जो एक गतिशील प्रक्रिया है जिसमें रेशेदार बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स (ECM) का निरंतर संचय होता है [2]। लिवर फाइब्रोसिस में शामिल मुख्य कोशिकाएं हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाएं (HSCs) हैं, जो चार ज्ञात फेनोटाइप प्रदर्शित करती हैं: शांत, सक्रिय, निष्क्रिय और वृद्ध [3, 4]। HSCs को सक्रिय किया जा सकता है और वे शांत रूप से उच्च ऊर्जा मांग वाली प्रोलिफेरेटिव फाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं में परिवर्तित हो सकती हैं, जिनमें α-स्मूथ मसल एक्टिन (α-SMA) और टाइप I कोलेजन (Col-I) की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है [5, 6]। लिवर फाइब्रोसिस के उलट होने के दौरान, सक्रिय HSCs को एपोप्टोसिस या निष्क्रियता के माध्यम से समाप्त कर दिया जाता है। इन प्रक्रियाओं में फाइब्रोजेनिक जीन का डाउनरेगुलेशन और प्रोसर्वाइवल जीन (जैसे एनएफ-κB और PI3K/Akt सिग्नलिंग पाथवे) का मॉड्यूलेशन [7, 8], साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और कार्य में परिवर्तन [9] शामिल हैं।
आंत में उत्पादित ट्रिप्टोफैन मेटाबोलाइट इंडोल-3-प्रोपियोनिक एसिड (IPA) के सीरम स्तर मानव चयापचय रोगों, जिनमें MASLD भी शामिल है, में कम पाए गए हैं [10-13]। IPA आहार फाइबर सेवन से संबंधित है, अपने एंटीऑक्सीडेंट और सूजन-रोधी प्रभावों के लिए जाना जाता है, और इन विवो और इन विट्रो में आहार-प्रेरित गैर-अल्कोहलिक स्टीटोहेपेटाइटिस (NASH) फेनोटाइप को कम करता है [11-14]। कुछ प्रमाण हमारे पिछले अध्ययन से मिलते हैं, जिसमें कुओपियो बेरिएट्रिक सर्जरी अध्ययन (KOBS) में लिवर फाइब्रोसिस वाले रोगियों में लिवर फाइब्रोसिस रहित मोटे रोगियों की तुलना में सीरम IPA स्तर कम पाया गया था। इसके अलावा, हमने दिखाया कि IPA उपचार मानव हेपेटिक स्टेलेट सेल (LX-2) मॉडल में कोशिका आसंजन, कोशिका प्रवासन और हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल सक्रियण के क्लासिकल मार्कर जीन की अभिव्यक्ति को कम कर सकता है और एक संभावित हेपेटोप्रोटेक्टिव मेटाबोलाइट है [15]। हालांकि, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि आईपीए एचएससी एपोप्टोसिस और माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स को सक्रिय करके लिवर फाइब्रोसिस प्रतिगमन को कैसे प्रेरित करता है।
यहां, हम यह प्रदर्शित करते हैं कि सीरम IPA मोटापे से ग्रस्त लेकिन टाइप 2 मधुमेह से पीड़ित न होने वाले (KOBS) व्यक्तियों के यकृत में एपोप्टोसिस, माइटोफेजी और दीर्घायुता मार्गों में समृद्ध जीन की अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, हमने पाया कि IPA निष्क्रियता मार्ग के माध्यम से सक्रिय हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं (HSCs) के निष्कासन और अपघटन को प्रेरित कर सकता है। ये परिणाम IPA की एक नई भूमिका को उजागर करते हैं, जिससे यह यकृत फाइब्रोसिस प्रतिगमन को बढ़ावा देने के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य बन जाता है।
केओबीएस समूह में किए गए एक पिछले अध्ययन से पता चला कि लिवर फाइब्रोसिस वाले रोगियों में लिवर फाइब्रोसिस रहित रोगियों की तुलना में परिसंचारी आईपीए का स्तर कम था [15]। टाइप 2 मधुमेह के संभावित भ्रामक प्रभाव को दूर करने के लिए, हमने चल रहे केओबीएस अध्ययन से टाइप 2 मधुमेह रहित 116 मोटे रोगियों (औसत आयु ± एसडी: 46.8 ± 9.3 वर्ष; बीएमआई: 42.7 ± 5.0 किलोग्राम/मी2) (तालिका 1) को अध्ययन जनसंख्या के रूप में भर्ती किया [16]। सभी प्रतिभागियों ने लिखित सूचित सहमति दी और अध्ययन प्रोटोकॉल को हेलसिंकी घोषणा (54/2005, 104/2008 और 27/2010) के अनुसार उत्तरी साओ काउंटी अस्पताल की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।
बेरिएट्रिक सर्जरी के दौरान लिवर बायोप्सी के नमूने प्राप्त किए गए और पूर्व वर्णित मानदंडों [17, 18] के अनुसार अनुभवी पैथोलॉजिस्ट द्वारा हिस्टोलॉजिकल रूप से उनका मूल्यांकन किया गया। मूल्यांकन मानदंड अनुपूरक तालिका S1 में संक्षेपित हैं और पहले वर्णित किए गए हैं [19]।
मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण के लिए उपवास सीरम नमूनों का अनटारगेटेड लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) द्वारा विश्लेषण किया गया (n = 116)। नमूनों का विश्लेषण UHPLC-qTOF-MS प्रणाली (1290 LC, 6540 qTOF-MS, एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, वाल्डब्रॉन, कार्लज़ूहे, जर्मनी) का उपयोग करके किया गया, जैसा कि पहले बताया गया है19। आइसोप्रोपिल अल्कोहल (IPA) की पहचान प्रतिधारण समय और शुद्ध मानकों के साथ MS/MS स्पेक्ट्रम की तुलना के आधार पर की गई थी। IPA सिग्नल तीव्रता (पीक क्षेत्र) को सभी आगे के विश्लेषणों में ध्यान में रखा गया [20]।
संपूर्ण यकृत आरएनए अनुक्रमण इलुमिना हाईसेक 2500 का उपयोग करके किया गया और डेटा को पहले वर्णित विधि के अनुसार संसाधित किया गया [19, 21, 22]। हमने माइटोकॉन्ड्रियल कार्य/बायोजेनेसिस को प्रभावित करने वाले ट्रांसक्रिप्ट्स का लक्षित विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण माइटोमिनर 4.0 डेटाबेस [23] से चयनित 1957 जीनों का उपयोग करके किया। यकृत डीएनए मेथाइलेशन विश्लेषण इन्फिनियम ह्यूमनमेथाइलेशन450 बीडचिप (इलुमिना, सैन डिएगो, कैलिफोर्निया, यूएसए) का उपयोग करके उसी पद्धति से किया गया जैसा कि पहले वर्णित है [24, 25]।
मानव हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाएं (LX-2) प्रोफेसर स्टेफानो रोमियो द्वारा उपलब्ध कराई गईं और इन्हें DMEM/F12 माध्यम (बायोवेस्ट, L0093-500, 1% पेन/स्ट्रेप; लोंज़ा, DE17-602E, 2% FBS; गिब्को, 10270-106) में संवर्धित और बनाए रखा गया। IPA की कार्यशील खुराक का चयन करने के लिए, LX-2 कोशिकाओं को DMEM/F12 माध्यम में 24 घंटे के लिए IPA की विभिन्न सांद्रताओं (10 μM, 100 μM और 1 mM; सिग्मा, 220027) के साथ उपचारित किया गया। इसके अतिरिक्त, एचएससी को निष्क्रिय करने की आईपीए की क्षमता की जांच करने के लिए, एलएक्स-2 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए सीरम-मुक्त माध्यम में 5 एनजी/एमएल टीजीएफ-β1 (आर एंड डी सिस्टम्स, 240-बी-002/सीएफ) और 1 एमएल आईपीए के साथ सह-उपचारित किया गया। संबंधित वाहन नियंत्रण के लिए, टीजीएफ-β1 उपचार के लिए 0.1% बीएसए युक्त 4 एनएम एचसीएल और आईपीए उपचार के लिए 0.05% डीएमएसओ का उपयोग किया गया, और संयुक्त उपचार के लिए दोनों का एक साथ उपयोग किया गया।
