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उच्च लोडिंग क्षमता वाले इंसुलिन नैनोकणों (एनपी) का विभिन्न खुराक रूपों में विविध अनुप्रयोग पाए गए हैं। इस कार्य का उद्देश्य क्रायोप्रोटेक्टेंट के रूप में मैनिटोल के साथ या उसके बिना, इंसुलिन-लोडेड चिटोसन नैनोकणों की संरचना पर फ्रीज-ड्राइंग और स्प्रे-ड्राइंग प्रक्रियाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करना है। हमने इन नैनोकणों को पुनः घोलकर उनकी गुणवत्ता का भी आकलन किया। निर्जलीकरण से पहले, चिटोसन/सोडियम ट्रिपॉलीफॉस्फेट/इंसुलिन क्रॉस-लिंक्ड नैनोकणों का कण आकार 318 एनएम, पीडीआई 0.18, एनकैप्सुलेशन दक्षता 99.4% और लोडिंग 25.01% तक अनुकूलित किया गया था। पुनर्गठन के बाद, मैनिटोल के उपयोग के बिना फ्रीज-ड्राइंग विधि द्वारा उत्पादित नैनोकणों को छोड़कर, सभी नैनोकणों ने अपनी गोलाकार कण संरचना को बनाए रखा। स्प्रे द्वारा निर्जलित मैनिटोल युक्त नैनोकणों की तुलना में, मैनिटोल-मुक्त नैनोकणों ने बेहतर परिणाम दिए। स्प्रे-ड्राइड नैनोकणों ने सुखाने या फ्रीज-ड्राइंग तकनीकों द्वारा समान एनकैप्सुलेशन दर (98.7%) और पीडीआई (0.20) के साथ सबसे छोटा औसत कण आकार (376 एनएम) और उच्चतम लोडिंग क्षमता (25.02%) प्रदर्शित की। मैनिटोल के बिना स्प्रे ड्राइंग द्वारा सुखाए गए नैनोकणों से इंसुलिन का सबसे तेज़ रिलीज और कोशिकीय अवशोषण की उच्चतम दक्षता प्राप्त हुई। यह कार्य दर्शाता है कि स्प्रे ड्राइंग पारंपरिक फ्रीज ड्राइंग विधियों की तुलना में क्रायोप्रोटेक्टेंट्स की आवश्यकता के बिना इंसुलिन नैनोकणों को निर्जलित कर सकता है, जिससे अधिक लोडिंग क्षमता, कम योजक आवश्यकताएं और परिचालन लागत में महत्वपूर्ण लाभ प्राप्त होता है।
19221,2,3 में इसकी खोज के बाद से, इंसुलिन और इसके औषधीय उत्पादों ने टाइप 1 मधुमेह (T1DM) और टाइप 2 मधुमेह (T1DM) से पीड़ित रोगियों की जान बचाई है। हालांकि, उच्च आणविक भार वाले प्रोटीन के रूप में अपने गुणों के कारण, इंसुलिन आसानी से एकत्रित हो जाता है, प्रोटियोलिटिक एंजाइमों द्वारा टूट जाता है, और फर्स्ट-पास प्रभाव द्वारा शरीर से बाहर निकल जाता है। टाइप 1 मधुमेह से पीड़ित लोगों को जीवन भर इंसुलिन के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। टाइप 2 मधुमेह से पीड़ित कई रोगियों को भी लंबे समय तक इंसुलिन के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। दैनिक इंसुलिन इंजेक्शन इन व्यक्तियों के लिए दैनिक दर्द और असुविधा का एक गंभीर कारण है, जिसका उनके मानसिक स्वास्थ्य पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है। परिणामस्वरूप, इंसुलिन देने के अन्य तरीके जो कम असुविधा पैदा करते हैं, जैसे कि मौखिक इंसुलिन देना, का व्यापक रूप से अध्ययन किया जा रहा है5 क्योंकि इनमें दुनिया भर में लगभग 5 अरब मधुमेह रोगियों के जीवन की गुणवत्ता को बहाल करने की क्षमता है।
