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फफूंद जनित रोग नेक्रोसिस के कारक कारक स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम (लिब.) डी बेरी विभिन्न मेजबान पौधों को संक्रमित करने के लिए एक बहुस्तरीय रणनीति का उपयोग करता है। यह अध्ययन डायमाइन एल-ऑर्निथिन के उपयोग का प्रस्ताव करता है, जो एक गैर-प्रोटीन अमीनो अम्ल है और अन्य आवश्यक अमीनो अम्लों के संश्लेषण को उत्तेजित करता है। इसका उपयोग स्यूडोमोनास स्क्लेरोटियोरम द्वारा उत्पन्न सफेद फफूंद के प्रति फेजोलस वल्गारिस एल. की आणविक, शारीरिक और जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक प्रबंधन रणनीति के रूप में किया जा सकता है। इन विट्रो प्रयोगों से पता चला कि एल-ऑर्निथिन ने एस. पाइरेनोइडोसा के माइसेलियल विकास को खुराक के आधार पर काफी हद तक बाधित किया। इसके अलावा, ग्रीनहाउस परिस्थितियों में यह सफेद फफूंद की गंभीरता को काफी हद तक कम कर सकता है। साथ ही, एल-ऑर्निथिन ने उपचारित पौधों के विकास को उत्तेजित किया, जिससे यह संकेत मिलता है कि एल-ऑर्निथिन की परीक्षण की गई सांद्रता उपचारित पौधों के लिए विषैली नहीं थी। इसके अतिरिक्त, एल-ऑर्निथिन ने गैर-एंजाइमेटिक एंटीऑक्सीडेंट (कुल घुलनशील फेनोलिक्स और फ्लेवोनोइड्स) और एंजाइमेटिक एंटीऑक्सीडेंट (कैटलेज (CAT), पेरोक्सीडेज (POX), और पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज (PPO)) की अभिव्यक्ति को बढ़ाया, और तीन एंटीऑक्सीडेंट-संबंधित जीन (PvCAT1, PvSOD, और PvGR) की अभिव्यक्ति को भी बढ़ाया। इसके अलावा, इन सिलिको विश्लेषण से एस. स्क्लेरोटियोरम जीनोम में एक संभावित ऑक्सैलोएसीटेट एसिटाइलहाइड्रोलेज (SsOAH) प्रोटीन की उपस्थिति का पता चला, जो कार्यात्मक विश्लेषण, संरक्षित डोमेन और टोपोलॉजी के संदर्भ में एस्परजिलस फिजिएन्सिस (AfOAH) और पेनिसिलियम एसपी. (PlOAH) के ऑक्सैलोएसीटेट एसिटाइलहाइड्रोलेज (SsOAH) प्रोटीन के समान था। रोचक तथ्य यह है कि आलू डेक्सट्रोज ब्रोथ (पीडीबी) माध्यम में एल-ऑर्निथिन मिलाने से एस. स्क्लेरोटियोरम माइसेलिया में एसएसओएएच जीन की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय कमी आई। इसी प्रकार, उपचारित पौधों से एकत्रित कवक माइसेलिया में भी एल-ऑर्निथिन के बाह्य अनुप्रयोग से एसएसओएएच जीन की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय कमी आई। अंत में, एल-ऑर्निथिन के प्रयोग से पीडीबी माध्यम और संक्रमित पत्तियों दोनों में ऑक्सालिक अम्ल स्राव में उल्लेखनीय कमी आई। निष्कर्षतः, एल-ऑर्निथिन रेडॉक्स स्थिति को बनाए रखने के साथ-साथ संक्रमित पौधों की रक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस अध्ययन के परिणाम सफेद फफूंद को नियंत्रित करने और सेम उत्पादन और अन्य फसलों पर इसके प्रभाव को कम करने के लिए नवीन, पर्यावरण के अनुकूल विधियों को विकसित करने में सहायक हो सकते हैं।
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम (लिब.) डी बेरी नामक परपोषी कवक के कारण होने वाली सफेद फफूंद एक विनाशकारी रोग है जो उपज को कम करता है और वैश्विक स्तर पर सेम (फेजोलस वल्गारिस एल.) के उत्पादन के लिए गंभीर खतरा पैदा करता है (बोल्टन एट अल., 2006)। स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम मिट्टी में पाए जाने वाले कवक जनित पादप रोगजनकों में से एक है जिसे नियंत्रित करना सबसे कठिन है, क्योंकि यह 600 से अधिक पौधों की प्रजातियों को प्रभावित करता है और मेजबान ऊतकों को तेजी से और गैर-विशिष्ट तरीके से नष्ट करने की क्षमता रखता है (लियांग और रोलिंस, 2018)। प्रतिकूल परिस्थितियों में, यह अपने जीवन चक्र के एक महत्वपूर्ण चरण से गुजरता है, और लंबे समय तक निष्क्रिय अवस्था में रहता है। यह मिट्टी में काले, कठोर, बीज जैसे संरचनाओं के रूप में रहता है जिन्हें 'स्क्लेरोटिया' कहा जाता है या संक्रमित पौधों के माइसेलियम या तने के मज्जा में सफेद, रोएँदार वृद्धि के रूप में रहता है (श्वार्ट्ज एट अल., 2005)। एस. स्क्लेरोटियोरम स्क्लेरोटिया बनाने में सक्षम है, जिससे यह संक्रमित खेतों में लंबे समय तक जीवित रह सकता है और रोग के दौरान बना रह सकता है (श्वार्ट्ज एट अल., 2005)। स्क्लेरोटिया पोषक तत्वों से भरपूर होते हैं, मिट्टी में लंबे समय तक बने रह सकते हैं और बाद के संक्रमणों के लिए प्राथमिक रोगाणु के रूप में कार्य करते हैं (श्वार्ट्ज एट अल., 2005)। अनुकूल परिस्थितियों में, स्क्लेरोटिया अंकुरित होते हैं और हवा में फैलने वाले बीजाणु उत्पन्न करते हैं जो पौधे के सभी ऊपरी भागों को संक्रमित कर सकते हैं, जिनमें फूल, तने या फली शामिल हैं (श्वार्ट्ज एट अल., 2005)।
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम अपने मेजबान पौधों को संक्रमित करने के लिए एक बहुस्तरीय रणनीति का उपयोग करता है, जिसमें स्क्लेरोटियल अंकुरण से लेकर लक्षण विकास तक समन्वित घटनाओं की एक श्रृंखला शामिल होती है। प्रारंभ में, एस. स्क्लेरोटियोरम मशरूम जैसी संरचनाओं, जिन्हें एपोथेशिया कहा जाता है, से निलंबित बीजाणु (जिन्हें एस्कोस्पोर्स कहा जाता है) उत्पन्न करता है, जो हवा में फैल जाते हैं और संक्रमित पौधे के मलबे पर गतिहीन स्क्लेरोटिया में विकसित हो जाते हैं (बोल्टन एट अल., 2006)। इसके बाद कवक ऑक्सालिक एसिड, एक रोगजनक कारक, स्रावित करता है, जो पौधे की कोशिका भित्ति के पीएच को नियंत्रित करता है, एंजाइमेटिक अपघटन और ऊतक आक्रमण को बढ़ावा देता है (हेगेदस और रिमर, 2005), और मेजबान पौधे के ऑक्सीडेटिव विस्फोट को दबाता है। यह अम्लीकरण प्रक्रिया पौधे की कोशिका भित्ति को कमजोर कर देती है, जिससे कवक कोशिका भित्ति को नष्ट करने वाले एंजाइमों (सीडब्लूडीई) के सामान्य और कुशल संचालन के लिए अनुकूल वातावरण बनता है, जिससे रोगजनक भौतिक अवरोध को पार करके मेजबान ऊतकों में प्रवेश कर पाता है (मार्शियानो एट अल., 1983)। एक बार शरीर में प्रवेश करने के बाद, एस. स्क्लेरोटियोरम कई सीडब्लूडीई स्रावित करता है, जैसे कि पॉलीगैलेक्ट्यूरोनेज़ और सेल्युलेज़, जो संक्रमित ऊतकों में इसके प्रसार को सुगम बनाते हैं और ऊतक परिगलन का कारण बनते हैं। घावों और हाइफल मैट की प्रगति से सफेद फफूंद के विशिष्ट लक्षण उत्पन्न होते हैं (हेगेदस और रिमर, 2005)। इस बीच, मेजबान पौधे पैटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर्स (पीआरआर) के माध्यम से रोगजनक-संबंधित आणविक पैटर्न (पीएएमपी) को पहचानते हैं, जिससे संकेतों की एक श्रृंखला शुरू होती है जो अंततः रक्षा प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करती है।
दशकों से रोग नियंत्रण के प्रयासों के बावजूद, अन्य व्यावसायिक फसलों की तरह ही, सेम में भी पर्याप्त प्रतिरोधी रोगाणुओं की कमी बनी हुई है, जिसका कारण रोगजनक की प्रतिरोधक क्षमता, जीवित रहने की क्षमता और अनुकूलनशीलता है। इसलिए, रोग प्रबंधन अत्यंत चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए एक एकीकृत, बहुआयामी रणनीति की आवश्यकता है जिसमें कृषि पद्धतियों, जैविक नियंत्रण और रासायनिक फफूंदनाशकों का संयोजन शामिल हो (ओ'सुलिवन एट अल., 2021)। सफेद फफूंद का रासायनिक नियंत्रण सबसे प्रभावी है क्योंकि फफूंदनाशकों को सही ढंग से और सही समय पर लगाने से रोग के प्रसार को प्रभावी ढंग से नियंत्रित किया जा सकता है, संक्रमण की गंभीरता को कम किया जा सकता है और उपज के नुकसान को न्यूनतम किया जा सकता है। हालांकि, फफूंदनाशकों का अत्यधिक उपयोग और उन पर अत्यधिक निर्भरता एस. स्क्लेरोटियोरम के प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव का कारण बन सकती है और गैर-लक्षित जीवों, मिट्टी के स्वास्थ्य और जल की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव डाल सकती है (ले कोइंटे एट अल., 2016; सेरेसिनी एट अल., 2024)। इसलिए, पर्यावरण के अनुकूल विकल्पों की खोज करना सर्वोच्च प्राथमिकता बन गई है।