एपॉप्टोसिस का आकलन FITC एनेक्सिन V एपॉप्टोसिस डिटेक्शन किट विद 7-AAD (बायोलिजेंड, सैन डिएगो, कैलिफोर्निया, यूएसए, कैट# 640922) का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया। संक्षेप में, LX-2 (1 × 10⁵ कोशिकाएं/वेल) को 12-वेल प्लेटों में रात भर कल्चर किया गया और फिर उन्हें IPA या IPA और TGF-β1 की कई खुराकों से उपचारित किया गया। अगले दिन, तैरती और चिपकी हुई कोशिकाओं को एकत्र किया गया, ट्रिप्सिनाइज्ड किया गया, PBS से धोया गया, एनेक्सिन V बाइंडिंग बफर में पुनः सस्पेंड किया गया और FITC-एनेक्सिन V और 7-AAD के साथ 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया।
जीवित कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया की ऑक्सीडेटिव गतिविधि का विश्लेषण माइटोट्रैकर™ रेड सीएमएक्सरोस (एमटीआर) (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कार्ल्सबैड, सीए) का उपयोग करके किया गया। एमटीआर परीक्षण के लिए, एलएक्स-2 कोशिकाओं को आईपीए और टीजीएफ-β1 के साथ समान घनत्व पर इनक्यूबेट किया गया। 24 घंटे बाद, जीवित कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज्ड किया गया, पीबीएस से धोया गया, और फिर 100 μM एमटीआर के साथ सीरम-मुक्त माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया, जैसा कि पहले वर्णित है [26]। जीवित कोशिका आकृति विज्ञान विश्लेषण के लिए, कोशिका आकार और साइटोप्लाज्मिक जटिलता का विश्लेषण क्रमशः फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) मापदंडों का उपयोग करके किया गया।
सभी डेटा (30,000 इवेंट) नोवोसाइट क्वांटेऑन (एजिलेंट) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे और नोवोएक्सप्रेस® 1.4.1 या फ्लोजो वी.10 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उनका विश्लेषण किया गया था।
सीहॉर्स एक्सएफ सेल माइटो स्ट्रेस से लैस सीहॉर्स एक्सट्रासेलुलर फ्लक्स एनालाइजर (एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) और बाह्यकोशिकीय अम्लीकरण दर (ईकार) को वास्तविक समय में मापा गया। संक्षेप में, 2 × 10⁴ एलएक्स-2 कोशिकाओं/वेल को एक्सएफ96 सेल कल्चर प्लेटों पर बोया गया। रात भर इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को आइसोप्रोपेनॉल (आईपीए) और टीजीएफ-β1 (पूरक विधियाँ 1) से उपचारित किया गया। डेटा विश्लेषण सीहॉर्स एक्सएफ वेव सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया, जिसमें सीहॉर्स एक्सएफ सेल एनर्जी फेनोटाइप टेस्ट रिपोर्ट जेनरेटर शामिल है। इससे, एक बायोएनर्जेटिक हेल्थ इंडेक्स (बीएचआई) की गणना की गई [27]।
कुल RNA को cDNA में रूपांतरित किया गया। विशिष्ट विधियों के लिए, संदर्भ [15] देखें। मानव 60S राइबोसोमल अम्लीय प्रोटीन P0 (RPLP0) और साइक्लोफिलिन A1 (PPIA) mRNA स्तरों को संरचनात्मक जीन नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया। QuantStudio 6 pro रियल-टाइम PCR सिस्टम (Thermo Fisher, Landsmeer, नीदरलैंड) का उपयोग TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) या Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) के साथ किया गया, और सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति गुना की गणना तुलनात्मक Ct मान साइक्लिंग मापदंडों (ΔΔCt) और ∆∆Ct विधि का उपयोग करके की गई। प्राइमर का विवरण अनुपूरक सारणी S2 और S3 में दिया गया है।
न्यूक्लियर डीएनए (एनसीडीएनए) और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) को डीएनईज़ी ब्लड एंड टिश्यू किट (क्वाइजेन) का उपयोग करके निकाला गया, जैसा कि पहले बताया गया है [28]। एमटीडीएनए की सापेक्ष मात्रा की गणना प्रत्येक लक्षित एमटीडीएनए क्षेत्र और तीन न्यूक्लियर डीएनए क्षेत्रों के ज्यामितीय माध्य (एमटीडीएनए/एनसीडीएनए) के अनुपात की गणना करके की गई, जैसा कि पूरक विधियाँ 2 में विस्तार से बताया गया है। एमटीडीएनए और एनसीडीएनए के लिए प्राइमर का विवरण पूरक तालिका S4 में दिया गया है।
अंतरकोशिकीय और अंतःकोशिकीय माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को देखने के लिए जीवित कोशिकाओं को माइटोट्रैकर™ रेड सीएमएक्सरोस (एमटीआर) (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कार्ल्सबैड, सीए) से रंगा गया था। एलएक्स-2 कोशिकाओं (1 × 104 कोशिकाएं/वेल) को संबंधित कांच के तले वाली कल्चर प्लेटों (इबिडी जीएमबीएच, मार्टिंसरीड, जर्मनी) में कांच की स्लाइड पर संवर्धित किया गया था। 24 घंटे के बाद, जीवित एलएक्स-2 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 100 μM एमटीआर के साथ इनक्यूबेट किया गया और कोशिका नाभिक को डीएपीआई (1 μg/ml, सिग्मा-एल्ड्रिच) से रंगा गया, जैसा कि पहले वर्णित किया गया है [29]। माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को 37 डिग्री सेल्सियस तापमान पर 5% CO2 वाले आर्द्र वातावरण में 63×NA 1.3 ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके ज़ीस एलएसएम 800 कन्फोकल मॉड्यूल से सुसज्जित ज़ीस एक्सियो ऑब्जर्वर इनवर्टेड माइक्रोस्कोप (कार्ल ज़ीस माइक्रोइमेजिंग जीएमबीएच, जेना, जर्मनी) से देखा गया। हमने प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए दस Z-श्रृंखला छवियां प्राप्त कीं। प्रत्येक Z-श्रृंखला में 30 खंड होते हैं, जिनमें से प्रत्येक की मोटाई 9.86 μm होती है। प्रत्येक नमूने के लिए, ZEN 2009 सॉफ़्टवेयर (कार्ल ज़ीस माइक्रोइमेजिंग जीएमबीएच, जेना, जर्मनी) का उपयोग करके दस अलग-अलग दृश्य क्षेत्रों की छवियां प्राप्त की गईं, और पूरक विधियां 3 में विस्तृत मापदंडों के अनुसार ImageJ सॉफ़्टवेयर (v1.54d) [30, 31] का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल आकारिकी विश्लेषण किया गया।
कोशिकाओं को 0.1 M फॉस्फेट बफर में 2% ग्लूटराल्डिहाइड के साथ स्थिर किया गया, इसके बाद 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड विलयन (सिग्मा एल्ड्रिच, एमओ, यूएसए) के साथ स्थिर किया गया, एसीटोन (मर्क, डार्मस्टेड, जर्मनी) के साथ धीरे-धीरे निर्जलित किया गया और अंत में एपॉक्सी रेजिन में एम्बेड किया गया। अतिपतली परतें तैयार की गईं और उन्हें 1% यूरेनिल एसीटेट (मर्क, डार्मस्टेड, जर्मनी) और 1% लेड साइट्रेट (मर्क, डार्मस्टेड, जर्मनी) से रंगा गया। 80 ​​kV के त्वरक वोल्टेज पर JEM 2100F EXII ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (JEOL लिमिटेड, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके अतिसंरचनात्मक छवियां प्राप्त की गईं।