नैनोकण प्रौद्योगिकी ने मौखिक इंसुलिन लेने के प्रयासों में महत्वपूर्ण प्रगति प्रदान की है4,6,7। यह इंसुलिन को प्रभावी ढंग से एनकैप्सुलेट करता है और विशिष्ट शारीरिक स्थानों तक लक्षित वितरण के लिए इसे क्षरण से बचाता है। हालांकि, नैनोकण फॉर्मूलेशन के उपयोग की कई सीमाएं हैं, मुख्य रूप से कण निलंबन की स्थिरता संबंधी समस्याओं के कारण। भंडारण के दौरान कुछ एकत्रीकरण हो सकता है, जो इंसुलिन-युक्त नैनोकणों की जैव उपलब्धता को कम करता है8। इसके अलावा, इंसुलिन नैनोकणों (एनपी) की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए नैनोकणों और इंसुलिन के बहुलक मैट्रिक्स की रासायनिक स्थिरता पर भी विचार किया जाना चाहिए। वर्तमान में, भंडारण के दौरान अवांछित परिवर्तनों को रोकते हुए स्थिर एनपी बनाने के लिए फ्रीज-ड्राइंग तकनीक सर्वोत्तम मानक है9।
हालांकि, फ्रीज-ड्राइंग में क्रायोप्रोटेक्टेंट मिलाना आवश्यक होता है ताकि बर्फ के क्रिस्टलों के यांत्रिक तनाव से नैनोकणों की गोलाकार संरचना प्रभावित न हो। इससे लाइयोफिलाइजेशन के बाद इंसुलिन नैनोकणों की मात्रा काफी कम हो जाती है, क्योंकि क्रायोप्रोटेक्टेंट वजन अनुपात का अधिकांश भाग घेर लेता है। इसलिए, इंसुलिन के चिकित्सीय प्रभाव को प्राप्त करने के लिए बड़ी मात्रा में शुष्क नैनोकणों की आवश्यकता के कारण, उत्पादित इंसुलिन नैनोकण अक्सर मौखिक गोलियों और मौखिक फिल्मों जैसे शुष्क पाउडर फॉर्मूलेशन के निर्माण के लिए अनुपयुक्त पाए जाते हैं।
स्प्रे ड्राइंग, फार्मास्युटिकल उद्योग में तरल अवस्थाओं से शुष्क पाउडर बनाने की एक सुप्रसिद्ध और सस्ती औद्योगिक पैमाने की प्रक्रिया है10,11। कण निर्माण प्रक्रिया पर नियंत्रण कई जैवसक्रिय यौगिकों के उचित एनकैप्सुलेशन की अनुमति देता है12, 13। इसके अलावा, यह मौखिक प्रशासन के लिए एनकैप्सुलेटेड प्रोटीन तैयार करने की एक प्रभावी तकनीक बन गई है। स्प्रे ड्राइंग के दौरान, पानी बहुत जल्दी वाष्पित हो जाता है, जो कण कोर के तापमान को कम रखने में मदद करता है11,14, जिससे गर्मी के प्रति संवेदनशील घटकों को एनकैप्सुलेट करने में इसका उपयोग संभव हो पाता है। स्प्रे ड्राइंग से पहले, कोटिंग सामग्री को एनकैप्सुलेटेड अवयवों वाले घोल के साथ अच्छी तरह से समरूपीकृत किया जाना चाहिए11,14। फ्रीज-ड्राइंग के विपरीत, स्प्रे-ड्राइंग में एनकैप्सुलेशन से पहले समरूपीकरण निर्जलीकरण के दौरान एनकैप्सुलेशन दक्षता में सुधार करता है। चूंकि स्प्रे-ड्राइंग एनकैप्सुलेशन प्रक्रिया में क्रायोप्रोटेक्टेंट की आवश्यकता नहीं होती है, इसलिए स्प्रे-ड्राइंग का उपयोग उच्च लोडिंग सामग्री वाले सूखे नैनोकणों के उत्पादन के लिए किया जा सकता है।
इस अध्ययन में आयन जेल विधि का उपयोग करके चिटोसन और सोडियम ट्रिपॉलीफॉस्फेट के क्रॉस-लिंकिंग द्वारा इंसुलिन-युक्त नैनोकणों के उत्पादन की जानकारी दी गई है। आयन जेलेशन एक ऐसी तैयारी विधि है जो कुछ निश्चित परिस्थितियों में दो या दो से अधिक आयनिक प्रजातियों के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक अंतःक्रियाओं के माध्यम से नैनोकणों के उत्पादन की अनुमति देती है। अनुकूलित चिटोसन/सोडियम ट्रिपॉलीफॉस्फेट/इंसुलिन क्रॉस-लिंक्ड नैनोकणों को निर्जलित करने के लिए फ्रीज-ड्राइंग और स्प्रे-ड्राइंग दोनों तकनीकों का उपयोग किया गया। निर्जलीकरण के बाद, एसईएम द्वारा उनकी आकृति विज्ञान का विश्लेषण किया गया। उनके आकार वितरण, सतह आवेश, पीडीआई, एनकैप्सुलेशन दक्षता और लोडिंग सामग्री को मापकर उनकी पुनर्संयोजन क्षमता का मूल्यांकन किया गया। विभिन्न निर्जलीकरण विधियों द्वारा उत्पादित पुनर्घुलनशील नैनोकणों की गुणवत्ता का मूल्यांकन उनके इंसुलिन संरक्षण, रिलीज व्यवहार और कोशिकीय अवशोषण प्रभावकारिता की तुलना करके भी किया गया।