पॉलीएमाइन (पीए), जैसे कि पुट्रेसीन, स्पर्मिडीन, स्पर्मिन और कैडावेरिन, मिट्टी जनित पादप रोगजनकों के खिलाफ आशाजनक विकल्प के रूप में काम कर सकते हैं, जिससे खतरनाक रासायनिक फफूंदनाशकों के उपयोग को पूरी तरह या आंशिक रूप से कम किया जा सकता है (नेहेला एट अल., 2024; यी एट अल., 2024)। उच्च पौधों में, पीए कई शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल होते हैं, जिनमें कोशिका विभाजन, विभेदन और अजैविक और जैविक तनावों के प्रति प्रतिक्रिया शामिल हैं (किलिनी और नेहेला, 2020)। ये एंटीऑक्सीडेंट के रूप में कार्य कर सकते हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) को नष्ट करने में सहायता कर सकते हैं, रेडॉक्स होमियोस्टेसिस बनाए रख सकते हैं (नेहेला और किलिनी, 2023), रक्षा-संबंधी जीनों को प्रेरित कर सकते हैं (रोमेरो एट अल., 2018), विभिन्न चयापचय मार्गों को विनियमित कर सकते हैं (नेहेला और किलिनी, 2023), अंतर्जात फाइटोहोर्मोन को नियंत्रित कर सकते हैं (नेहेला और किलिनी, 2019), प्रणालीगत अधिग्रहित प्रतिरोध (SAR) स्थापित कर सकते हैं, और पादप-रोगजनक अंतःक्रियाओं को विनियमित कर सकते हैं (नेहेला और किलिनी, 2020; असिजा एट अल., 2022; ज़ेरवोनीक, 2022)। यह ध्यान देने योग्य है कि पादप रक्षा में PAs के विशिष्ट तंत्र और भूमिकाएँ पादप प्रजातियों, रोगजनकों और पर्यावरणीय परिस्थितियों के आधार पर भिन्न होती हैं। पौधों में सबसे प्रचुर मात्रा में पाया जाने वाला PA आवश्यक पॉलीएमीन L-ऑर्निथिन से जैवसंश्लेषित होता है (किलिनी और नेहेला, 2020)।
एल-ऑर्निथिन पौधों की वृद्धि और विकास में अनेक भूमिकाएँ निभाता है। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि चावल (ओरिज़ा सैटिवा) में, ऑर्निथिन नाइट्रोजन पुनर्चक्रण (लियू एट अल., 2018), चावल की उपज, गुणवत्ता और सुगंध (लू एट अल., 2020) और जल तनाव प्रतिक्रिया (यांग एट अल., 2000) से संबंधित हो सकता है। इसके अलावा, एल-ऑर्निथिन के बाह्य अनुप्रयोग ने चुकंदर (बीटा वल्गारिस) में सूखा सहिष्णुता को उल्लेखनीय रूप से बढ़ाया (हुसैन एट अल., 2019) और प्याज (एलियम सेपा) (कावुसोग्लू और कावुसोग्लू, 2021) और काजू (एनाकार्डियम ऑक्सीडेंटेल) पौधों (दा रोचा एट अल., 2012) में नमक तनाव को कम किया। अजैविक तनाव से बचाव में एल-ऑर्निथिन की संभावित भूमिका उपचारित पौधों में प्रोलाइन संचय में इसकी भागीदारी के कारण हो सकती है। उदाहरण के लिए, प्रोलाइन चयापचय से संबंधित जीन, जैसे कि ऑर्निथिन डेल्टा एमिनोट्रांसफरेज (डेल्टा-ओएटी) और प्रोलाइन डीहाइड्रोजनेज (प्रोडीएच1 और प्रोडीएच2) जीन, निकोटियाना बेंथैमियाना और अरेबिडोप्सिस थैलिआना की गैर-मेजबान स्यूडोमोनास सिरिंगे उपभेदों के खिलाफ रक्षा में शामिल होने की सूचना पहले दी गई है (सेंथिल-कुमार और मैसूर, 2012)। दूसरी ओर, कवक ऑर्निथिन डीकार्बोक्सिलेज (ओडीसी) रोगजनक वृद्धि के लिए आवश्यक है (सिंह एट अल., 2020)। मेजबान-प्रेरित जीन साइलेंसिंग (एचआईएसजी) के माध्यम से फ्यूजेरियम ऑक्सीस्पोरम एफ. एसपी. लाइकोपर्सिकी के ओडीसी को लक्षित करने से टमाटर के पौधों की फ्यूजेरियम विल्ट के प्रति प्रतिरोधक क्षमता में उल्लेखनीय वृद्धि हुई (सिंह एट अल., 2020)। हालांकि, पादप रोगजनकों जैसे जैविक तनावों के खिलाफ बाह्य ऑर्निथिन अनुप्रयोग की संभावित भूमिका का अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि रोग प्रतिरोधक क्षमता पर ऑर्निथिन के प्रभाव और उससे संबंधित जैव रासायनिक और शारीरिक घटनाएं काफी हद तक अनछुए ही हैं।
दलहन फसलों में स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिनिया के संक्रमण की जटिलता को समझना प्रभावी नियंत्रण रणनीतियों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन में, हमारा उद्देश्य दलहन पौधों की रक्षा प्रणाली और स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिनिया के संक्रमण के प्रति प्रतिरोधक क्षमता बढ़ाने में डायमाइन एल-ऑर्निथिन की संभावित भूमिका की पहचान करना था। हमारा मानना ​​है कि संक्रमित पौधों की रक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने के अलावा, एल-ऑर्निथिन रेडॉक्स स्थिति को बनाए रखने में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हमारा प्रस्ताव है कि एल-ऑर्निथिन के संभावित प्रभाव एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक एंटीऑक्सीडेंट रक्षा तंत्रों के नियमन और कवक रोगजनकता/विषाणु कारकों और संबंधित प्रोटीनों के साथ हस्तक्षेप से संबंधित हैं। एल-ऑर्निथिन की यह दोहरी कार्यक्षमता इसे सफेद फफूंद के प्रभाव को कम करने और सामान्य दलहन फसलों की इस शक्तिशाली कवक रोगजनक के प्रति प्रतिरोधक क्षमता बढ़ाने के लिए एक स्थायी रणनीति के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार बनाती है। वर्तमान अध्ययन के परिणाम सफेद फफूंद को नियंत्रित करने और दलहन उत्पादन पर इसके प्रभाव को कम करने के लिए नवीन, पर्यावरण के अनुकूल तरीकों के विकास में सहायक हो सकते हैं।
इस अध्ययन में, सामान्य बीन की एक संवेदनशील व्यावसायिक किस्म, गीज़ा 3 (फेजोलस वल्गारिस एल. सीवी. गीज़ा 3), को प्रायोगिक सामग्री के रूप में उपयोग किया गया। स्वस्थ बीज मिस्र के कृषि अनुसंधान केंद्र (एआरसी) के फील्ड क्रॉप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट (एफसीआरआई) के लेग्यूम रिसर्च डिपार्टमेंट द्वारा उपलब्ध कराए गए थे। ग्रीनहाउस परिस्थितियों (25 ± 2 °C, सापेक्ष आर्द्रता 75 ± 1%, 8 घंटे प्रकाश/16 घंटे अंधेरा) में एस. स्क्लेरोटियोरम से संक्रमित मिट्टी से भरे प्लास्टिक के गमलों (आंतरिक व्यास 35 सेमी, गहराई 50 सेमी) में पाँच बीज बोए गए। बुवाई के 7-10 दिन बाद (डीपीएस), प्रत्येक गमले में एक समान वृद्धि और तीन पूरी तरह से विकसित पत्तियों वाले केवल दो पौधों को छोड़कर बाकी पौधों को छाँट लिया गया। सभी गमलों में लगे पौधों को हर दो सप्ताह में एक बार पानी दिया गया और दी गई किस्म के लिए अनुशंसित मात्रा में मासिक रूप से उर्वरक दिया गया।
एल-ऑर्निथिनडायमाइन (जिसे (+)-(एस)-2,5-डायमिनोपेंटानोइक एसिड के नाम से भी जाना जाता है; सिग्मा-एल्ड्रिच, डार्मस्टेड, जर्मनी) की 500 मिलीग्राम/लीटर सांद्रता तैयार करने के लिए, सबसे पहले 50 मिलीग्राम को 100 मिलीलीटर रोगाणुरहित आसुत जल में घोला गया। इसके बाद, इस घोल को तनु किया गया और आगे के प्रयोगों में इसका उपयोग किया गया। संक्षेप में, एल-ऑर्निथिन की छह सांद्रताओं (12.5, 25, 50, 75, 100 और 125 मिलीग्राम/लीटर) का इन विट्रो परीक्षण किया गया। इसके अतिरिक्त, रोगाणुरहित आसुत जल को ऋणात्मक नियंत्रण (मॉक) के रूप में और व्यावसायिक फफूंदनाशक "रिज़ोलेक्स-टी" 50% वेटेबल पाउडर (टोक्लोफोस-मिथाइल 20% + थिरम 30%; केजेड-काफ़र अल ज़ायत पेस्टिसाइड्स एंड केमिकल्स कंपनी, काफ़र अल ज़ायत, घरबिया गवर्नरेट, मिस्र) को धनात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया। वाणिज्यिक फफूंदनाशक "रिज़ोलेक्स-टी" का इन विट्रो परीक्षण पांच सांद्रताओं (2, 4, 6, 8 और 10 मिलीग्राम/लीटर) पर किया गया।
सफेद फफूंद के विशिष्ट लक्षण दर्शाने वाले (संक्रमण दर: 10-30%) सामान्य सेम के तनों और फलियों के नमूने व्यावसायिक खेतों से एकत्र किए गए। यद्यपि संक्रमित पौधों की अधिकांश सामग्री की प्रजाति/किस्म (संवेदनशील व्यावसायिक किस्म गीज़ा 3) के आधार पर पहचान की गई, अन्य, विशेष रूप से स्थानीय बाजारों से प्राप्त की गई, अज्ञात प्रजाति की थीं। एकत्रित संक्रमित सामग्रियों को पहले 0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोल से 3 मिनट के लिए सतह से कीटाणुरहित किया गया, फिर कई बार रोगाणु रहित आसुत जल से धोया गया और अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए रोगाणु रहित फिल्टर पेपर से सुखाया गया। इसके बाद संक्रमित अंगों को मध्य ऊतक (स्वस्थ और संक्रमित ऊतकों के बीच) से छोटे-छोटे टुकड़ों में काटा गया, आलू डेक्सट्रोज अगर (पीडीए) माध्यम पर संवर्धित किया गया और स्क्लेरोटिया निर्माण को प्रोत्साहित करने के लिए 25 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे प्रकाश/12 घंटे अंधेरे चक्र में 5 दिनों तक इनक्यूबेट किया गया। मिश्रित या दूषित संवर्धनों से कवक पृथकों को शुद्ध करने के लिए माइसेलियल टिप विधि का भी उपयोग किया गया। शुद्ध किए गए कवक पृथक को सर्वप्रथम उसकी संवर्धित रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर पहचाना गया और फिर सूक्ष्मदर्शी विशेषताओं के आधार पर एस. स्क्लेरोटियोरम के रूप में पुष्टि की गई। अंत में, कोच के सिद्धांतों को पूरा करने के लिए सभी शुद्ध पृथकों का रोगजनन क्षमता के लिए संवेदनशील सामान्य बीन किस्म गीज़ा 3 पर परीक्षण किया गया।