24 घंटे तक आईपीए से उपचारित एलएक्स-2 कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का विश्लेषण ज़ीस इनवर्टेड लाइट माइक्रोस्कोप (ज़ीस एक्सियो वर्ट.ए1 और एक्सियोकैम एमआरएम, जेना, जर्मनी) का उपयोग करके 50 गुना आवर्धन पर फेज-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया।
नैदानिक ​​डेटा को माध्य ± मानक विचलन या माध्यिका (अंतरचतुर्थक श्रेणी: IQR) के रूप में व्यक्त किया गया। तीनों अध्ययन समूहों के बीच अंतर की तुलना करने के लिए एकतरफ़ा विश्लेषण (निरंतर चर) या χ² परीक्षण (श्रेणीबद्ध चर) का उपयोग किया गया। एकाधिक परीक्षणों के लिए त्रुटि सुधार हेतु त्रुटि सकारात्मक दर (FDR) का उपयोग किया गया, और जिन जीनों का FDR < 0.05 था, उन्हें सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया। CpG DNA मेथाइलेशन और IPA सिग्नल तीव्रता के बीच सहसंबंध स्थापित करने के लिए स्पीयरमैन सहसंबंध विश्लेषण का उपयोग किया गया, जिसमें नाममात्र p मान (p < 0.05) दर्शाए गए।
परिसंचारी सीरम आईपीए स्तरों से संबंधित 3093 लिवर ट्रांसक्रिप्ट्स में से 268 ट्रांसक्रिप्ट्स (नाममात्र p < 0.01), 119 माइटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रांसक्रिप्ट्स (नाममात्र p < 0.05), और 4350 सी.पी.जी. के लिए वेब-आधारित जीन सेट विश्लेषण उपकरण (वेबगेस्टाल्ट) का उपयोग करके पाथवे विश्लेषण किया गया। ओवरलैपिंग जीनों को खोजने के लिए मुफ्त में उपलब्ध वेनी डीबी (संस्करण 2.1.0) टूल का उपयोग किया गया, और प्रोटीन-प्रोटीन अंतःक्रियाओं को देखने के लिए स्ट्रिंगडीबी (संस्करण 11.5) का उपयोग किया गया।
LX-2 प्रयोग के लिए, नमूनों की सामान्यता का परीक्षण डी'एगोस्टिनो-पियर्सन परीक्षण का उपयोग करके किया गया। डेटा कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियों से प्राप्त किया गया और बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा ANOVA के अधीन किया गया। 0.05 से कम p-मान को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया। डेटा को माध्य ± मानक विचलन (mean ± SD) के रूप में प्रस्तुत किया गया है, और प्रत्येक चित्र में प्रयोगों की संख्या दर्शाई गई है। सभी विश्लेषण और ग्राफ़ विंडोज के लिए ग्राफ़पैड प्रिज्म 8 सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर (ग्राफ़पैड सॉफ़्टवेयर इंक., संस्करण 8.4.3, सैन डिएगो, यूएसए) का उपयोग करके किए गए।
सबसे पहले, हमने सीरम आईपीए स्तरों और यकृत, संपूर्ण शरीर और माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्ट्स के बीच संबंध की जांच की। कुल ट्रांसक्रिप्ट प्रोफाइल में, सीरम आईपीए स्तरों से सबसे अधिक संबंधित जीन MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; माइटोजेन-एक्टिवेटेड प्रोटीन काइनेज-एक्टिवेटेड प्रोटीन काइनेज 3) था; माइटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रांसक्रिप्ट प्रोफाइल में, सबसे अधिक संबंधित जीन AKT1 (FDR = 0.7621; AKT सेरीन/थ्रेओनीन काइनेज 1) था (अतिरिक्त फ़ाइल 1 और अतिरिक्त फ़ाइल 2)।
इसके बाद हमने वैश्विक ट्रांसक्रिप्ट (n = 268; p < 0.01) और माइटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रांसक्रिप्ट (n = 119; p < 0.05) का विश्लेषण किया, और अंततः एपोप्टोसिस को सबसे महत्वपूर्ण कैनोनिकल पाथवे के रूप में पहचाना (p = 0.0089)। सीरम IPA स्तरों से जुड़े माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्ट के लिए, हमने एपोप्टोसिस (FDR = 0.00001), माइटोफेजी (FDR = 0.00029), और TNF सिग्नलिंग पाथवे (FDR = 0.000006) पर ध्यान केंद्रित किया (चित्र 1A, तालिका 2, और पूरक चित्र 1A-B)।
सीरम IPA स्तरों के संबंध में मानव यकृत में वैश्विक, माइटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रांसक्रिप्ट और डीएनए मेथाइलेशन का अतिव्यापी विश्लेषण। A 268 वैश्विक ट्रांसक्रिप्ट, 119 माइटोकॉन्ड्रिया-संबंधित ट्रांसक्रिप्ट और डीएनए मेथाइलेटेड ट्रांसक्रिप्ट को दर्शाता है, जो सीरम IPA स्तरों से संबंधित 3092 CpG साइटों पर मैप किए गए हैं (वैश्विक ट्रांसक्रिप्ट और डीएनए मेथाइलेटेड के लिए p मान < 0.01, और माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्ट के लिए p मान < 0.05)। प्रमुख अतिव्यापी ट्रांसक्रिप्ट मध्य में दिखाए गए हैं (AKT1 और YKT6)। B अन्य जीनों के साथ उच्चतम अंतःक्रिया स्कोर (0.900) वाले 13 जीनों का अंतःक्रिया मानचित्र, ऑनलाइन टूल StringDB का उपयोग करके सीरम IPA स्तरों से महत्वपूर्ण रूप से संबंधित 56 अतिव्यापी जीनों (काली रेखा क्षेत्र) से बनाया गया था। हरा: जीन ऑन्टोलॉजी (GO) सेलुलर घटक: माइटोकॉन्ड्रिया (GO:0005739) पर मैप किए गए जीन। डेटा (टेक्स्ट माइनिंग, प्रयोगों, डेटाबेस और सह-अभिव्यक्ति पर आधारित) के आधार पर, AKT1 वह प्रोटीन है जिसका अन्य प्रोटीनों के साथ अंतःक्रियाओं के लिए उच्चतम स्कोर (0.900) है। नेटवर्क नोड्स प्रोटीनों को दर्शाते हैं, और किनारे प्रोटीनों के बीच संबंधों को दर्शाते हैं।
चूंकि आंत माइक्रोबायोटा मेटाबोलाइट्स डीएनए मेथाइलेशन के माध्यम से एपिजेनेटिक संरचना को विनियमित कर सकते हैं [32], हमने यह जांच की कि क्या सीरम आईपीए स्तर यकृत डीएनए मेथाइलेशन से जुड़े थे। हमने पाया कि सीरम आईपीए स्तरों से जुड़े दो प्रमुख मेथाइलेशन स्थल प्रोलाइन-सेरीन-समृद्ध क्षेत्र 3 (C19orf55) और हीट शॉक प्रोटीन परिवार बी (छोटा) सदस्य 6 (HSPB6) के निकट थे (अतिरिक्त फ़ाइल 3)। 4350 CpG का डीएनए मेथाइलेशन (p < 0.01) सीरम आईपीए स्तरों के साथ सहसंबंधित था और दीर्घायु नियामक मार्गों में समृद्ध था (p = 0.006) (चित्र 1A, तालिका 2, और पूरक चित्र 1C)।
मानव यकृत में सीरम आईपीए स्तर, वैश्विक प्रतिलेख, माइटोकॉन्ड्रिया-संबंधित प्रतिलेख और डीएनए मेथाइलेशन के बीच संबंधों के अंतर्निहित जैविक तंत्र को समझने के लिए, हमने पिछले मार्ग विश्लेषण में पहचाने गए जीनों का एक ओवरलैप विश्लेषण किया (चित्र 1ए)। 56 ओवरलैपिंग जीनों (चित्र 1ए में काली रेखा के अंदर) के मार्ग संवर्धन विश्लेषण के परिणामों से पता चला कि एपोप्टोसिस मार्ग (p = 0.00029) ने तीनों विश्लेषणों में पाए जाने वाले दो जीनों को उजागर किया: AKT1 और YKT6 (YKT6 v-SNARE होमोलॉग), जैसा कि वेन आरेख में दिखाया गया है (पूरक चित्र 2 और चित्र 1ए)। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि AKT1 (cg19831386) और YKT6 (cg24161647) सीरम आईपीए स्तरों के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित थे (अतिरिक्त फ़ाइल 3)। जीन उत्पादों के बीच संभावित प्रोटीन अंतःक्रियाओं की पहचान करने के लिए, हमने 56 अतिव्यापी जीनों में से उच्चतम सामान्य क्षेत्र स्कोर (0.900) वाले 13 जीनों को इनपुट के रूप में चुना और एक अंतःक्रिया मानचित्र का निर्माण किया। विश्वास स्तर (सीमांत विश्वास) के अनुसार, उच्चतम स्कोर (0.900) वाला AKT1 जीन शीर्ष पर था (चित्र 1B)।