मिश्रित विलयन का pH और चिटोसन तथा इंसुलिन का अनुपात दो प्रमुख कारक हैं जो अंतिम नैनोकणों के कण आकार और एनकैप्सुलेशन दक्षता (EE) को प्रभावित करते हैं, क्योंकि ये आयनोट्रोपिक जेल निर्माण प्रक्रिया को सीधे प्रभावित करते हैं। मिश्रित विलयन का pH कण आकार और एनकैप्सुलेशन दक्षता के साथ अत्यधिक सहसंबद्ध पाया गया (चित्र 1a)। जैसा कि चित्र 1a में दिखाया गया है, pH 4.0 से 6.0 तक बढ़ने पर औसत कण आकार (nm) घट गया और EE में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जबकि pH 6.5 तक बढ़ने पर औसत कण आकार बढ़ना शुरू हो गया और EE अपरिवर्तित रही। चिटोसन और इंसुलिन का अनुपात बढ़ने पर औसत कण आकार भी बढ़ता है। इसके अलावा, जब चिटोसन/इंसुलिन का द्रव्यमान अनुपात 2.5:1 (w/w) से अधिक पर नैनोकणों को तैयार किया गया तो EE में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया (चित्र 1b)। इसलिए, इस अध्ययन में इष्टतम तैयारी की स्थितियाँ (pH 6.0, आगे के अध्ययन के लिए इंसुलिन-युक्त नैनोकणों को तैयार करने हेतु चिटोसन/इंसुलिन द्रव्यमान अनुपात 2.5:1 का उपयोग किया गया। इस तैयारी की स्थिति में, इंसुलिन नैनोकणों का औसत कण आकार 318 एनएम (चित्र 1सी) तक अनुकूलित किया गया, पीडीआई 0.18 था, एम्बेडिंग दक्षता 99.4% थी, ज़ेटा पोटेंशियल 9.8 मिलीवोल्ट था, और इंसुलिन लोडिंग 25.01% (मिलीमीटर/मीटर²) थी। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) परिणामों के आधार पर, अनुकूलित नैनोकण लगभग गोलाकार और अपेक्षाकृत एकसमान आकार के थे (चित्र 1डी)।
इंसुलिन नैनोकणों का पैरामीटर अनुकूलन: (a) इंसुलिन नैनोकणों के औसत व्यास और एनकैप्सुलेशन दक्षता (EE) पर pH का प्रभाव (चिटोसन और इंसुलिन के 5:1 द्रव्यमान अनुपात पर तैयार); (b) चिटोसन और इंसुलिन के द्रव्यमान अनुपात का इंसुलिन नैनोकणों के औसत व्यास और एनकैप्सुलेशन दक्षता (EE) पर प्रभाव (pH 6 पर तैयार); (c) अनुकूलित इंसुलिन नैनोकणों का कण आकार वितरण; (d) अनुकूलित इंसुलिन नैनोकणों का TEM माइक्रोग्राफ।
यह सर्वविदित है कि चिटोसन एक दुर्बल पॉलीइलेक्ट्रोलाइट है जिसका pKa 6.5 है। अम्लीय माध्यम में यह धनात्मक रूप से आवेशित होता है क्योंकि इसका मुख्य अमीनो समूह हाइड्रोजन आयनों द्वारा प्रोटोनित होता है।¹⁵ इसलिए, इसका उपयोग अक्सर ऋणात्मक रूप से आवेशित मैक्रोमोलेक्यूल्स को समाहित करने के लिए वाहक के रूप में किया जाता है। इस अध्ययन में, 5.3 के समविद्युत बिंदु वाले इंसुलिन को समाहित करने के लिए चिटोसन का उपयोग किया गया था। चूंकि चिटोसन का उपयोग कोटिंग सामग्री के रूप में किया जाता है, इसलिए इसके अनुपात में वृद्धि के साथ, नैनोकणों की बाहरी परत की मोटाई उसी अनुपात में बढ़ जाती है, जिसके परिणामस्वरूप औसत कण आकार बड़ा हो जाता है। इसके अलावा, चिटोसन की उच्च मात्रा अधिक इंसुलिन को समाहित कर सकती है। हमारे मामले में, समविद्युत बिंदु (EE) तब उच्चतम था जब चिटोसन और इंसुलिन का अनुपात 2.5:1 तक पहुँच गया, और अनुपात में वृद्धि जारी रहने पर EE में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ।