इसके अतिरिक्त, सबसे आक्रामक एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट (आइसोलेट #3) की पुष्टि व्हाइट एट अल., 1990; बटुरो-सिएस्निएस्का एट अल., 2017 द्वारा वर्णित आंतरिक ट्रांसक्राइब्ड स्पेसर (आईटीएस) अनुक्रमण के आधार पर की गई। संक्षेप में, आइसोलेट्स को पोटैटो डेक्सट्रोज ब्रोथ (पीडीबी) में संवर्धित किया गया और 25 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 दिनों तक इनक्यूबेट किया गया। फिर फंगल माइसेलियम को एकत्र किया गया, चीज़क्लॉथ से छाना गया, दो बार रोगाणु रहित पानी से धोया गया और रोगाणु रहित फिल्टर पेपर से सुखाया गया। जीनोमिक डीएनए को क्विक-डीएनए™ फंगल/बैक्टीरियल मिनीप्रेप किट (कुरामे-इज़िओका, 1997; अतल्लाह एट अल., 2022, 2024) का उपयोग करके पृथक किया गया। इसके बाद, विशिष्ट प्राइमर युग्म ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; अपेक्षित आकार: 540 bp) का उपयोग करके ITS rDNA क्षेत्र को प्रवर्धित किया गया (बटुरो-सिएस्निएस्का एट अल., 2017)। शुद्ध किए गए पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमण के लिए भेजा गया (बीजिंग आओके डिंगशेंग बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड)। ITS rDNA अनुक्रमों का अनुक्रमण सैंगर अनुक्रमण विधि का उपयोग करके द्विदिशात्मक रूप से किया गया। एकत्रित क्वेरी अनुक्रमों की तुलना BLASTn सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके GenBank और राष्ट्रीय जैव प्रौद्योगिकी सूचना केंद्र (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) के नवीनतम डेटा से की गई। क्वेरी अनुक्रम की तुलना NCBI GenBank के नवीनतम डेटा से प्राप्त 20 अन्य S. sclerotiorum उपभेदों/आइसोलेट्स (पूरक तालिका S1) से की गई, जिसके लिए मॉलिक्यूलर इवोल्यूशनरी जेनेटिक्स एनालिसिस पैकेज (MEGA-11; संस्करण 11) (कुमार एट अल., 2024) में ClustalW का उपयोग किया गया। विकासवादी विश्लेषण अधिकतम संभावना विधि और सामान्य समय-प्रतिवर्ती न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन मॉडल (नेई और कुमार, 2000) का उपयोग करके किया गया। उच्चतम लॉग-संभावना वाला वृक्ष दर्शाया गया है। ह्यूरिस्टिक खोज के लिए प्रारंभिक वृक्ष का चयन नेबर-जॉइनिंग (NJ) वृक्ष (कुमार एट अल., 2024) और अधिकतम पार्सिमोनी (MP) वृक्ष के बीच उच्च लॉग-संभावना वाले वृक्ष को चुनकर किया गया। NJ वृक्ष का निर्माण सामान्य समय-प्रतिवर्ती मॉडल (नेई और कुमार, 2000) का उपयोग करके गणना की गई युग्म दूरी मैट्रिक्स का उपयोग करके किया गया था।
एल-ऑर्निथिन और जीवाणुनाशक "रिज़ोलेक्स-टी" की जीवाणुरोधी गतिविधि का निर्धारण इन विट्रो में एगर डिफ्यूजन विधि द्वारा किया गया। विधि: एल-ऑर्निथिन (500 मिलीग्राम/लीटर) के स्टॉक विलयन की उचित मात्रा लें और इसे 10 मिलीलीटर पीडीए पोषक माध्यम में अच्छी तरह से मिलाकर क्रमशः 12.5, 25, 50, 75, 100 और 125 मिलीग्राम/लीटर की अंतिम सांद्रता वाले विलयन तैयार करें। कवकनाशी "रिज़ोलेक्स-टी" की पाँच सांद्रता (2, 4, 6, 8 और 10 मिलीग्राम/लीटर) और निष्फल आसुत जल को नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया गया। माध्यम के जमने के बाद, स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम संवर्धन के 4 मिमी व्यास वाले ताजे तैयार किए गए माइसेलियल प्लग को पेट्री डिश के केंद्र में स्थानांतरित किया गया और 25±2°C पर तब तक संवर्धन किया गया जब तक कि माइसेलियम ने पूरी नियंत्रण पेट्री डिश को ढक नहीं लिया, जिसके बाद कवक की वृद्धि दर्ज की गई। समीकरण 1 का उपयोग करके एस. स्क्लेरोटियोरम की रेडियल वृद्धि के प्रतिशत अवरोध की गणना करें:
प्रयोग को दो बार दोहराया गया, जिसमें प्रत्येक नियंत्रण/प्रायोगिक समूह के लिए छह जैविक प्रतिकृतियाँ और प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए पाँच गमले (प्रत्येक गमले में दो पौधे) शामिल थे। प्रयोगात्मक परिणामों की सटीकता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक जैविक प्रतिकृति का दो बार विश्लेषण किया गया (दो तकनीकी प्रतिकृतियाँ)। इसके अतिरिक्त, अर्ध-अधिकतम निरोधात्मक सांद्रता (IC50) और IC99 की गणना के लिए प्रोबिट प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग किया गया (प्रेन्टिस, 1976)।
ग्रीनहाउस परिस्थितियों में एल-ऑर्निथिन की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, दो लगातार पॉट प्रयोग किए गए। संक्षेप में, गमलों को निष्फल चिकनी मिट्टी-रेत (3:1) से भरा गया और उनमें एस. स्क्लेरोटियोरम के ताज़ा तैयार किए गए कल्चर को डाला गया। सबसे पहले, एस. स्क्लेरोटियोरम के सबसे आक्रामक आइसोलेट (आइसोलेट #3) को कल्चर करने के लिए, एक स्क्लेरोटियम को आधा काटकर, उसे पीडीए पर उल्टा रखकर, 25°C पर 24 घंटे तक लगातार अंधेरे में 4 दिनों के लिए रखा गया ताकि माइसेलियल वृद्धि को बढ़ावा मिल सके। इसके बाद, किनारे से 5 मिमी व्यास के चार अगर प्लग लिए गए और उनमें 100 ग्राम गेहूं और चावल के चोकर (1:1, v/v) के निष्फल मिश्रण को डाला गया और सभी फ्लास्कों को 25 ± 2 °C पर 12 घंटे प्रकाश/12 घंटे अंधेरे चक्र में 5 दिनों के लिए रखा गया ताकि स्क्लेरोटिया निर्माण को बढ़ावा मिल सके। मिट्टी डालने से पहले सभी फ्लास्कों की सामग्री को अच्छी तरह से मिलाया गया ताकि एकरूपता सुनिश्चित हो सके। फिर, रोगजनकों की एक समान सांद्रता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक गमले में 100 ग्राम कॉलोनाइजिंग चोकर का मिश्रण डाला गया। फफूंद की वृद्धि को सक्रिय करने के लिए इनोप्यूलेटेड गमलों में पानी डाला गया और उन्हें 7 दिनों के लिए ग्रीनहाउस में रखा गया।
इसके बाद प्रत्येक गमले में गीज़ा 3 किस्म के पाँच बीज बोए गए। एल-ऑर्निथिन और फफूंदनाशक रिज़ोलेक्स-टी से उपचारित गमलों के लिए, कीटाणुरहित बीजों को पहले दो घंटे के लिए दोनों यौगिकों के जलीय घोल में भिगोया गया, जिसकी अंतिम IC99 सांद्रता क्रमशः लगभग 250 मिलीग्राम/लीटर और 50 मिलीग्राम/लीटर थी, और फिर बोने से पहले एक घंटे के लिए हवा में सुखाया गया। दूसरी ओर, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बीजों को कीटाणुरहित आसुत जल में भिगोया गया। 10 दिनों के बाद, पहली सिंचाई से पहले, पौधों को छाँटकर प्रत्येक गमले में केवल दो साफ-सुथरे पौधे छोड़ दिए गए। इसके अतिरिक्त, एस. स्क्लेरोटियोरम से संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए, एक ही विकास अवस्था (10 दिन) के सेम के पौधों के तनों को कीटाणुरहित स्केलपेल से दो अलग-अलग स्थानों पर काटा गया और प्रत्येक घाव में लगभग 0.5 ग्राम कॉलोनाइजिंग चोकर मिश्रण डाला गया, इसके बाद सभी संक्रमित पौधों में संक्रमण और रोग के विकास को उत्तेजित करने के लिए उच्च आर्द्रता प्रदान की गई। नियंत्रण पौधों को भी इसी प्रकार घायल किया गया और घाव में समान मात्रा (0.5 ग्राम) में रोगाणु रहित, असंक्रमित चोकर का मिश्रण रखा गया और रोग के विकास के लिए अनुकूल वातावरण बनाने और उपचार समूहों के बीच एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए इसे उच्च आर्द्रता में रखा गया।