पाथवे विश्लेषण के आधार पर, हमने पाया कि एपोप्टोसिस प्रमुख पाथवे था, इसलिए हमने यह जांच की कि क्या आईपीए उपचार इन विट्रो में एचएससी के एपोप्टोसिस को प्रभावित करेगा। हमने पहले प्रदर्शित किया था कि आईपीए की विभिन्न खुराकें (10 μM, 100 μM, और 1 mM) LX-2 कोशिकाओं के लिए गैर-विषाक्त थीं [15]। इस अध्ययन से पता चला कि 10 μM और 100 μM पर आईपीए उपचार से जीवित और मृत कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई। हालांकि, नियंत्रण समूह की तुलना में, 1 mM आईपीए सांद्रता पर कोशिका जीवन क्षमता में कमी आई, जबकि कोशिका परिगलन दर अपरिवर्तित रही (चित्र 2A, B)। इसके बाद, LX-2 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए इष्टतम सांद्रता का पता लगाने के लिए, हमने 24 घंटे के लिए 10 μM, 100 μM, और 1 mM आईपीए का परीक्षण किया (चित्र 2A-E और पूरक चित्र 3A-B)। दिलचस्प बात यह है कि IPA 10 μM और 100 μM ने एपोप्टोसिस दर (%) को कम कर दिया, हालांकि, IPA 1 mM ने नियंत्रण की तुलना में देर से एपोप्टोसिस और एपोप्टोसिस दर (%) को बढ़ा दिया और इसलिए इसे आगे के प्रयोगों के लिए चुना गया (चित्र 2A-D)।
IPA, LX-2 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस प्रेरित करता है। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एपोप्टोसिस दर और कोशिका आकारिकी को मापने के लिए एनेक्सिन V और 7-AAD डबल स्टेनिंग विधि का उपयोग किया गया। BA कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 10 μM, 100 μM और 1 mM IPA के साथ या सीरम-मुक्त माध्यम में F–H TGF-β1 (5 ng/ml) और 1 mM IPA के साथ इनक्यूबेट किया गया। A: जीवित कोशिकाएँ (एनेक्सिन V -/ 7AAD-); B: मृत कोशिकाएँ (एनेक्सिन V -/ 7AAD+); C, F: प्रारंभिक (एनेक्सिन V +/ 7AAD-); D, G: विलंबित (एनेक्सिन V+/7AAD.+); E, H: एपोप्टोसिस दर में कुल प्रारंभिक और विलंबित एपोप्टोसिस कोशिकाओं का प्रतिशत (%)। डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में दर्शाया गया है, n = 3 स्वतंत्र प्रयोग। सांख्यिकीय तुलनाएँ बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ वन-वे एनोवा का उपयोग करके की गईं। *p < 0.05; ****p < 0.0001
जैसा कि हमने पहले दिखाया है, 5 एनजी/एमएल टीजीएफ-β1 क्लासिकल मार्कर जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर एचएससी सक्रियण को प्रेरित कर सकता है [15]। एलएक्स-2 कोशिकाओं को 5 एनजी/एमएल टीजीएफ-β1 और 1 एमएल आईपीए के संयोजन से उपचारित किया गया (चित्र 2ई-एच)। टीजीएफ-β1 उपचार से एपोप्टोसिस दर में कोई परिवर्तन नहीं हुआ, हालांकि, आईपीए के साथ उपचार करने से टीजीएफ-β1 उपचार की तुलना में विलंबित एपोप्टोसिस और एपोप्टोसिस दर (%) में वृद्धि हुई (चित्र 2ई-एच)। ये परिणाम दर्शाते हैं कि 1 एमएल आईपीए टीजीएफ-β1 प्रेरण से स्वतंत्र रूप से एलएक्स-2 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को बढ़ावा दे सकता है।
हमने LX-2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन पर IPA के प्रभाव की आगे जांच की। परिणामों से पता चला कि 1 mM IPA ने ऑक्सीजन खपत दर (OCR) मापदंडों को कम कर दिया: गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन, आधारभूत और अधिकतम श्वसन, प्रोटॉन रिसाव और ATP उत्पादन, नियंत्रण समूह की तुलना में (चित्र 3A, B), जबकि जैव-ऊर्जावान स्वास्थ्य सूचकांक (BHI) में कोई परिवर्तन नहीं हुआ।
IPA, LX-2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कम करता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन वक्र (OCR) को माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन मापदंडों (गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन, आधारभूत श्वसन, अधिकतम श्वसन, प्रोटॉन रिसाव, ATP उत्पादन, SRC और BHI) के रूप में प्रस्तुत किया गया है। कोशिका A और B को क्रमशः 10 μM, 100 μM और 1 mM IPA के साथ 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। कोशिका C और D को क्रमशः TGF-β1 (5 ng/ml) और 1 mM IPA के साथ सीरम-मुक्त माध्यम में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। सभी मापों को CyQuant किट का उपयोग करके DNA सामग्री के अनुसार सामान्यीकृत किया गया। BHI: जैव-ऊर्जावान स्वास्थ्य सूचकांक; SRC: श्वसन आरक्षित क्षमता; OCR: ऑक्सीजन खपत दर। डेटा को माध्य ± मानक विचलन (SD) के रूप में प्रस्तुत किया गया है, n = 5 स्वतंत्र प्रयोग। सांख्यिकीय तुलना एक-तरफ़ा ANOVA और बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग करके की गई। *p < 0.05; **p < 0.01; और ***p < 0.001
TGF-β1 द्वारा सक्रिय LX-2 कोशिकाओं के जैव-ऊर्जा प्रोफाइल पर IPA के प्रभाव की व्यापक समझ प्राप्त करने के लिए, हमने OCR द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन का विश्लेषण किया (चित्र 3C,D)। परिणामों से पता चला कि नियंत्रण समूह की तुलना में TGF-β1 उपचार से अधिकतम श्वसन, श्वसन आरक्षित क्षमता (SRC) और BHI में कमी आई (चित्र 3C,D)। इसके अतिरिक्त, संयुक्त उपचार से आधारभूत श्वसन, प्रोटॉन रिसाव और ATP उत्पादन में कमी आई, लेकिन SRC और BHI, TGF-β1 से उपचारित कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक थे (चित्र 3C,D)।