चिटोसन और इंसुलिन के अनुपात के अलावा, नैनोपार्टिकल्स के निर्माण में pH ने भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाई। गान एट अल. 17 ने चिटोसन नैनोपार्टिकल्स के कण आकार पर pH के प्रभाव का अध्ययन किया। उन्होंने पाया कि pH 6.0 तक पहुँचने तक कण आकार में लगातार कमी आई, और pH > 6.0 पर कण आकार में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई, जो हमारे प्रेक्षणों के अनुरूप है। यह घटना इस तथ्य के कारण है कि pH बढ़ने के साथ, इंसुलिन अणु एक नकारात्मक सतही आवेश प्राप्त कर लेता है, जिससे चिटोसन/सोडियम ट्रिपॉलीफॉस्फेट (TPP) कॉम्प्लेक्स के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक अंतःक्रियाओं को बढ़ावा मिलता है, जिसके परिणामस्वरूप कण का आकार छोटा और EE उच्च होता है। हालांकि, जब pH को 6.5 पर समायोजित किया गया, तो चिटोसन पर अमीनो समूह डीप्रोटोनेटेड हो गए, जिसके परिणामस्वरूप चिटोसन फोल्डिंग हुई। इस प्रकार, उच्च pH के कारण अमीनो आयनों का TPP और इंसुलिन के साथ संपर्क कम होता है, जिसके परिणामस्वरूप क्रॉस-लिंकिंग कम होती है, अंतिम औसत कण आकार बड़ा होता है और EE कम होता है।
फ्रीज़-ड्राइड और स्प्रे-ड्राइड नैनोपार्टिकल्स के आकारिकी गुणों का विश्लेषण बेहतर निर्जलीकरण और पाउडर निर्माण तकनीकों के चयन में सहायक हो सकता है। पसंदीदा विधि में दवा की स्थिरता, एकसमान कण आकार, उच्च दवा लोडिंग और मूल घोल में अच्छी घुलनशीलता होनी चाहिए। इस अध्ययन में, दोनों तकनीकों की बेहतर तुलना करने के लिए, निर्जलीकरण के दौरान 1% मैनिटोल के साथ या उसके बिना इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स का उपयोग किया गया। मैनिटोल का उपयोग फ्रीज़-ड्राइंग और स्प्रे-ड्राइंग के लिए विभिन्न शुष्क पाउडर फॉर्मूलेशन में बल्किंग एजेंट या क्रायोप्रोटेक्टेंट के रूप में किया जाता है। मैनिटोल रहित लाइयोफिलाइज्ड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स के लिए, जैसा कि चित्र 2a में दिखाया गया है, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के तहत बड़ी, अनियमित और खुरदरी सतहों वाली एक अत्यधिक छिद्रपूर्ण पाउडर संरचना देखी गई। निर्जलीकरण के बाद पाउडर में कुछ अलग-अलग कण पाए गए (चित्र 2e)। इन परिणामों से पता चलता है कि अधिकांश नैनोपार्टिकल्स बिना किसी क्रायोप्रोटेक्टेंट के फ्रीज़-ड्राइंग के दौरान विघटित हो गए। 1% मैनिटोल युक्त फ्रीज़-ड्राइड और स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स के लिए, चिकनी सतहों वाले गोलाकार नैनोपार्टिकल्स देखे गए। सतहों का अवलोकन किया गया (चित्र 2b,d,f,h)। मैनिटोल के बिना स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोकण गोलाकार तो रहे लेकिन उनकी सतह झुर्रीदार हो गई (चित्र 2c)। गोलाकार और झुर्रीदार सतहों पर आगे रिलीज व्यवहार और कोशिकीय अवशोषण परीक्षणों में चर्चा की गई है। सूखे नैनोकणों की दृश्य उपस्थिति के आधार पर, मैनिटोल के बिना स्प्रे-ड्राइड नैनोकण और मैनिटोल के साथ फ्रीज-ड्राइड और स्प्रे-ड्राइड नैनोकण दोनों से महीन नैनोकण पाउडर प्राप्त हुए (चित्र 2f,g,h)। कणों की सतहों के बीच का सतही क्षेत्रफल जितना अधिक होगा, घुलनशीलता उतनी ही अधिक होगी और इसलिए रिलीज दर भी उतनी ही अधिक होगी।