उपचार विधि: बीन के पौधों को 500 मिलीलीटर एल-ऑर्निथिन (250 मिलीग्राम/लीटर) या फफूंदनाशक रिज़ोलेक्स-टी (50 मिलीग्राम/लीटर) के जलीय घोल से सींचा गया, फिर उपचार को 10 दिनों के अंतराल पर तीन बार दोहराया गया। प्लेसीबो-उपचारित नियंत्रणों को 500 मिलीलीटर रोगाणु रहित आसुत जल से सींचा गया। सभी उपचार ग्रीनहाउस परिस्थितियों (25 ± 2°C, 75 ± 1% सापेक्ष आर्द्रता और 8 घंटे प्रकाश/16 घंटे अंधकार का प्रकाशकाल) में किए गए। सभी गमलों को पखवाड़े में एक बार पानी दिया गया और महीने में एक बार संतुलित एनपीके उर्वरक (20-20-20, जिसमें 3.6% सल्फर और टीई सूक्ष्म तत्व शामिल हैं; ज़ैन सीड्स, मिस्र) का 3-4 ग्राम/लीटर की सांद्रता पर पत्तियों पर छिड़काव किया गया, जो विशिष्ट किस्म की सिफारिशों और निर्माता के निर्देशों के अनुसार था। जब तक अन्यथा उल्लेख न किया जाए, उपचार के 72 घंटे बाद (एचपीटी) प्रत्येक जैविक प्रतिकृति से पूरी तरह से विकसित परिपक्व पत्तियों (ऊपर से दूसरी और तीसरी पत्तियां) को एकत्र किया गया, उन्हें समरूप बनाया गया, एकत्रित किया गया और आगे के विश्लेषणों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया, जिसमें ऑक्सीडेटिव तनाव संकेतकों का इन सीटू हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण, लिपिड पेरोक्सीडेशन, एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक एंटीऑक्सिडेंट और जीन अभिव्यक्ति शामिल हैं, लेकिन इन्हीं तक सीमित नहीं हैं।
सफेद फफूंद संक्रमण की तीव्रता का आकलन 21 दिन बाद (dpi) साप्ताहिक रूप से 1-9 के पैमाने (पूरक तालिका S2) का उपयोग करके किया गया, जो पेटज़ोल्ड और डिक्सन पैमाने (1996) पर आधारित था, जिसे टेरान एट अल. (2006) द्वारा संशोधित किया गया था। संक्षेप में, बीन के पौधों के तनों और शाखाओं की जांच संक्रमण बिंदु से शुरू करके की गई ताकि इंटरनोड्स और नोड्स के साथ घावों की प्रगति का पता लगाया जा सके। संक्रमण बिंदु से तने या शाखा के सबसे दूर के बिंदु तक घाव की दूरी को मापा गया और घाव के स्थान के आधार पर 1-9 का स्कोर दिया गया, जहां (1) संक्रमण बिंदु के पास कोई दृश्य संक्रमण नहीं दर्शाता है और (2-9) घाव के आकार में क्रमिक वृद्धि और नोड्स/इंटरनोड्स के साथ प्रगति दर्शाता है (पूरक तालिका S2)। सफेद फफूंद संक्रमण की तीव्रता को सूत्र 2 का उपयोग करके प्रतिशत में परिवर्तित किया गया:
इसके अतिरिक्त, रोग प्रगति वक्र के अंतर्गत क्षेत्र (AUDPC) की गणना सूत्र (शैनर और फिन्नी, 1977) का उपयोग करके की गई थी, जिसे हाल ही में समीकरण 3 का उपयोग करके सामान्य बीन के सफेद सड़न रोग के लिए अनुकूलित किया गया था (चौहान एट अल., 2020):
यहां Yi = समय ti पर रोग की गंभीरता, Yi+1 = अगले समय ti+1 पर रोग की गंभीरता, ti = पहले माप का समय (दिनों में), ti+1 = अगले माप का समय (दिनों में), n = समय बिंदुओं या अवलोकन बिंदुओं की कुल संख्या। सभी जैविक प्रतिकृतियों में 21 दिनों तक साप्ताहिक रूप से बीन के पौधे की वृद्धि के मापदंड, जिनमें पौधे की ऊंचाई (सेमी), प्रति पौधे शाखाओं की संख्या और प्रति पौधे पत्तियों की संख्या शामिल है, दर्ज किए गए।
प्रत्येक जैविक प्रतिकृति में, उपचार के 45 दिन बाद (अंतिम उपचार के 15 दिन बाद) पत्ती के नमूने (ऊपर से दूसरी और तीसरी पूरी तरह से विकसित पत्तियां) एकत्र किए गए। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति में पांच गमले थे (प्रत्येक गमले में दो पौधे)। लगभग 500 मिलीग्राम कुचले हुए ऊतक का उपयोग 80% एसीटोन का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में प्रकाश संश्लेषक वर्णक (क्लोरोफिल ए, क्लोरोफिल बी और कैरोटीनॉयड) निकालने के लिए किया गया था। 24 घंटे बाद, नमूनों को सेंट्रीफ्यूज किया गया और क्लोरोफिल ए, क्लोरोफिल बी और कैरोटीनॉयड की मात्रा का रंगमापी विधि से निर्धारण करने के लिए सुपरनेटेंट एकत्र किया गया। यह निर्धारण (लिचेंथेलर, 1987) की विधि के अनुसार यूवी-160ए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग करके तीन अलग-अलग तरंग दैर्ध्य (A470, A646 और A663 एनएम) पर अवशोषण को मापकर किया गया। अंत में, प्रकाश संश्लेषक वर्णकों की सामग्री की गणना लिचेंथेलर (1987) द्वारा वर्णित निम्नलिखित सूत्रों 4-6 का उपयोग करके की गई थी।
उपचार के 72 घंटे बाद (hpt), हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) और सुपरऑक्साइड आयन (O2•−) के इन सीटू हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण के लिए प्रत्येक जैविक प्रतिकृति से पत्तियां (ऊपर से दूसरी और तीसरी पूरी तरह से विकसित पत्तियां) एकत्र की गईं। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति में पांच गमले (प्रत्येक गमले में दो पौधे) शामिल थे। विधि की सटीकता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक जैविक प्रतिकृति का दो बार विश्लेषण किया गया (दो तकनीकी प्रतिकृतियां)। H2O2 और O2•− का निर्धारण क्रमशः 0.1% 3,3′-डायमिनोबेंजिडीन (DAB; सिग्मा-एल्ड्रिच, डार्मस्टेड, जर्मनी) या नाइट्रोब्लू टेट्राज़ोलियम (NBT; सिग्मा-एल्ड्रिच, डार्मस्टेड, जर्मनी) का उपयोग करके, रोमेरो-पुएर्टास एट अल. (2004) और एडम एट अल. (1989) द्वारा वर्णित विधियों में मामूली संशोधनों के साथ किया गया। H2O2 के हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण के लिए, पत्तियों को 10 mM ट्रिस बफर (pH 7.8) में 0.1% DAB के साथ वैक्यूम इन्फिल्ट्रेट किया गया और फिर 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रकाश में रखा गया। पत्तियों को 4:1 (v/v) इथेनॉल:क्लोरोफॉर्म (अल-गोमहोरिया फार्मास्यूटिकल्स एंड मेडिकल सप्लाइज, काहिरा, मिस्र) में 0.15% (v/v) TCA में ब्लीच किया गया और फिर उनके गहरे रंग होने तक प्रकाश में रखा गया। इसी प्रकार, O2•− के हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण के लिए, वाल्वों को 0.1 w/v % HBT युक्त 10 mM पोटेशियम फॉस्फेट बफर (pH 7.8) के साथ वैक्यूम इन्फिल्ट्रेट किया गया। पत्तियों को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रकाश में रखा गया, फिर ऊपर बताए अनुसार ब्लीच किया गया, और फिर गहरे नीले/बैंगनी धब्बे दिखाई देने तक प्रकाश में रखा गया। परिणामी भूरे (H2O2 संकेतक के रूप में) या नीले-बैंगनी (O2•− संकेतक के रूप में) रंग की तीव्रता का आकलन इमेज प्रोसेसिंग पैकेज ImageJ (http://fiji.sc; 7 मार्च 2024 को एक्सेस किया गया) के फिजी संस्करण का उपयोग करके किया गया था।
मैलोंडिएल्डिहाइड (एमडीए; लिपिड पेरोक्सीडेशन के मार्कर के रूप में) का निर्धारण डू और ब्रामलेज (1992) की विधि में कुछ मामूली संशोधनों के साथ किया गया। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति से पत्तियां (ऊपर से दूसरी और तीसरी पूरी तरह से विकसित पत्तियां) उपचार के 72 घंटे बाद (hpt) एकत्र की गईं। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति में पांच गमले (प्रत्येक गमले में दो पौधे) शामिल थे। विधि की सटीकता, विश्वसनीयता और पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक जैविक प्रतिकृति का दो बार विश्लेषण किया गया (दो तकनीकी प्रतिकृतियां)। संक्षेप में, 0.5 ग्राम पिसे हुए पत्ती के ऊतक का उपयोग 20% ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड (टीसीए; मिलिपोरसिग्मा, बर्लिंगटन, एमए, यूएसए) के साथ एमडीए निष्कर्षण के लिए किया गया, जिसमें 0.01% ब्यूटिलेटेड हाइड्रॉक्सिटोल्यूइन (बीएचटी; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) मिला हुआ था। इसके बाद, यूवी-160ए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग करके 532 और 600 एनएम पर अवशोषण को मापकर सुपरनेटेंट में एमडीए की मात्रा को रंगमिति विधि से निर्धारित किया गया और फिर इसे nmol g−1 FW के रूप में व्यक्त किया गया।
गैर-एंजाइमेटिक और एंजाइमेटिक एंटीऑक्सीडेंट के आकलन के लिए, उपचार के 72 घंटे बाद (hpt) प्रत्येक जैविक प्रतिकृति से पत्तियां (ऊपर से दूसरी और तीसरी पूरी तरह से विकसित पत्तियां) एकत्र की गईं। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति में पांच गमले थे (प्रत्येक गमले में दो पौधे)। प्रत्येक जैविक नमूने का दो बार विश्लेषण किया गया (दो तकनीकी नमूने)। दो पत्तियों को तरल नाइट्रोजन के साथ पीसकर एंजाइमेटिक और गैर-एंजाइमेटिक एंटीऑक्सीडेंट, कुल अमीनो एसिड, प्रोलाइन की मात्रा, जीन अभिव्यक्ति और ऑक्सालेट की मात्रा निर्धारित करने के लिए सीधे उपयोग किया गया।