हमने सीहॉर्स सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान किया गया “सेलुलर एनर्जी फेनोटाइप टेस्ट” भी किया (पूरक चित्र 4A–D)। जैसा कि पूरक चित्र 3B में दिखाया गया है, TGF-β1 उपचार के बाद OCR और ECAR दोनों की चयापचय क्षमता कम हो गई, हालांकि, नियंत्रण समूह की तुलना में संयोजन और IPA उपचार समूहों में कोई अंतर नहीं देखा गया। इसके अलावा, नियंत्रण समूह की तुलना में संयोजन और IPA उपचार के बाद OCR के आधारभूत और तनाव स्तर दोनों कम हो गए (पूरक चित्र 4C)। दिलचस्प बात यह है कि संयोजन चिकित्सा में भी एक समान पैटर्न देखा गया, जहां TGF-β1 उपचार की तुलना में ECAR के आधारभूत और तनाव स्तरों में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया (पूरक चित्र 4C)। HSCs में, माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन में कमी और TGF-β1 उपचार के संपर्क में आने के बाद SCR और BHI को बहाल करने की संयोजन उपचार की क्षमता ने चयापचय क्षमता (OCR और ECAR) को नहीं बदला। कुल मिलाकर, ये परिणाम संकेत देते हैं कि आईपीए एचएससी में बायोएनर्जेटिक्स को कम कर सकता है, जिससे पता चलता है कि आईपीए एक कम ऊर्जावान प्रोफ़ाइल को प्रेरित कर सकता है जो एचएससी फेनोटाइप को निष्क्रियता की ओर ले जाता है (पूरक चित्र 4डी)।
माइटोकॉन्ड्रियल आकारिकी और नेटवर्क कनेक्शन के त्रि-आयामी मात्रात्मक विश्लेषण के साथ-साथ एमटीआर स्टेनिंग (चित्र 4 और पूरक चित्र 5) का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता पर आईपीए के प्रभाव की जांच की गई। चित्र 4 दर्शाता है कि, नियंत्रण समूह की तुलना में, टीजीएफ-β1 उपचार ने औसत सतह क्षेत्र, शाखाओं की संख्या, कुल शाखा लंबाई और शाखा जंक्शनों की संख्या को कम कर दिया (चित्र 4ए और बी) और माइटोकॉन्ड्रिया के अनुपात को गोलाकार से मध्यवर्ती आकारिकी में बदल दिया (चित्र 4सी)। केवल आईपीए उपचार ने नियंत्रण समूह की तुलना में औसत माइटोकॉन्ड्रियल आयतन को कम किया और माइटोकॉन्ड्रिया के अनुपात को गोलाकार से मध्यवर्ती आकारिकी में बदल दिया (चित्र 4ए)। इसके विपरीत, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता-निर्भर एमटीआर (चित्र 4ए और ई) द्वारा मूल्यांकित गोलाकारता, औसत शाखा लंबाई और माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि अपरिवर्तित रही और इन मापदंडों में समूहों के बीच कोई अंतर नहीं था। कुल मिलाकर, ये परिणाम बताते हैं कि टीजीएफ-β1 और आईपीए उपचार जीवित एलएक्स-2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल आकार और आकृति के साथ-साथ नेटवर्क जटिलता को भी नियंत्रित करते प्रतीत होते हैं।
IPA, LX-2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की प्रचुरता को परिवर्तित करता है। A. सीरम-मुक्त माध्यम में 24 घंटे के लिए TGF-β1 (5 ng/ml) और 1 mM IPA के साथ इनक्यूबेट की गई जीवित LX-2 कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां, माइटोट्रैकर™ रेड CMXRos से रंगे माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क और DAPI से नीले रंग से रंगे नाभिक को दर्शाती हैं। सभी डेटा में प्रति समूह कम से कम 15 छवियां थीं। हमने प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए 10 Z-स्टैक छवियां प्राप्त कीं। प्रत्येक Z-अक्ष अनुक्रम में 30 स्लाइस थे, जिनमें से प्रत्येक की मोटाई 9.86 μm थी। स्केल बार: 10 μm। B. छवि पर अनुकूली थ्रेशोल्डिंग लागू करके पहचाने गए प्रतिनिधि ऑब्जेक्ट (केवल माइटोकॉन्ड्रिया)। प्रत्येक समूह की सभी कोशिकाओं के लिए माइटोकॉन्ड्रियल रूपात्मक नेटवर्क कनेक्शनों का मात्रात्मक विश्लेषण और तुलना की गई। C. माइटोकॉन्ड्रियल आकार अनुपात की आवृत्ति। 0 के निकट मान गोलाकार आकृतियों को दर्शाते हैं, और 1 के निकट मान तंतुमय आकृतियों को दर्शाते हैं। D माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (mtDNA) की मात्रा का निर्धारण सामग्री और विधियों में वर्णित अनुसार किया गया था। E माइटोट्रैकर™ रेड CMXRos विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री (30,000 इवेंट्स) द्वारा सामग्री और विधियों में वर्णित अनुसार किया गया था। डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया गया है, n = 3 स्वतंत्र प्रयोग। सांख्यिकीय तुलना एक-तरफ़ा ANOVA और बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग करके की गई थी। *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
इसके बाद हमने माइटोकॉन्ड्रियल संख्या के सूचक के रूप में LX-2 कोशिकाओं में mtDNA की मात्रा का विश्लेषण किया। नियंत्रण समूह की तुलना में, TGF-β1 से उपचारित समूह में mtDNA की मात्रा बढ़ी हुई पाई गई (चित्र 4D)। TGF-β1 से उपचारित समूह की तुलना में, संयुक्त उपचार समूह में mtDNA की मात्रा घटी हुई पाई गई (चित्र 4D), जिससे पता चलता है कि IPA mtDNA की मात्रा और संभवतः माइटोकॉन्ड्रियल संख्या के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को भी कम कर सकता है (चित्र 3C)। इसके अलावा, ऐसा प्रतीत हुआ कि IPA ने संयुक्त उपचार में mtDNA की मात्रा को कम किया, लेकिन MTR-मध्यस्थ माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि को प्रभावित नहीं किया (चित्र 4A-C)।
हमने LX-2 कोशिकाओं में फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस, उत्तरजीविता और माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता से जुड़े जीनों के mRNA स्तरों के साथ IPA के संबंध की जांच की (चित्र 5A-D)। नियंत्रण समूह की तुलना में, TGF-β1 से उपचारित समूह में कोलेजन टाइप I α2 चेन (COL1A2), α-स्मूथ मसल एक्टिन (αSMA), मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेज 2 (MMP2), टिशू इनहिबिटर ऑफ मेटालोप्रोटीनेज 1 (TIMP1), और डायनामिन 1-लाइक जीन (DRP1) जैसे जीनों की अभिव्यक्ति में वृद्धि देखी गई, जो बढ़े हुए फाइब्रोसिस और सक्रियण को इंगित करता है। इसके अलावा, नियंत्रण समूह की तुलना में, TGF-β1 उपचार ने न्यूक्लियर प्रेग्नेन एक्स रिसेप्टर (PXR), कैस्पेस 8 (CASP8), MAPKAPK3, बी-सेल α के अवरोधक, न्यूक्लियर फैक्टर κ जीन लाइट पेप्टाइड (NFκB1A) के एन्हांसर और न्यूक्लियर फैक्टर κB काइनेज सबयूनिट β (IKBKB) के अवरोधक के mRNA स्तरों को कम कर दिया (चित्र 5A–D)। TGF-β1 उपचार की तुलना में, TGF-β1 और IPA के साथ संयुक्त उपचार ने COL1A2 और MMP2 की अभिव्यक्ति को कम कर दिया, लेकिन PXR, TIMP1, बी-सेल लिंफोमा-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β और IKBKB के mRNA स्तरों को बढ़ा दिया। आईपीए उपचार से एमएमपी2, बीसीएल-2-एसोसिएटेड प्रोटीन एक्स (बीएएक्स), एकेटी1, ऑप्टिक एट्रोफी प्रोटीन 1 (ओपीए1) और माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन प्रोटीन 2 (एमएफएन2) की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय कमी आई, जबकि सीएएसपी8, एनएफकेबी1ए, एनएफकेबी1बी और आईकेबीकेबी की अभिव्यक्ति नियंत्रण समूह की तुलना में बढ़ गई। हालांकि, कैस्पेस-3 (सीएएसपी3), एपोप्टोटिक पेप्टिडेज एक्टिवेटिंग फैक्टर 1 (एपीएएफ1), माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन प्रोटीन 1 (एमएफएन1) और फिशन प्रोटीन 1 (एफआईएस1) की अभिव्यक्ति में कोई अंतर नहीं पाया गया। कुल मिलाकर, ये परिणाम बताते हैं कि आईपीए उपचार फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस, जीवन रक्षा और माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता से जुड़े जीनों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। हमारे डेटा से पता चलता है कि आईपीए उपचार एलएक्स-2 कोशिकाओं में फाइब्रोसिस को कम करता है; साथ ही, यह फेनोटाइप को निष्क्रियता की ओर ले जाकर जीवन रक्षा को बढ़ावा देता है।