विभिन्न निर्जलित इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स की आकृति विज्ञान: (a) मैनिटोल रहित लाइयोफिलाइज्ड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स की एसईएम छवि; (b) मैनिटोल युक्त लाइयोफिलाइज्ड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स की एसईएम छवि; (c) मैनिटोल रहित स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स की एसईएम छवि; (d) मैनिटोल युक्त स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स की एसईएम छवि; (e) मैनिटोल रहित लाइयोफिलाइज्ड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स पाउडर की छवि; (f) मैनिटोल युक्त लाइयोफिलाइज्ड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स की छवि; (g) मैनिटोल रहित स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स पाउडर की छवि; (h) मैनिटोल युक्त स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स पाउडर की छवि।
फ्रीज़-ड्राइंग के दौरान, मैनिटोल एक क्रायोप्रोटेक्टेंट के रूप में कार्य करता है, जिससे नैनोपार्टिकल्स अनाकार रूप में बने रहते हैं और बर्फ के क्रिस्टल से होने वाली क्षति से बचाव होता है19। इसके विपरीत, स्प्रे ड्राइंग में कोई फ्रीजिंग चरण नहीं होता है। इसलिए इस विधि में मैनिटोल की आवश्यकता नहीं होती है। वास्तव में, मैनिटोल के बिना स्प्रे-ड्राइड नैनोपार्टिकल्स से पहले बताए गए अनुसार महीन नैनोपार्टिकल्स प्राप्त हुए। हालांकि, स्प्रे-ड्राइंग प्रक्रिया में मैनिटोल अभी भी एक फिलर के रूप में कार्य कर सकता है जिससे नैनोपार्टिकल्स को अधिक गोलाकार संरचना मिलती है20 (चित्र 2d), जो इस प्रकार के एनकैप्सुलेटेड नैनोपार्टिकल्स के एकसमान रिलीज व्यवहार को प्राप्त करने में मदद करता है। इसके अलावा, यह स्पष्ट है कि मैनिटोल युक्त फ्रीज़-ड्राइड और स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स दोनों में कुछ बड़े कणों का पता लगाया जा सकता है (चित्र 2b,d), जो एनकैप्सुलेटेड इंसुलिन के साथ कण कोर में मैनिटोल के संचय के कारण हो सकता है। चिटोसन परत के संबंध में, यह उल्लेखनीय है कि इस अध्ययन में, निर्जलीकरण के बाद गोलाकार संरचना को बरकरार रखने के लिए, मैनिटोल और चिटोसन का अनुपात 5:1 रखा गया है, ताकि बड़ी मात्रा में भराव सूखे नैनोकणों के कण आकार को भी बढ़ा सके।
फूरियर ट्रांसफॉर्म इन्फ्रारेड एटिन्यूएटेड टोटल रिफ्लेक्शन (FTIR-ATR) स्पेक्ट्रोस्कोपी ने मुक्त इंसुलिन, चिटोसन, चिटोसन, TPP और इंसुलिन के भौतिक मिश्रण का लक्षण वर्णन किया। सभी निर्जलित नैनोकणों का लक्षण वर्णन FTIR-ATR स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके किया गया। विशेष रूप से, मैनिटोल के साथ फ्रीज-ड्राइड एनकैप्सुलेटेड नैनोकणों और मैनिटोल के साथ और बिना मैनिटोल के स्प्रे-ड्राइड नैनोकणों में 1641, 1543 और 1412 cm-1 की बैंड तीव्रता देखी गई (चित्र 3)। जैसा कि पहले बताया गया है, शक्ति में यह वृद्धि चिटोसन, TPP और इंसुलिन के बीच क्रॉस-लिंकिंग से जुड़ी थी। चिटोसन और इंसुलिन के बीच परस्पर क्रिया की जांच से पता चला कि इंसुलिन-लोडेड चिटोसन नैनोकणों के FTIR स्पेक्ट्रा में, चिटोसन बैंड इंसुलिन के साथ ओवरलैप हो गया, जिससे कार्बोनिल तीव्रता (1641 cm-1) और एमीन (1543 cm-1) बेल्ट बढ़ गई। TPP के ट्रिपॉलीफॉस्फेट समूह चिटोसन में अमोनियम समूहों से जुड़ा हुआ, 1412 सेमी-1 पर एक बैंड का निर्माण करता है।
मुक्त इंसुलिन, चिटोसन, चिटोसन/टीपीपी/इंसुलिन के भौतिक मिश्रण और विभिन्न विधियों द्वारा निर्जलित नैनोकणों के एफटीआईआर-एटीआर स्पेक्ट्रा।