कुल घुलनशील फेनोलिक्स का निर्धारण फोलिन-सियोकाल्टेउ अभिकर्मक (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) का उपयोग करके किया गया, जिसमें कहकोनेन एट अल. (1999) द्वारा वर्णित विधि में कुछ मामूली संशोधन किए गए थे। संक्षेप में, लगभग 0.1 ग्राम समरूप पत्ती ऊतक को 20 मिलीलीटर 80% मेथनॉल के साथ अंधेरे में 24 घंटे के लिए निकाला गया और सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद सुपरनेटेंट को एकत्र किया गया। नमूना अर्क के 0.1 मिलीलीटर को 0.5 मिलीलीटर फोलिन-सियोकाल्टेउ अभिकर्मक (10%) के साथ मिलाया गया, 30 सेकंड के लिए हिलाया गया और 5 मिनट के लिए अंधेरे में छोड़ दिया गया। फिर प्रत्येक ट्यूब में 0.5 मिलीलीटर 20% सोडियम कार्बोनेट घोल (Na2CO3; अल-गोमहोरिया फार्मास्युटिकल्स एंड मेडिकल सप्लाइज कंपनी, काहिरा, मिस्र) मिलाया गया, अच्छी तरह से मिलाया गया और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। इनक्यूबेशन के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण के अवशोषण को यूवी-160ए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग करके 765 एनएम पर मापा गया। नमूना अर्क में कुल घुलनशील फिनोल की सांद्रता गैलिक एसिड अंशांकन वक्र (फिशर साइंटिफिक, हैम्पटन, एनएच, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित की गई और इसे प्रति ग्राम ताजे वजन के गैलिक एसिड समतुल्य मिलीग्राम (mg GAE g-1 ताजा वजन) के रूप में व्यक्त किया गया।
कुल घुलनशील फ्लेवोनोइड सामग्री का निर्धारण जेरिडेन एट अल. (2006) की विधि के अनुसार, कुछ मामूली संशोधनों के साथ किया गया। संक्षेप में, उपरोक्त मेथनॉल अर्क के 0.3 मिलीलीटर को 5% एल्यूमीनियम क्लोराइड विलयन (AlCl3; फिशर साइंटिफिक, हैम्पटन, एनएच, यूएसए) के 0.3 मिलीलीटर के साथ मिलाया गया, अच्छी तरह से हिलाया गया और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए रखा गया। इसके बाद, 10% पोटेशियम एसीटेट विलयन (अल-गोमहोरिया फार्मास्यूटिकल्स एंड मेडिकल सप्लाइज, काहिरा, मिस्र) के 0.3 मिलीलीटर को मिलाया गया, अच्छी तरह से मिलाया गया और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में रखा गया। इनक्यूबेशन के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण के अवशोषण को यूवी-160ए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग करके 430 एनएम पर मापा गया। नमूना अर्क में कुल घुलनशील फ्लेवोनोइड्स की सांद्रता को रुटिन अंशांकन वक्र (TCI अमेरिका, पोर्टलैंड, ओरेगन, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था और फिर इसे प्रति ग्राम ताजे वजन के रुटिन समतुल्य मिलीग्राम (mg RE g-1 ताजा वजन) के रूप में व्यक्त किया गया था।
बीन की पत्तियों में कुल मुक्त अमीनो अम्ल की मात्रा का निर्धारण योकोयामा और हिरामत्सु (2003) द्वारा प्रस्तावित और सन एट अल. (2006) द्वारा संशोधित विधि पर आधारित एक संशोधित निन्हिड्रिन अभिकर्मक (थर्मो साइंटिफिक केमिकल्स, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके किया गया। संक्षेप में, 0.1 ग्राम पिसे हुए ऊतक को पीएच 5.4 बफर के साथ निकाला गया, और 200 μL सुपरनेटेंट को 200 μL निन्हिड्रिन (2%) और 200 μL पाइरिडीन (10%; स्पेक्ट्रम केमिकल, न्यू ब्रंसविक, एनजे, यूएसए) के साथ अभिक्रिया कराया गया, 30 मिनट के लिए उबलते पानी के स्नान में रखा गया, फिर ठंडा किया गया और यूवी-160ए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग करके 580 एनएम पर मापा गया। दूसरी ओर, प्रोलाइन का निर्धारण बेट्स विधि (बेट्स एट अल., 1973) द्वारा किया गया। प्रोलाइन को 3% सल्फोसैलिसिलिक एसिड (थर्मो साइंटिफिक केमिकल्स, वाल्थम, एमए, यूएसए) के साथ निकाला गया और सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद, 0.5 मिलीलीटर सुपरनेटेंट को 1 मिलीलीटर ग्लेशियल एसिटिक एसिड (फिशर साइंटिफिक, हैम्पटन, एनएच, यूएसए) और निन्हिड्रिन अभिकर्मक के साथ मिलाया गया, 90°C पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया, ठंडा किया गया और ऊपर बताए गए समान स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 520 एनएम पर मापा गया। पत्ती के अर्क में कुल मुक्त अमीनो एसिड और प्रोलाइन को क्रमशः ग्लाइसिन और प्रोलाइन कैलिब्रेशन कर्व (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित किया गया और मिलीग्राम/ग्राम ताजे वजन के रूप में व्यक्त किया गया।
एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों की एंजाइमेटिक गतिविधि निर्धारित करने के लिए, लगभग 500 मिलीग्राम समरूप ऊतक को 3 मिलीलीटर 50 mM ट्रिस बफर (pH 7.8) के साथ निकाला गया जिसमें 1 mM EDTA-Na2 (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO, USA) और 7.5% पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (PVP; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, MO, USA) शामिल थे, इसे रेफ्रिजरेशन (4 °C) के तहत 20 मिनट के लिए 10,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और सुपरनेटेंट (कच्चा एंजाइम अर्क) एकत्र किया गया (एल-नागर एट अल., 2023; उस्मान एट अल., 2023)। इसके बाद कैटालेज़ (CAT) की एंजाइमेटिक गतिविधि का निर्धारण एईबी (1984) की विधि में कुछ मामूली संशोधनों के साथ किया गया (एल-नागर एट अल., 2023; उस्मान एट अल., 2023)। इसमें 2 मिलीलीटर 0.1 M सोडियम फॉस्फेट बफर (pH 6.5; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) और 100 μl 269 mM H2O2 विलयन मिलाया गया। गुआयाकोल-निर्भर पेरोक्सीडेज़ (POX) की एंजाइमेटिक गतिविधि का निर्धारण हैराच एट अल. (2009) की विधि का उपयोग करके किया गया। (2008) में मामूली संशोधनों के साथ (एल-नागर एट अल., 2023; उस्मान एट अल., 2023) पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज (पीपीओ) की एंजाइमेटिक गतिविधि का निर्धारण 2.2 मिलीलीटर 100 mM सोडियम फॉस्फेट बफर (pH 6.0), 100 μl गुआयाकोल (TCI केमिकल्स, पोर्टलैंड, ओरेगन, यूएसए) और 100 μl 12 mM H2O2 के साथ प्रतिक्रिया के बाद किया गया। विधि को (एल-नागर एट अल., 2023; उस्मान एट अल., 2023) से थोड़ा संशोधित किया गया था। यह परीक्षण 0.1 M फॉस्फेट बफर (pH 6.0) में ताजा तैयार किए गए 3 मिलीलीटर कैटेकोल घोल (थर्मो साइंटिफिक केमिकल्स, वाल्थम, मैसाचुसेट्स, यूएसए) (0.01 M) के साथ प्रतिक्रिया के बाद किया गया था। CAT गतिविधि को 240 nm (A240) पर H2O2 के अपघटन की निगरानी करके मापा गया, POX गतिविधि को 436 nm (A436) पर अवशोषण में वृद्धि की निगरानी करके मापा गया, और PPO गतिविधि को UV-160A स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाज़ू, जापान) का उपयोग करके 3 मिनट के लिए हर 30 सेकंड में 495 nm (A495) पर अवशोषण में उतार-चढ़ाव को रिकॉर्ड करके मापा गया।
अंतिम उपचार के 72 घंटे बाद, सेम की पत्तियों (ऊपर से दूसरी और तीसरी पूरी तरह विकसित पत्तियां) में तीन एंटीऑक्सीडेंट-संबंधित जीनों, जिनमें पेरॉक्सिसोमल कैटालेज (PvCAT1; जेनबैंक अभिगम संख्या KF033307.1), सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (PvSOD; जेनबैंक अभिगम संख्या XM_068639556.1) और ग्लूटाथियोन रिडक्टेस (PvGR; जेनबैंक अभिगम संख्या KY195009.1) शामिल हैं, के ट्रांसक्रिप्ट स्तरों का पता लगाने के लिए रियल-टाइम RT-PCR का उपयोग किया गया। संक्षेप में, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सिंपली पी टोटल आरएनए एक्सट्रैक्शन किट (कैट. संख्या BSC52S1; बायोफ्लक्स, बायोरी टेक्नोलॉजी, चीन) का उपयोग करके आरएनए को पृथक किया गया। फिर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार TOP स्क्रिप्ट™ सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके सीडीएनए का संश्लेषण किया गया। उपरोक्त तीनों जीनों के प्राइमर अनुक्रम अनुपूरक तालिका S3 में सूचीबद्ध हैं। PvActin-3 (GenBank अभिगम संख्या: XM_068616709.1) को हाउसकीपिंग जीन के रूप में उपयोग किया गया और सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना 2-ΔΔCT विधि (लिवक और श्मिटजेन, 2001) का उपयोग करके की गई। जैविक तनाव (सामान्य फलियों और एन्थ्रेक्नोज कवक Colletotrichum lindemuthianum के बीच असंगत अंतःक्रिया) और अजैविक तनाव (सूखा, लवणता, कम तापमान) के तहत एक्टिन स्थिरता का प्रदर्शन किया गया (बोर्जेस एट अल., 2012)।