IPA, LX-2 कोशिकाओं में फाइब्रोब्लास्ट, एपोप्टोटिक, वायबिलिटी और माइटोकॉन्ड्रियल डायनामिक्स जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। हिस्टोग्राम, सीरम-मुक्त माध्यम में 24 घंटे के लिए TGF-β1 और IPA से प्रेरित LX-2 कोशिकाओं के बाद अंतर्जात नियंत्रण (RPLP0 या PPIA) के सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति को दर्शाते हैं। A फाइब्रोब्लास्ट को, B एपोप्टोटिक कोशिकाओं को, C जीवित कोशिकाओं को और D माइटोकॉन्ड्रियल डायनामिक्स जीन अभिव्यक्ति को दर्शाता है। डेटा को माध्य ± मानक विचलन (SD) के रूप में प्रस्तुत किया गया है, n = 3 स्वतंत्र प्रयोग। सांख्यिकीय तुलना एक-तरफ़ा ANOVA और बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग करके की गई। *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
इसके बाद, फ्लो साइटोमेट्री (चित्र 6A,B) द्वारा कोशिका के आकार (FSC-H) और साइटोप्लाज्मिक जटिलता (SSC-H) में परिवर्तन का आकलन किया गया, और IPA उपचार के बाद कोशिका आकृति विज्ञान में परिवर्तन का आकलन ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) और फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (पूरक चित्र 6A-B) द्वारा किया गया। अपेक्षा के अनुरूप, TGF-β1 से उपचारित समूह में कोशिकाओं का आकार नियंत्रण समूह की तुलना में बढ़ गया (चित्र 6A,B), जो रफ एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ER*) और फैगोलिसोसोम (P) के विशिष्ट विस्तार को दर्शाता है, जो हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियण का संकेत देता है (पूरक चित्र 6A)। हालांकि, TGF-β1 से उपचारित समूह की तुलना में, TGF-β1 और IPA के संयोजन उपचार समूह में कोशिका का आकार, साइटोप्लाज्मिक जटिलता (चित्र 6A,B) और ER* की मात्रा कम हो गई (पूरक चित्र 6A)। इसके अलावा, नियंत्रण समूह की तुलना में IPA उपचार से कोशिका का आकार, साइटोप्लाज्मिक जटिलता (चित्र 6A,B), P और ER* की मात्रा (पूरक चित्र 6A) कम हो गई। साथ ही, नियंत्रण समूह की तुलना में IPA उपचार के 24 घंटे बाद एपोप्टोटिक कोशिकाओं की संख्या बढ़ गई (सफेद तीर, पूरक चित्र 6B)। कुल मिलाकर, ये परिणाम बताते हैं कि 1 mM IPA, HSC एपोप्टोसिस को उत्तेजित कर सकता है और TGF-β1 द्वारा प्रेरित कोशिका आकारिकी मापदंडों में परिवर्तन को उलट सकता है, जिससे कोशिका के आकार और जटिलता को नियंत्रित किया जा सकता है, जो HSC निष्क्रियता से संबंधित हो सकता है।
IPA, LX-2 कोशिकाओं में कोशिका आकार और साइटोप्लाज्मिक जटिलता को परिवर्तित करता है। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण की प्रतिनिधि छवियां। विश्लेषण में LX-2 कोशिकाओं के लिए विशिष्ट गेटिंग रणनीति का उपयोग किया गया: कोशिका समूह को परिभाषित करने के लिए SSC-A/FSC-A, युगल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए FSC-H/FSC-A, और कोशिका आकार और जटिलता विश्लेषण के लिए SSC-H/FSC-H। कोशिकाओं को सीरम-मुक्त माध्यम में TGF-β1 (5 ng/ml) और 1 mM IPA के साथ 24 घंटे तक इनक्यूबेट किया गया। कोशिका आकार और साइटोप्लाज्मिक जटिलता विश्लेषण के लिए LX-2 कोशिकाओं को निचले बाएं चतुर्थांश (SSC-H-/FSC-H-), ऊपरी बाएं चतुर्थांश (SSC-H+/FSC-H-), निचले दाएं चतुर्थांश (SSC-H-/FSC-H+) और ऊपरी दाएं चतुर्थांश (SSC-H+/FSC-H+) में वितरित किया गया। बी. फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एफएससी-एच (फॉरवर्ड स्कैटर, कोशिका आकार) और एसएससी-एच (साइड स्कैटर, साइटोप्लाज्मिक जटिलता) (30,000 इवेंट्स) द्वारा कोशिका आकारिकी का विश्लेषण किया गया। डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया गया है, n = 3 स्वतंत्र प्रयोग। सांख्यिकीय तुलना एक-तरफ़ा एनोवा और बोनफेरोनी पोस्ट हॉक परीक्षण का उपयोग करके की गई। *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 और ****p < 0.0001
आंत के मेटाबोलाइट्स, जैसे कि IPA, शोध का एक महत्वपूर्ण विषय बन गए हैं, जिससे यह संकेत मिलता है कि आंत के माइक्रोबायोटा में नए लक्ष्य खोजे जा सकते हैं। इसलिए यह रोचक है कि IPA, एक मेटाबोलाइट जिसे हमने मनुष्यों में लिवर फाइब्रोसिस से जोड़ा है [15], पशु मॉडलों में एक संभावित एंटी-फाइब्रोटिक यौगिक के रूप में प्रदर्शित किया गया है [13, 14]। यहां, हम पहली बार टाइप 2 मधुमेह (T2D) से रहित मोटे व्यक्तियों में सीरम IPA और वैश्विक लिवर ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और डीएनए मेथाइलेशन के बीच संबंध प्रदर्शित करते हैं, जो एपोप्टोसिस, माइटोफेजी और दीर्घायुता के साथ-साथ लिवर होमियोस्टेसिस को विनियमित करने वाले संभावित उम्मीदवार जीन AKT1 को उजागर करता है। हमारे अध्ययन की एक और नवीनता यह है कि हमने LX-2 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस, कोशिका आकारिकी, माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स और गतिशीलता के साथ IPA उपचार की परस्पर क्रिया को प्रदर्शित किया, जो एक निम्न ऊर्जा स्पेक्ट्रम को इंगित करता है जो HSC फेनोटाइप को निष्क्रियता की ओर स्थानांतरित करता है, जिससे IPA लिवर फाइब्रोसिस में सुधार के लिए एक संभावित उम्मीदवार बन जाता है।