इसके अलावा, ये परिणाम SEM में दिखाए गए परिणामों के अनुरूप हैं, जिससे पता चलता है कि मैनिटोल के साथ स्प्रे और फ्रीज-ड्राइंग दोनों स्थितियों में एनकैप्सुलेटेड NPs बरकरार रहे, लेकिन मैनिटोल की अनुपस्थिति में, केवल स्प्रे-ड्राइंग से ही एनकैप्सुलेटेड कण प्राप्त हुए। इसके विपरीत, मैनिटोल के बिना फ्रीज-ड्राइंग किए गए NPs के FTIR-ATR स्पेक्ट्रल परिणाम चिटोसन, TPP और इंसुलिन के भौतिक मिश्रण के समान थे। यह परिणाम दर्शाता है कि मैनिटोल के बिना फ्रीज-ड्राइंग किए गए NPs में चिटोसन, TPP और इंसुलिन के बीच क्रॉस-लिंक मौजूद नहीं हैं। क्रायोप्रोटेक्टेंट के बिना फ्रीज-ड्राइंग के दौरान NPs की संरचना नष्ट हो गई, जिसे SEM परिणामों (चित्र 2a) में देखा जा सकता है। निर्जलित इंसुलिन NPs की आकृति विज्ञान और FTIR परिणामों के आधार पर, केवल लाइयोफिलाइज्ड, स्प्रे-ड्राइंग और मैनिटोल-मुक्त NPs का उपयोग पुनर्निर्माण प्रयोगों के लिए किया गया था, और मैनिटोल-मुक्त NPs का उपयोग अपघटन के कारण नहीं किया गया था। निर्जलीकरण के दौरान मैनिटोल-मुक्त नैनोकण। चर्चा करें।
निर्जलीकरण का उपयोग दीर्घकालिक भंडारण और अन्य फॉर्मूलेशन में पुनर्संसाधन के लिए किया जाता है। भंडारण के बाद शुष्क नैनोकणों की पुनर्संरचना करने की क्षमता, टैबलेट और फिल्म जैसे विभिन्न फॉर्मूलेशन में उनके उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है। हमने देखा कि मैनिटोल की अनुपस्थिति में स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोकणों का औसत कण आकार पुनर्गठन के बाद केवल थोड़ा ही बढ़ा। दूसरी ओर, मैनिटोल के साथ स्प्रे-ड्राइड और फ्रीज-ड्राइड इंसुलिन नैनोकणों का कण आकार काफी बढ़ गया (तालिका 1)। इस अध्ययन में सभी नैनोकणों के पुनर्संयोजन के बाद पीडीआई और ईई में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ (p > 0.05) (तालिका 1)। यह परिणाम दर्शाता है कि पुनर्घुलन के बाद अधिकांश कण अक्षुण्ण रहे। हालांकि, मैनिटोल मिलाने से लाइयोफिलाइज्ड और स्प्रे-ड्राइड मैनिटोल नैनोकणों की इंसुलिन लोडिंग में काफी कमी आई (तालिका 1)। इसके विपरीत, मैनिटोल के बिना स्प्रे-ड्राइड नैनोकणों की इंसुलिन लोडिंग पहले जैसी ही रही (तालिका 1)।
यह सर्वविदित है कि दवा वितरण के लिए उपयोग किए जाने पर नैनोकणों की लोडिंग महत्वपूर्ण होती है। कम लोडिंग वाले नैनोकणों के लिए, चिकित्सीय सीमा तक पहुँचने के लिए बहुत अधिक मात्रा में सामग्री की आवश्यकता होती है। हालाँकि, ऐसी उच्च NP सांद्रता की उच्च चिपचिपाहट मौखिक प्रशासन और इंजेक्शन योग्य फॉर्मूलेशन में असुविधा और कठिनाई का कारण बनती है।22 इसके अतिरिक्त, इंसुलिन नैनोकणों का उपयोग टैबलेट और चिपचिपे बायोफिल्म बनाने के लिए भी किया जा सकता है,23, 24, जिसके लिए कम लोडिंग स्तर पर बड़ी मात्रा में नैनोकणों का उपयोग आवश्यक होता है, जिसके परिणामस्वरूप बड़े टैबलेट और मोटे बायोफिल्म बनते हैं जो मौखिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं होते हैं। इसलिए, उच्च इंसुलिन लोड वाले निर्जलित नैनोकण अत्यधिक वांछनीय हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि मैनिटोल-मुक्त स्प्रे-ड्राइड नैनोकणों का उच्च इंसुलिन लोड इन वैकल्पिक वितरण विधियों के लिए कई आकर्षक लाभ प्रदान कर सकता है।