हमने प्रारंभ में प्रोटीन-प्रोटीन BLAST टूल (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) का उपयोग करके S. sclerotiorum में ऑक्सैलोएसीटेट एसिटाइलहाइड्रोलेज़ (OAH) प्रोटीन का जीनोम-व्यापी इन सिलिको विश्लेषण किया। संक्षेप में, हमने S. sclerotiorum (taxide: 5180) में समरूप प्रोटीन को मैप करने के लिए क्वेरी अनुक्रम के रूप में Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank अभिगम संख्या XP_040799428.1; 342 अमीनो एसिड) और Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank अभिगम संख्या XP_056833920.1; 316 अमीनो एसिड) से OAH का उपयोग किया। नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन (NCBI) की वेबसाइट http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ पर स्थित GenBank में उपलब्ध S. sclerotiorum जीनोम डेटा के विरुद्ध BLASTp परीक्षण किया गया।
इसके अतिरिक्त, एस. स्क्लेरोटियोरम (SsOAH) से अनुमानित OAH जीन और ए. फिजिएन्सिस CBS 313.89 से AfOAH और पी. लैगेना से PlOAH के विकासवादी विश्लेषण और फाइलोजेनेटिक ट्री का अनुमान MEGA11 (तमूरा एट अल., 2021) में अधिकतम संभावना विधि और JTT मैट्रिक्स-आधारित मॉडल (जोन्स एट अल., 1992) का उपयोग करके लगाया गया था। फाइलोजेनेटिक ट्री को एस. स्क्लेरोटियोरम से सभी अनुमानित OAH जीनों (SsOAH) और क्वेरी अनुक्रम के प्रोटीन अनुक्रमों के बहु संरेखण विश्लेषण के साथ कंस्ट्रेंट-बेस्ड अलाइनमेंट टूल (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (पापाडोपोलोस और अगरवाला, 2007) का उपयोग करके संयोजित किया गया था। इसके अतिरिक्त, एस. स्क्लेरोटियोरम से एस. ओ.ए.एच. के सर्वोत्तम मिलान वाले अमीनो एसिड अनुक्रमों को क्लस्टलडब्ल्यू (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) का उपयोग करके क्वेरी अनुक्रमों (एएफओएएच और पीएलओएएच) (लार्किन एट अल., 2007) के साथ संरेखित किया गया, और संरेखण में संरक्षित क्षेत्रों को ईएसपीआरआईपीटी टूल (संस्करण 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) का उपयोग करके दृश्यित किया गया।
इसके अतिरिक्त, S. sclerotiorum SsOAH के अनुमानित कार्यात्मक प्रतिनिधि डोमेन और संरक्षित स्थलों को इंटरप्रो टूल (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (ब्लम एट अल., 2021) का उपयोग करके विभिन्न परिवारों में वर्गीकृत किया गया। अंत में, अनुमानित S. sclerotiorum SsOAH का त्रि-आयामी (3D) संरचना मॉडलिंग प्रोटीन होमोलॉजी/एनालॉजी रिकग्निशन इंजन (Phyre2 सर्वर संस्करण 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (केली एट अल., 2015) का उपयोग करके किया गया और SWISS-MODEL सर्वर (https://swissmodel.expasy.org/) (बियासिनी एट अल., 2014) का उपयोग करके मान्य किया गया। अनुमानित त्रि-आयामी संरचनाओं (पीडीबी प्रारूप) को यूसीएसएफ-चिमेरा पैकेज (संस्करण 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (पेटरसन एट अल., 2004) का उपयोग करके इंटरैक्टिव रूप से देखा गया।
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम के माइसीलिया में ऑक्सैलोएसीटेट एसिटाइलहाइड्रोलेज़ (SsOAH; जेनबैंक अभिगम संख्या: XM_001590428.1) के प्रतिलेखन स्तर को निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय प्रतिदीप्ति पीसीआर का उपयोग किया गया था। संक्षेप में, S. स्क्लेरोटियोरम को PDB युक्त फ्लास्क में डाला गया और माइसीलिया की वृद्धि को प्रोत्साहित करने के लिए 25 ± 2 °C तापमान पर 150 rpm की गति से और निरंतर अंधेरे में 24 घंटे के लिए शेकिंग इनक्यूबेटर (मॉडल: I2400, न्यू ब्रंसविक साइंटिफिक कंपनी, एडिसन, एनजे, यूएसए) में रखा गया। इसके बाद, कोशिकाओं को अंतिम IC50 सांद्रता (क्रमशः लगभग 40 और 3.2 मिलीग्राम/लीटर) पर एल-ऑर्निथिन और फफूंदनाशक रिज़ोलेक्स-टी के साथ उपचारित किया गया और फिर समान परिस्थितियों में 24 घंटे के लिए संवर्धित किया गया। इनक्यूबेशन के बाद, कल्चर को 2500 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए सुपरनेटेंट (फंगल माइसेलियम) एकत्र किया गया। इसी प्रकार, संक्रमित पौधों से, जिनके ऊतकों की सतह पर सफेद फफूंद और रुई जैसी माइसेलियम बन गई थी, संक्रमण के 0, 24, 48, 72, 96 और 120 घंटे बाद फंगल माइसेलियम एकत्र किया गया। फंगल माइसेलियम से आरएनए निकाला गया और फिर ऊपर वर्णित विधि के अनुसार सीडीएनए संश्लेषित किया गया। SsOAH के लिए प्राइमर अनुक्रम अनुपूरक तालिका S3 में सूचीबद्ध हैं। SsActin (GenBank अभिगम संख्या: XM_001589919.1) को हाउसकीपिंग जीन के रूप में उपयोग किया गया, और सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना 2-ΔΔCT विधि (लिवक और श्मिटजेन, 2001) का उपयोग करके की गई।
आलू डेक्सट्रोज ब्रोथ (पीडीबी) और कवक रोगजनक स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम युक्त पौधों के नमूनों में ऑक्सालिक अम्ल का निर्धारण जू और झांग (2000) की विधि में कुछ मामूली संशोधनों के साथ किया गया। संक्षेप में, एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट्स को पीडीबी युक्त फ्लास्कों में डाला गया और फिर माइसेलियल वृद्धि को प्रोत्साहित करने के लिए 25 ± 2 °C पर 150 आरपीएम पर 3-5 दिनों तक निरंतर अंधेरे (24 घंटे) में शेकिंग इनक्यूबेटर (मॉडल I2400, न्यू ब्रंसविक साइंटिफिक कंपनी, एडिसन, एनजे, यूएसए) में संवर्धित किया गया। इनक्यूबेशन के बाद, कवक संवर्धन को पहले व्हाटमैन #1 फिल्टर पेपर से छाना गया और फिर अवशिष्ट माइसेलियम को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 2500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। सुपरनेटेंट को एकत्रित किया गया और ऑक्सालेट के आगे मात्रात्मक निर्धारण के लिए 4°C पर संग्रहित किया गया। पौधे के नमूनों को तैयार करने के लिए, लगभग 0.1 ग्राम पौधे के ऊतक के टुकड़ों को आसुत जल (प्रत्येक बार 2 मिलीलीटर) से तीन बार निकाला गया। इसके बाद नमूनों को 2500 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया, और ऊपरी द्रव को व्हाटमैन नंबर 1 फिल्टर पेपर से छानकर आगे के विश्लेषण के लिए एकत्र किया गया।
ऑक्सालिक अम्ल के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, अभिक्रिया मिश्रण को कांच के ढक्कन वाली नली में निम्नलिखित क्रम में तैयार किया गया: 0.2 मिलीलीटर नमूना (या पीडीबी कल्चर फिल्ट्रेट या ऑक्सालिक अम्ल मानक विलयन), 0.11 मिलीलीटर ब्रोमोफेनॉल ब्लू (बीपीबी, 1 मिलीएम; फिशर केमिकल, पिट्सबर्ग, पेंसिल्वेनिया, यूएसए), 0.198 मिलीलीटर 1 एम सल्फ्यूरिक अम्ल (एच2एसओ4; अल-गोमहोरिया फार्मास्यूटिकल्स एंड मेडिकल सप्लाइज, काहिरा, मिस्र) और 0.176 मिलीलीटर 100 मिलीएम पोटेशियम डाइक्रोमेट (के2सीसीआर2ओ7; टीसीआई केमिकल्स, पोर्टलैंड, ओरेगन, यूएसए)। इसके बाद विलयन को आसुत जल से 4.8 मिलीलीटर तक तनु किया गया, अच्छी तरह मिलाया गया और तुरंत 60 डिग्री सेल्सियस के जल स्नान में रखा गया। 10 मिनट बाद, 0.5 मिलीलीटर सोडियम हाइड्रॉक्साइड विलयन (NaOH; 0.75 एम) मिलाकर अभिक्रिया को रोक दिया गया। अभिक्रिया मिश्रण की अवशोषण क्षमता (A600) को यूवी-160 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग करके 600 एनएम पर मापा गया। कल्चर फिल्ट्रेट और पादप नमूनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए क्रमशः पीडीबी और आसुत जल का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया। कल्चर फिल्ट्रेट में ऑक्सालिक अम्ल की सांद्रता, जिसे पीडीबी माध्यम के प्रति मिलीलीटर में ऑक्सालिक अम्ल के माइक्रोग्राम (μg.mL−1) के रूप में व्यक्त किया गया, और पत्ती के अर्क में, जिसे ताजे वजन के प्रति ग्राम में ऑक्सालिक अम्ल के माइक्रोग्राम (μg.g−1 FW) के रूप में व्यक्त किया गया, ऑक्सालिक अम्ल अंशांकन वक्र (थर्मो फिशर साइंटिफिक केमिकल्स, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग करके निर्धारित की गई।