हमने पाया कि एपोप्टोसिस, माइटोफेजी और दीर्घायु, परिसंचारी सीरम IPA से जुड़े यकृत जीनों में समृद्ध सबसे महत्वपूर्ण कैनोनिकल मार्ग थे। माइटोकॉन्ड्रियल गुणवत्ता नियंत्रण (MQC) प्रणाली में व्यवधान माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता, माइटोफेजी और एपोप्टोसिस को जन्म दे सकता है, जिससे MASLD की घटना को बढ़ावा मिलता है [33, 34]। इसलिए, हम अनुमान लगा सकते हैं कि IPA यकृत में एपोप्टोसिस, माइटोफेजी और दीर्घायु के माध्यम से कोशिका गतिशीलता और माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता को बनाए रखने में शामिल हो सकता है। हमारे डेटा से पता चला कि तीन परीक्षणों में दो जीन समान थे: YKT6 और AKT1। यह ध्यान देने योग्य है कि YKT6 एक SNARE प्रोटीन है जो कोशिका झिल्ली संलयन की प्रक्रिया में शामिल है। यह ऑटोफैगोसोम पर STX17 और SNAP29 के साथ एक आरंभिक कॉम्प्लेक्स बनाकर ऑटोफैजी और माइटोफेजी में भूमिका निभाता है, जिससे ऑटोफैगोसोम और लाइसोसोम के संलयन को बढ़ावा मिलता है [35]। इसके अलावा, YKT6 फ़ंक्शन की हानि से माइटोफ़ेजी में बाधा उत्पन्न होती है[36], जबकि YKT6 का अपग्रेडेशन हेपेटोसेल्यूलर कार्सिनोमा (HCC) की प्रगति से जुड़ा है, जो कोशिका उत्तरजीविता में वृद्धि दर्शाता है[37]। दूसरी ओर, AKT1 सबसे महत्वपूर्ण इंटरैक्टिंग जीन है और PI3K/AKT सिग्नलिंग पाथवे, सेल चक्र, सेल माइग्रेशन, प्रसार, फोकल आसंजन, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और कोलेजन स्राव सहित यकृत रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है[38-40]। सक्रिय PI3K/AKT सिग्नलिंग पाथवे हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं (HSCs) को सक्रिय कर सकता है, जो बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स (ECM) के उत्पादन के लिए जिम्मेदार कोशिकाएं हैं, और इसका अविनियमन यकृत फाइब्रोसिस की घटना और प्रगति में योगदान कर सकता है[40]। इसके अतिरिक्त, AKT प्रमुख कोशिका जीवन रक्षा कारकों में से एक है जो p53-निर्भर कोशिका एपोप्टोसिस को रोकता है, और AKT सक्रियण यकृत कोशिका एपोप्टोसिस के अवरोध से संबंधित हो सकता है [41, 42]। प्राप्त परिणाम बताते हैं कि IPA यकृत माइटोकॉन्ड्रिया-संबंधित एपोप्टोसिस में हेपेटोसाइट्स के एपोप्टोसिस में प्रवेश करने या जीवित रहने के बीच निर्णय को प्रभावित करके शामिल हो सकता है। ये प्रभाव AKT और/या YKT6 उम्मीदवार जीन द्वारा विनियमित हो सकते हैं, जो यकृत होमियोस्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण हैं।
हमारे परिणामों से पता चला कि 1 mM IPA ने TGF-β1 उपचार से स्वतंत्र रूप से LX-2 कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित किया और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कम किया। यह उल्लेखनीय है कि एपोप्टोसिस फाइब्रोसिस के समाधान और हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियण का एक प्रमुख मार्ग है, और यह लिवर फाइब्रोसिस की प्रतिवर्ती शारीरिक प्रतिक्रिया में भी एक महत्वपूर्ण घटना है [4, 43]। इसके अलावा, संयुक्त उपचार के बाद LX-2 कोशिकाओं में BHI की बहाली ने माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स के नियमन में IPA की संभावित भूमिका के बारे में नई जानकारी प्रदान की। आराम और निष्क्रिय अवस्था में, हेमेटोपोएटिक कोशिकाएं सामान्यतः ATP उत्पादन के लिए माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन का उपयोग करती हैं और उनकी चयापचय गतिविधि कम होती है। दूसरी ओर, HSC सक्रियण ग्लाइकोलिटिक अवस्था में प्रवेश करने की ऊर्जा मांगों की भरपाई के लिए माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और जैवसंश्लेषण को बढ़ाता है [44]। यह तथ्य कि IPA ने चयापचय क्षमता और ECAR को प्रभावित नहीं किया, यह दर्शाता है कि ग्लाइकोलिटिक मार्ग को कम प्राथमिकता दी जाती है। इसी प्रकार, एक अन्य अध्ययन से पता चला कि 1 mM IPA कार्डियोमायोसाइट्स, मानव हेपेटोसाइट सेल लाइन (Huh7) और मानव गर्भनाल शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVEC) में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला गतिविधि को नियंत्रित करने में सक्षम था; हालाँकि, कार्डियोमायोसाइट्स में ग्लाइकोलिसिस पर IPA का कोई प्रभाव नहीं पाया गया, जिससे पता चलता है कि IPA अन्य प्रकार की कोशिकाओं की जैव-ऊर्जा को प्रभावित कर सकता है [45]। इसलिए, हमारा अनुमान है कि 1 mM IPA एक हल्के रासायनिक अनकप्लर के रूप में कार्य कर सकता है, क्योंकि यह mtDNA की मात्रा को बदले बिना फाइब्रोजेनिक जीन अभिव्यक्ति, कोशिका आकारिकी और माइटोकॉन्ड्रियल जैव-ऊर्जा को काफी हद तक कम कर सकता है [46]। माइटोकॉन्ड्रियल अनकप्लर कल्चर-प्रेरित फाइब्रोसिस और HSC सक्रियण को बाधित कर सकते हैं [47] और कुछ प्रोटीनों जैसे अनकप्लिंग प्रोटीन (UCP) या एडेनिन न्यूक्लियोटाइड ट्रांसलोकेस (ANT) द्वारा विनियमित या प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल ATP उत्पादन को कम कर सकते हैं। कोशिका के प्रकार के आधार पर, यह घटना कोशिकाओं को एपोप्टोसिस से बचा सकती है और/या एपोप्टोसिस को बढ़ावा दे सकती है [46]। हालाँकि, हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल निष्क्रियता में माइटोकॉन्ड्रियल अनकप्लर के रूप में आईपीए की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है।
इसके बाद हमने यह जांच की कि क्या जीवित LX-2 कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में होने वाले परिवर्तन माइटोकॉन्ड्रियल आकारिकी में परिलक्षित होते हैं। दिलचस्प बात यह है कि TGF-β1 उपचार से माइटोकॉन्ड्रियल अनुपात गोलाकार से मध्यवर्ती में परिवर्तित हो जाता है, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल शाखाओं में कमी आती है और माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन में एक प्रमुख कारक DRP1 की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है [48]। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन समग्र नेटवर्क जटिलता से जुड़ा है, और संलयन से विखंडन में संक्रमण हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन का अवरोध HSC एपोप्टोसिस की ओर ले जाता है [49]। इस प्रकार, हमारे परिणाम बताते हैं कि TGF-β1 उपचार माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क जटिलता में कमी और शाखाओं में कमी ला सकता है, जो सक्रिय हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं (HSC) से जुड़े माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन में अधिक सामान्य है। इसके अलावा, हमारे डेटा से पता चला कि IPA माइटोकॉन्ड्रिया के अनुपात को गोलाकार से मध्यवर्ती आकार में बदल सकता है, जिससे OPA1 और MFN2 की अभिव्यक्ति कम हो जाती है। अध्ययनों से पता चला है कि OPA1 के डाउनरेगुलेशन से माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में कमी आ सकती है और कोशिका एपोप्टोसिस शुरू हो सकता है[50]। MFN2 माइटोकॉन्ड्रियल संलयन और एपोप्टोसिस में मध्यस्थता करता है[51]। प्राप्त परिणाम बताते हैं कि TGF-β1 और/या IPA द्वारा LX-2 कोशिकाओं का प्रेरण माइटोकॉन्ड्रियल आकार और आकृति, साथ ही सक्रियण अवस्था और नेटवर्क जटिलता को नियंत्रित करता प्रतीत होता है।
हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि TGFβ-1 और IPA के संयुक्त उपचार से एपोप्टोसिस से बचने वाली कोशिकाओं में फाइब्रोसिस, एपोप्टोसिस और जीवन रक्षा से संबंधित जीनों की mRNA अभिव्यक्ति को विनियमित करके mtDNA और कोशिका आकारिकी मापदंडों को कम किया जा सकता है। वास्तव में, IPA ने AKT1 और COL1A2 और MMP2 जैसे महत्वपूर्ण फाइब्रोसिस जीनों के mRNA अभिव्यक्ति स्तर को कम किया, लेकिन एपोप्टोसिस से जुड़े CASP8 के अभिव्यक्ति स्तर को बढ़ाया। हमारे परिणामों से पता चला कि IPA उपचार के बाद, BAX अभिव्यक्ति कम हो गई और TIMP1 परिवार के उप-इकाइयों, BCL-2 और NF-κB की mRNA अभिव्यक्ति बढ़ गई, जिससे पता चलता है कि IPA एपोप्टोसिस से बचने वाली हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं (HSCs) में जीवन रक्षा संकेतों को उत्तेजित कर सकता है। ये अणु सक्रिय हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं में जीवन-समर्थक संकेतों के रूप में कार्य कर सकते हैं, जो एंटी-एपोप्टोटिक प्रोटीन (जैसे Bcl-2) की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति, प्रो-एपोप्टोटिक BAX की घटी हुई अभिव्यक्ति और TIMP तथा NF-κB के बीच जटिल परस्पर क्रिया से संबंधित हो सकते हैं [5, 7]। IPA, PXR के माध्यम से अपना प्रभाव डालता है, और हमने पाया कि TGF-β1 और IPA के साथ संयुक्त उपचार से PXR mRNA अभिव्यक्ति स्तर में वृद्धि हुई, जो HSC सक्रियण के दमन को दर्शाता है। सक्रिय PXR सिग्नलिंग को इन विवो और इन विट्रो दोनों में HSC सक्रियण को बाधित करने के लिए जाना जाता है [52, 53]। हमारे परिणाम बताते हैं कि IPA, एपोप्टोसिस को बढ़ावा देकर, फाइब्रोसिस और माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय को कम करके, और जीवन-समर्थक संकेतों को बढ़ाकर सक्रिय HSC के निष्कासन में भाग ले सकता है, जो कि विशिष्ट प्रक्रियाएं हैं जो सक्रिय HSC फेनोटाइप को निष्क्रिय में परिवर्तित करती हैं। एपॉप्टोसिस में आईपीए की संभावित क्रियाविधि और भूमिका के लिए एक अन्य संभावित स्पष्टीकरण यह है कि यह मुख्य रूप से माइटोफेजी (आंतरिक मार्ग) और बाह्य टीएनएफ सिग्नलिंग मार्ग (तालिका 1) के माध्यम से निष्क्रिय माइटोकॉन्ड्रिया को नष्ट करता है, जो सीधे एनएफ-κB जीवन रक्षा सिग्नलिंग मार्ग (पूरक चित्र 7) से जुड़ा है। दिलचस्प बात यह है कि आईपीए से संबंधित समृद्ध जीन एपॉप्टोटिक मार्ग में प्रो-एपॉप्टोटिक और प्रो-जीवन रक्षा संकेतों को प्रेरित करने में सक्षम हैं [54], जिससे पता चलता है कि आईपीए इन जीनों के साथ परस्पर क्रिया करके एपॉप्टोटिक मार्ग या जीवन रक्षा को प्रेरित कर सकता है। हालांकि, एचएससी सक्रियण के दौरान आईपीए किस प्रकार एपॉप्टोसिस या जीवन रक्षा को प्रेरित करता है और इसके क्रियाविधि संबंधी मार्ग अभी भी स्पष्ट नहीं हैं।
आईपीए एक माइक्रोबियल मेटाबोलाइट है जो आंत के माइक्रोबायोटा के माध्यम से आहार ट्रिप्टोफैन से बनता है। अध्ययनों से पता चला है कि इसमें आंतों के वातावरण में सूजन-रोधी, एंटीऑक्सीडेंट और एपिजेनेटिक नियामक गुण होते हैं।[55] अध्ययनों से पता चला है कि आईपीए आंतों की बाधा कार्यप्रणाली को नियंत्रित कर सकता है और ऑक्सीडेटिव तनाव को कम कर सकता है, जो इसके स्थानीय शारीरिक प्रभावों में योगदान दे सकता है।[56] वास्तव में, आईपीए परिसंचरण के माध्यम से लक्षित अंगों तक पहुँचाया जाता है, और चूंकि आईपीए ट्रिप्टोफैन, सेरोटोनिन और इंडोल डेरिवेटिव के साथ एक समान प्रमुख मेटाबोलाइट संरचना साझा करता है, इसलिए आईपीए प्रतिस्पर्धी चयापचय परिणामों के परिणामस्वरूप चयापचय क्रियाएं करता है।[52] आईपीए एंजाइमों या रिसेप्टर्स पर बंधन स्थलों के लिए ट्रिप्टोफैन-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकता है, जिससे सामान्य चयापचय मार्ग बाधित हो सकते हैं। यह इसके चिकित्सीय प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए इसके फार्माकोकाइनेटिक्स और फार्माकोडायनामिक्स पर आगे के अध्ययनों की आवश्यकता को उजागर करता है।[57] यह देखना बाकी है कि क्या यह हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) में भी हो सकता है।
हम स्वीकार करते हैं कि हमारे अध्ययन में कुछ सीमाएँ हैं। IPA से संबंधित संबंधों की विशेष रूप से जांच करने के लिए, हमने टाइप 2 मधुमेह (T2DM) वाले रोगियों को अध्ययन से बाहर रखा। हम मानते हैं कि इससे टाइप 2 मधुमेह और उन्नत यकृत रोग वाले रोगियों पर हमारे निष्कर्षों की व्यापक प्रयोज्यता सीमित हो जाती है। यद्यपि मानव सीरम में IPA की शारीरिक सांद्रता 1–10 μM [11, 20] होती है, फिर भी 1 mM IPA की सांद्रता को उच्चतम गैर-विषाक्त सांद्रता [15] और एपोप्टोसिस की उच्चतम दर के आधार पर चुना गया, जिसमें नेक्रोटिक कोशिका आबादी के प्रतिशत में कोई अंतर नहीं था। यद्यपि इस अध्ययन में IPA के अतिशारीरिक स्तरों का उपयोग किया गया था, फिर भी IPA की प्रभावी खुराक के संबंध में वर्तमान में कोई आम सहमति नहीं है [52]। यद्यपि हमारे परिणाम महत्वपूर्ण हैं, IPA का व्यापक चयापचय भाग्य अभी भी अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र बना हुआ है। इसके अलावा, सीरम IPA स्तरों और यकृत प्रतिलेखों के DNA मिथाइलेशन के बीच संबंध पर हमारे निष्कर्ष न केवल हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं (HSCs) से बल्कि यकृत ऊतकों से भी प्राप्त किए गए थे। हमने मानव LX-2 कोशिकाओं का उपयोग करने का निर्णय लिया, जो कि ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण से प्राप्त हमारे पिछले निष्कर्षों पर आधारित है कि IPA, हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (HSC) सक्रियण से जुड़ा है [15], और HSC, लिवर फाइब्रोसिस की प्रगति में शामिल प्रमुख कोशिकाएं हैं। लिवर कई प्रकार की कोशिकाओं से बना होता है, इसलिए IPA की भूमिका और अन्य लिवर कोशिका प्रकारों के साथ इसकी परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए, कैस्पेस सक्रियण और डीएनए विखंडन के साथ संयुक्त हेपेटोसाइट-HSC-प्रतिरक्षा कोशिका सह-संस्कृति प्रणाली जैसे अन्य कोशिका मॉडल और प्रोटीन स्तर सहित क्रियाविधि पर विचार किया जाना चाहिए।