सभी निर्जलित नैनोकणों को तीन महीने तक रेफ्रिजरेटर में रखा गया। एसईएम परिणामों से पता चला कि तीन महीने के भंडारण के दौरान सभी निर्जलित नैनोकणों की आकृति में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ (चित्र 4)। पानी में पुनर्संयोजन के बाद, सभी नैनोकणों की ऊर्जा दक्षता में थोड़ी कमी आई और तीन महीने की भंडारण अवधि के दौरान लगभग थोड़ी मात्रा (~5%) इंसुलिन मुक्त हुई (तालिका 2)। हालांकि, सभी नैनोकणों का औसत कण आकार बढ़ गया। मैनिटोल के बिना स्प्रे-ड्राइड नैनोकणों का कण आकार बढ़कर 525 एनएम हो गया, जबकि मैनिटोल के साथ स्प्रे-ड्राइड और फ्रीज-ड्राइड नैनोकणों का कण आकार क्रमशः 872 और 921 एनएम हो गया (तालिका 2)।
तीन महीने तक संग्रहित विभिन्न निर्जलित इंसुलिन नैनोकणों की आकृति विज्ञान: (a) मैनिटोल युक्त लाइयोफिलाइज्ड इंसुलिन नैनोकणों की एसईएम छवि; (b) मैनिटोल रहित स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोकणों की एसईएम छवि; (c) मैनिटोल रहित स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोकणों की एसईएम छवियां।
इसके अतिरिक्त, मैनिटोल के साथ स्प्रे-ड्राइड और फ्रीज़-ड्राइड किए गए पुनर्गठित इंसुलिन नैनोकणों में अवक्षेप देखे गए (चित्र S2)। इसका कारण बड़े कणों का पानी में ठीक से न घुलना हो सकता है। उपरोक्त सभी परिणाम दर्शाते हैं कि स्प्रे ड्राइंग तकनीक इंसुलिन नैनोकणों को निर्जलीकरण से बचा सकती है और बिना किसी फिलर या क्रायोप्रोटेक्टेंट के इंसुलिन नैनोकणों की उच्च मात्रा प्राप्त की जा सकती है।
निर्जलीकरण के बाद एंजाइमेटिक पाचन के विरुद्ध नैनोकणों की सुरक्षात्मक क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए पेप्सिन, ट्रिप्सिन और α-काइमोट्रिप्सिन के साथ pH = 2.5 माध्यम में इंसुलिन प्रतिधारण का परीक्षण किया गया। निर्जलित नैनोकणों के इंसुलिन प्रतिधारण की तुलना ताजे तैयार किए गए नैनोकणों के साथ की गई, और मुक्त इंसुलिन को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया। इस अध्ययन में, मुक्त इंसुलिन ने तीनों एंजाइमेटिक उपचारों में 4 घंटे के भीतर तेजी से इंसुलिन उन्मूलन दिखाया (चित्र 5a-c)। इसके विपरीत, मैनिटोल के साथ फ्रीज-ड्राइड नैनोकणों और मैनिटोल के साथ या बिना स्प्रे-ड्राइड नैनोकणों के इंसुलिन उन्मूलन परीक्षण ने एंजाइमेटिक पाचन के विरुद्ध इन नैनोकणों की काफी अधिक सुरक्षा दिखाई, जो ताजे तैयार किए गए इंसुलिन नैनोकणों के समान थी (चित्र 1)। पेप्सिन, ट्रिप्सिन और α-काइमोट्रिप्सिन में नैनोकणों की सहायता से, क्रमशः 50%, 60% और 75% से अधिक इंसुलिन को 4 घंटे के भीतर संरक्षित किया जा सकता था (चित्र)। 5a–c)। यह इंसुलिन-सुरक्षात्मक क्षमता रक्तप्रवाह में उच्च इंसुलिन अवशोषण की संभावना को बढ़ा सकती है।25 ये परिणाम बताते हैं कि मैनिटोल के साथ या उसके बिना स्प्रे सुखाने और मैनिटोल के साथ फ्रीज-ड्राइंग निर्जलीकरण के बाद एनपीएस की इंसुलिन-सुरक्षात्मक क्षमता को संरक्षित कर सकती है।
निर्जलित इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स का संरक्षण और विमोचन व्यवहार: (a) पेप्सिन विलयन में इंसुलिन का संरक्षण; (b) ट्रिप्सिन विलयन में इंसुलिन का संरक्षण; (c) α-काइमोट्रिप्सिन विलयन द्वारा इंसुलिन का संरक्षण; (d) pH = 2.5 विलयन में निर्जलित नैनोपार्टिकल्स का विमोचन व्यवहार; (e) pH = 6.6 विलयन में निर्जलित नैनोपार्टिकल्स का विमोचन व्यवहार; (f) pH = 7.0 विलयन में निर्जलित नैनोपार्टिकल्स का विमोचन व्यवहार।