अध्ययन के दौरान, सभी प्रयोगों को पूर्णतः यादृच्छिक डिज़ाइन (CRD) में तैयार किया गया था, जिसमें प्रत्येक उपचार के लिए छह जैविक प्रतिकृतियाँ और प्रत्येक जैविक प्रतिकृति में पाँच गमले (प्रत्येक गमले में दो पौधे) थे, जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया गया हो। जैविक प्रतिकृतियों का विश्लेषण दो बार (दो तकनीकी प्रतिकृतियाँ) किया गया। तकनीकी प्रतिकृतियों का उपयोग एक ही प्रयोग की पुनरुत्पादकता की जाँच के लिए किया गया था, लेकिन सांख्यिकीय विश्लेषण में इनका उपयोग नहीं किया गया ताकि अनावश्यक प्रतिकृतियों से बचा जा सके। डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण विचरण विश्लेषण (ANOVA) और उसके बाद ट्यूकी-क्रेमर ईमानदारी से महत्वपूर्ण अंतर (HSD) परीक्षण (p ≤ 0.05) का उपयोग करके किया गया। इन विट्रो प्रयोगों के लिए, IC50 और IC99 मानों की गणना प्रोबिट मॉडल का उपयोग करके की गई और 95% विश्वास अंतराल की गणना की गई।
मिस्र के अल ग़ाबिया प्रांत में विभिन्न सोयाबीन खेतों से कुल चार आइसोलेट्स एकत्र किए गए। पीडीए माध्यम पर, सभी आइसोलेट्स ने मलाईदार सफेद माइसेलियम उत्पन्न किया जो जल्दी ही रुई जैसे सफेद (चित्र 1ए) में परिवर्तित हो गया और फिर स्क्लेरोटियम अवस्था में बेज या भूरे रंग का हो गया। स्क्लेरोटिया आमतौर पर घने, काले, गोलाकार या अनियमित आकार के होते हैं, जिनकी लंबाई 5.2 से 7.7 मिमी और व्यास 3.4 से 5.3 मिमी होता है (चित्र 1बी)। यद्यपि चार आइसोलेट्स ने 25 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर 10-12 दिनों के इनक्यूबेशन के बाद कल्चर माध्यम के किनारे पर स्क्लेरोटिया का एक सीमांत पैटर्न विकसित किया (चित्र 1ए), प्रति प्लेट स्क्लेरोटिया की संख्या उनमें काफी भिन्न थी (पी < 0.001), जिसमें आइसोलेट 3 में स्क्लेरोटिया की संख्या सबसे अधिक थी (32.33 ± 1.53 स्क्लेरोटिया प्रति प्लेट; चित्र 1सी)। इसी प्रकार, आइसोलेट #3 ने अन्य आइसोलेट्स की तुलना में PDB में अधिक ऑक्सालिक एसिड उत्पन्न किया (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; चित्र 1D)। आइसोलेट #3 ने पादप रोगजनक कवक स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम की विशिष्ट रूपात्मक और सूक्ष्मदर्शी विशेषताओं को प्रदर्शित किया। उदाहरण के लिए, PDA पर, आइसोलेट #3 की कॉलोनियां तेजी से बढ़ीं, मलाईदार सफेद रंग की थीं (चित्र 1A), विपरीत बेज या हल्के सैल्मन पीले-भूरे रंग की थीं, और 9 सेमी व्यास की प्लेट की सतह को पूरी तरह से ढकने के लिए 25 ± 2°C पर 6-7 दिन लगे। उपरोक्त रूपात्मक और सूक्ष्मदर्शी विशेषताओं के आधार पर, आइसोलेट #3 को स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम के रूप में पहचाना गया।
चित्र 1. सामान्य दलहन फसलों से प्राप्त एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट्स की विशेषताएँ और रोगजनकता। (A) पीडीए माध्यम पर चार एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट्स की माइसेलियल वृद्धि, (B) चार एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट्स के स्क्लेरोटिया, (C) स्क्लेरोटिया की संख्या (प्रति प्लेट), (D) पीडीबी माध्यम पर ऑक्सालिक एसिड स्राव (μg.mL−1), और (E) ग्रीनहाउस परिस्थितियों में संवेदनशील व्यावसायिक दलहन किस्म गीज़ा 3 पर चार एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट्स की रोग गंभीरता (%)। मान पाँच जैविक प्रतिकृतियों (n = 5) के माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं। अलग-अलग अक्षर उपचारों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (p < 0.05)। (F–H) आइसोलेट #3 के साथ इनोक्यूलेशन के 10 दिन बाद (dpi) क्रमशः तनों और फलियों पर विशिष्ट सफेद फफूंद के लक्षण दिखाई दिए। (I) एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट #3 के आंतरिक ट्रांसक्राइब्ड स्पेसर (ITS) क्षेत्र का विकासवादी विश्लेषण अधिकतम संभावना विधि का उपयोग करके किया गया और इसकी तुलना राष्ट्रीय जैव प्रौद्योगिकी सूचना केंद्र (NCBI) डेटाबेस (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) से प्राप्त 20 संदर्भ आइसोलेट/स्ट्रेन से की गई। क्लस्टरिंग रेखाओं के ऊपर की संख्याएँ क्षेत्र कवरेज (%) दर्शाती हैं, और क्लस्टरिंग रेखाओं के नीचे की संख्याएँ शाखा की लंबाई दर्शाती हैं।
इसके अलावा, रोगजनकता की पुष्टि करने के लिए, प्राप्त चार एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट्स का उपयोग ग्रीनहाउस परिस्थितियों में संवेदनशील व्यावसायिक बीन किस्म गीज़ा 3 को संक्रमित करने के लिए किया गया, जो कोच के सिद्धांतों के अनुरूप है (चित्र 1E)। यद्यपि प्राप्त सभी फंगल आइसोलेट्स रोगजनक थे और हरी बीन (गिज़ज़ा 3 किस्म) को संक्रमित कर सकते थे, जिससे संक्रमण के 10 दिन बाद (dpi) सभी ऊपरी भागों (चित्र 1F), विशेष रूप से तनों (चित्र 1G) और फलियों (चित्र 1H) पर विशिष्ट सफेद फफूंद के लक्षण दिखाई दिए, फिर भी दो स्वतंत्र प्रयोगों में आइसोलेट 3 सबसे आक्रामक आइसोलेट था। आइसोलेट 3 में बीन के पौधों पर रोग की गंभीरता (%) सबसे अधिक थी (संक्रमण के 7, 14 और 21 दिन बाद क्रमशः 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 और 76.7 ± 3.1; चित्र 1F)।
सबसे आक्रामक एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट #3 की पहचान की पुष्टि आंतरिक ट्रांसक्राइब्ड स्पेसर (आईटीएस) अनुक्रमण (चित्र 1I) के आधार पर की गई। आइसोलेट #3 और 20 संदर्भ आइसोलेट/स्ट्रेन के बीच फाइलोजेनेटिक विश्लेषण से उनके बीच उच्च समानता (>99%) पाई गई। यह उल्लेखनीय है कि एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट #3 (533 बीपी) अमेरिकी एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट एलपीएम36 (सूखे मटर के बीजों से पृथक) (जेनबैंक अभिगम संख्या MK896659.1; 540 बीपी) और चीनी एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट वाईकेवाई211 (जेनबैंक अभिगम संख्या OR206374.1; 548 बीपी) से उच्च समानता रखता है, जो वायलेट (मैथिओला इंकैना) तना सड़न का कारण बनता है, इन सभी को डेंड्रोग्राम के शीर्ष पर अलग-अलग समूहीकृत किया गया है (चित्र 1I)। नए अनुक्रम को NCBI डेटाबेस में जमा कर दिया गया है और इसे “स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम – आइसोलेट YN-25” नाम दिया गया है (जेनबैंक अभिगम संख्या PV202792)। यह देखा जा सकता है कि आइसोलेट 3 सबसे आक्रामक आइसोलेट है; इसलिए, इस आइसोलेट को बाद के सभी प्रयोगों में अध्ययन के लिए चुना गया।
डायमाइन एल-ऑर्निथिन (सिग्मा-एल्ड्रिच, डार्मस्टेड, जर्मनी) की विभिन्न सांद्रताओं (12.5, 25, 50, 75, 100 और 125 मिलीग्राम/लीटर) पर एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट 3 के विरुद्ध जीवाणुरोधी गतिविधि का इन विट्रो परीक्षण किया गया। यह उल्लेखनीय है कि एल-ऑर्निथिन ने जीवाणुरोधी प्रभाव दिखाया और खुराक के आधार पर एस. स्क्लेरोटियोरम हाइफे की रेडियल वृद्धि को धीरे-धीरे बाधित किया (चित्र 2ए, बी)। परीक्षण की गई उच्चतम सांद्रता (125 मिलीग्राम/लीटर) पर, एल-ऑर्निथिन ने माइसेलियल वृद्धि अवरोध की उच्चतम दर (99.62 ± 0.27%; चित्र 2बी) प्रदर्शित की, जो परीक्षण की गई उच्चतम सांद्रता (10 मिलीग्राम/लीटर) पर व्यावसायिक फफूंदनाशक रिज़ोलेक्स-टी (अवरोध दर 99.45 ± 0.39%; चित्र 2सी) के समतुल्य थी, जो समान प्रभावकारिता दर्शाती है।
चित्र 2. स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम के विरुद्ध एल-ऑर्निथिन की इन विट्रो जीवाणुरोधी गतिविधि। (A) व्यावसायिक फफूंदनाशक रिज़ोलेक्स-टी (10 मिलीग्राम/लीटर) के साथ एस. स्क्लेरोटियोरम के विरुद्ध एल-ऑर्निथिन की विभिन्न सांद्रताओं की जीवाणुरोधी गतिविधि की तुलना। (B, C) एल-ऑर्निथिन (12.5, 25, 50, 75, 100 और 125 मिलीग्राम/लीटर) या रिज़ोलेक्स-टी (2, 4, 6, 8 और 10 मिलीग्राम/लीटर) की विभिन्न सांद्रताओं के साथ उपचार के बाद एस. स्क्लेरोटियोरम माइसेलियल वृद्धि की अवरोध दर (%)। मान पाँच जैविक प्रतिकृतियों (n = 5) के माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं। अलग-अलग अक्षर उपचारों के बीच सांख्यिकीय अंतर (p < 0.05) को दर्शाते हैं। (D, E) क्रमशः एल-ऑर्निथिन और व्यावसायिक फफूंदनाशक रिज़ोलेक्स-टी का प्रोबिट मॉडल प्रतिगमन विश्लेषण। प्रोबिट मॉडल की प्रतिगमन रेखा को एक ठोस नीली रेखा के रूप में दर्शाया गया है, और विश्वास अंतराल (95%) को एक टूटी हुई लाल रेखा के रूप में दर्शाया गया है।
इसके अतिरिक्त, प्रोबिट रिग्रेशन विश्लेषण किया गया और संबंधित प्लॉट तालिका 1 और चित्र 2D,E में दिखाए गए हैं। संक्षेप में, एल-ऑर्निथिन का स्वीकार्य ढलान मान (y = 2.92x − 4.67) और संबंधित महत्वपूर्ण सांख्यिकी (कॉक्स और स्नेल R2 = 0.3709, नागेलकेर्क R2 = 0.4998 और p < 0.0001; चित्र 2D) व्यावसायिक फफूंदनाशक रिज़ोलेक्स-टी (y = 1.96x − 0.99, कॉक्स और स्नेल R2 = 0.1242, नागेलकेर्क R2 = 0.1708 और p < 0.0001) की तुलना में एस. स्क्लेरोटियोरम के खिलाफ बढ़ी हुई एंटीफंगल गतिविधि को इंगित करता है (तालिका 1)।
तालिका 1. एस. स्क्लेरोटियोरम के विरुद्ध एल-ऑर्निथिन और वाणिज्यिक फफूंदनाशक "रिज़ोलेक्स-टी" की अर्ध-अधिकतम निरोधात्मक सांद्रता (IC50) और IC99 (मिलीग्राम/लीटर) के मान।
कुल मिलाकर, एल-ऑर्निथिन (250 मिलीग्राम/लीटर) ने उपचारित सामान्य बीन पौधों पर सफेद फफूंद के विकास और गंभीरता को अनुपचारित एस. स्क्लेरोटियोरम-संक्रमित पौधों (नियंत्रण; चित्र 3ए) की तुलना में काफी हद तक कम कर दिया। संक्षेप में, हालांकि अनुपचारित संक्रमित नियंत्रण पौधों में रोग की गंभीरता धीरे-धीरे बढ़ी (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, और 92.33 ± 3.06%), एल-ऑर्निथिन ने प्रयोग के दौरान रोग की गंभीरता (%) को काफी हद तक कम कर दिया (उपचार के बाद 7, 14 और 21 दिनों में क्रमशः 8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, और 26.36 ± 3.07) (चित्र 3ए)। इसी प्रकार, जब एस. स्क्लेरोटियोरम से संक्रमित बीन पौधों को 250 मिलीग्राम/लीटर एल-ऑर्निथिन से उपचारित किया गया, तो रोग प्रगति वक्र के अंतर्गत क्षेत्र (एयूडीपीसी) अनुपचारित नियंत्रण में 1274.33 ± 33.13 से घटकर 281.03 ± 7.95 हो गया, जो सकारात्मक नियंत्रण 50 मिलीग्राम/लीटर रिज़ोलेक्स-टी फफूंदनाशक (183.61 ± 7.71; चित्र 3बी) से थोड़ा कम था। दूसरे प्रयोग में भी यही प्रवृत्ति देखी गई।
चित्र 3. ग्रीनहाउस परिस्थितियों में स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम के कारण होने वाले सामान्य बीन के सफेद सड़न रोग के विकास पर एल-ऑर्निथिन के बाह्य अनुप्रयोग का प्रभाव। (A) 250 मिलीग्राम/लीटर एल-ऑर्निथिन से उपचार के बाद सामान्य बीन के सफेद फफूंद रोग की प्रगति का वक्र। (B) एल-ऑर्निथिन से उपचार के बाद सामान्य बीन के सफेद फफूंद रोग की प्रगति के वक्र के अंतर्गत क्षेत्रफल (AUDPC)। मान पाँच जैविक प्रतिकृतियों (n = 5) के माध्य ± मानक विचलन को दर्शाते हैं। अलग-अलग अक्षर उपचारों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (p < 0.05)।
250 मिलीग्राम/लीटर एल-ऑर्निथिन के बाह्य अनुप्रयोग से 42 दिनों के बाद पौधे की ऊँचाई (चित्र 4A), प्रति पौधे शाखाओं की संख्या (चित्र 4B) और प्रति पौधे पत्तियों की संख्या (चित्र 4C) में धीरे-धीरे वृद्धि हुई। जबकि व्यावसायिक फफूंदनाशक रिज़ोलेक्स-टी (50 मिलीग्राम/लीटर) का अध्ययन किए गए सभी पोषण संबंधी मापदंडों पर सबसे अधिक प्रभाव पड़ा, वहीं 250 मिलीग्राम/लीटर एल-ऑर्निथिन के बाह्य अनुप्रयोग का अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में दूसरा सबसे अधिक प्रभाव रहा (चित्र 4A-C)। दूसरी ओर, एल-ऑर्निथिन उपचार का प्रकाश संश्लेषक वर्णक क्लोरोफिल ए (चित्र 4डी) और क्लोरोफिल बी (चित्र 4ई) की मात्रा पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा, लेकिन कुल कैरोटीनॉयड की मात्रा (0.56 ± 0.03 मिलीग्राम/ग्राम फल भार) में नकारात्मक नियंत्रण (0.44 ± 0.02 मिलीग्राम/ग्राम फल भार) और सकारात्मक नियंत्रण (0.46 ± 0.02 मिलीग्राम/ग्राम फल भार; चित्र 4एफ) की तुलना में थोड़ी वृद्धि हुई। कुल मिलाकर, ये परिणाम दर्शाते हैं कि एल-ऑर्निथिन उपचारित फलियों के लिए विषैला नहीं है और यहां तक ​​कि उनकी वृद्धि को भी प्रोत्साहित कर सकता है।
चित्र 4. ग्रीनहाउस परिस्थितियों में स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम से संक्रमित सेम की पत्तियों की वृद्धि विशेषताओं और प्रकाश संश्लेषक वर्णकों पर बाह्य एल-ऑर्निथिन के प्रयोग का प्रभाव। (A) पौधे की ऊँचाई (सेमी), (B) प्रति पौधे शाखाओं की संख्या, (C) प्रति पौधे पत्तियों की संख्या, (D) क्लोरोफिल ए की मात्रा (मिलीग्राम ग्राम प्रति फल भार), (E) क्लोरोफिल बी की मात्रा (मिलीग्राम ग्राम प्रति फल भार), (F) कुल कैरोटीनॉयड की मात्रा (मिलीग्राम ग्राम प्रति फल भार)। मान पाँच जैविक प्रतिकृतियों (n = 5) के माध्य ± मानक विचलन हैं। भिन्न-भिन्न अक्षर उपचारों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (p < 0.05)।
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस; हाइड्रोजन पेरोक्साइड [H2O2] के रूप में व्यक्त) और मुक्त कणों (सुपरऑक्साइड आयनों [O2•−] के रूप में व्यक्त) के इन सीटू हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण से पता चला कि एल-ऑर्निथिन (250 मिलीग्राम/लीटर) के बाह्य अनुप्रयोग ने H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; चित्र 5A) और O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; चित्र 5B) के संचय को काफी हद तक कम कर दिया, जबकि अनुपचारित संक्रमित पौधों (क्रमशः 173.31 ± 12.06 और 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW) और 50 मिलीग्राम/लीटर व्यावसायिक फफूंदनाशक रिज़ोलेक्स-टी से उपचारित पौधों (170.12 ± 72 घंटे पर क्रमशः 9.50 और 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt का उच्च स्तर पाया गया। एचपीटी के तहत H2O2 और O2•− का उच्च स्तर संचित हुआ (चित्र 5A, B)। इसी प्रकार, टीसीए-आधारित मैलोंडिएल्डिहाइड (एमडीए) परीक्षण से पता चला कि एस. स्क्लेरोटियोरम से संक्रमित बीन पौधों की पत्तियों में एमडीए का उच्च स्तर (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) संचित हुआ (चित्र 5C)। हालांकि, एल-ऑर्निथिन के बाह्य अनुप्रयोग ने लिपिड पेरोक्सीडेशन को काफी हद तक कम कर दिया, जैसा कि उपचारित पौधों में एमडीए की मात्रा में कमी (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt) से स्पष्ट है।
चित्र 5. ग्रीनहाउस परिस्थितियों में संक्रमण के 72 घंटे बाद एस. स्क्लेरोटियोरम से संक्रमित सेम की पत्तियों में ऑक्सीडेटिव तनाव और गैर-एंजाइमेटिक एंटीऑक्सीडेंट रक्षा तंत्र के प्रमुख मार्करों पर बाह्य एल-ऑर्निथिन अनुप्रयोग का प्रभाव। (A) 72 hpt पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2; nmol g−1 FW), (B) 72 hpt पर सुपरऑक्साइड आयन (O2•−; nmol g−1 FW), (C) 72 hpt पर मैलोंडिएल्डिहाइड (MDA; nmol g−1 FW), (D) 72 hpt पर कुल घुलनशील फिनोल (mg GAE g−1 FW), (E) 72 hpt पर कुल घुलनशील फ्लेवोनोइड (mg RE g−1 FW), (F) 72 hpt पर कुल मुक्त अमीनो अम्ल (mg g−1 FW), और (G) 72 hpt पर प्रोलाइन की मात्रा (mg g−1 FW)। मान 5 जैविक प्रतिकृतियों (n = 5) के माध्य ± मानक विचलन (mean ± SD) को दर्शाते हैं। अलग-अलग अक्षर उपचारों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (p < 0.05)।