इंसुलिन प्रतिरोध पर इंसुलिन के प्रभाव की जांच करने के लिए, पेट, ग्रहणी और ऊपरी छोटी आंत के पीएच वातावरण का अनुकरण करते हुए, ताजे तैयार और पुनर्गठित शुष्क इंसुलिन नैनोकणों को 37 डिग्री सेल्सियस पर विभिन्न बफ़र्स (पीएच = 2.5, 6.6, 7.0) में इनक्यूबेट किया गया। विभिन्न वातावरणों में रिलीज व्यवहार। पाचन तंत्र का खंड। pH = 2.5 पर, इंसुलिन-युक्त नैनोकणों और पुनर्घुलनशील शुष्क इंसुलिन नैनोकणों ने पहले एक घंटे के भीतर तीव्र रिलीज दिखाया, जिसके बाद अगले 5 घंटों में धीमी रिलीज हुई (चित्र 5d)। शुरुआत में यह तीव्र रिलीज संभवतः प्रोटीन अणुओं के तीव्र सतही अवशोषण का परिणाम है जो कण की आंतरिक संरचना में पूरी तरह से स्थिर नहीं होते हैं। pH = 6.5 पर, इंसुलिन-युक्त नैनोकणों और पुनर्गठित शुष्क इंसुलिन नैनोकणों ने 6 घंटे तक सुचारू और धीमी रिलीज दिखाई, क्योंकि परीक्षण घोल का pH नैनोकणों से तैयार घोल के pH के समान था (चित्र 5e)। pH = 7 पर, नैनोकण अस्थिर थे और पहले दो घंटों के भीतर लगभग पूरी तरह से विघटित हो गए (चित्र 5f)। ऐसा इसलिए है क्योंकि उच्च pH पर चिटोसन का डीप्रोटोनेशन होता है, जिसके परिणामस्वरूप कम सघन बहुलक नेटवर्क और लोड किए गए इंसुलिन की रिलीज होती है।
इसके अलावा, मैनिटोल के बिना स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स ने अन्य निर्जलित नैनोपार्टिकल्स की तुलना में तेज़ रिलीज़ प्रोफ़ाइल दिखाई (चित्र 5डी-एफ)। जैसा कि पहले बताया गया है, मैनिटोल के बिना सुखाए गए पुनर्गठित इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स ने सबसे छोटा कण आकार दिखाया। छोटे कण एक बड़ा सतह क्षेत्र प्रदान करते हैं, इसलिए अधिकांश संबंधित दवा कण की सतह पर या उसके पास होगी, जिसके परिणामस्वरूप दवा का तेजी से रिलीज होगा26।
नैनोपार्टिकल्स की साइटोटॉक्सिसिटी का अध्ययन एमटीटी परख द्वारा किया गया। जैसा कि चित्र एस4 में दिखाया गया है, 50-500 μg/ml की सांद्रता पर सभी निर्जलित नैनोपार्टिकल्स का कोशिका व्यवहार्यता पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पाया गया, जिससे पता चलता है कि सभी निर्जलित नैनोपार्टिकल्स का उपयोग चिकित्सीय सीमा तक पहुंचने के लिए सुरक्षित रूप से किया जा सकता है।
यकृत वह मुख्य अंग है जिसके माध्यम से इंसुलिन अपने शारीरिक कार्यों को पूरा करता है। हेपजी2 कोशिकाएं एक मानव हेपेटोमा कोशिका रेखा हैं जिनका उपयोग आमतौर पर इन विट्रो हेपेटोसाइट अपटेक मॉडल के रूप में किया जाता है। यहां, हेपजी2 कोशिकाओं का उपयोग फ्रीज-ड्राइंग और स्प्रे-ड्राइंग विधियों द्वारा निर्जलित नैनोकणों के कोशिकीय अपटेक का आकलन करने के लिए किया गया था। 25 μg/mL की सांद्रता पर मुक्त FITC इंसुलिन, ताजा तैयार FITC इंसुलिन-युक्त नैनोकणों और समान इंसुलिन सांद्रता पर निर्जलित FITC इंसुलिन-युक्त नैनोकणों के साथ कई घंटों के इनक्यूबेशन के बाद फ्लो साइटोमेट्री और विजन का उपयोग करके कन्फोकल लेजर स्कैनिंग द्वारा कोशिकीय अपटेक का मात्रात्मक सूक्ष्मदर्शी (CLSM) अवलोकन किया गया। मैनिटोल रहित लाइयोफिलाइज्ड नैनोकण निर्जलीकरण के दौरान नष्ट हो गए और इस परीक्षण में उनका मूल्यांकन नहीं किया गया। ताजा तैयार इंसुलिन-युक्त नैनोकणों, मैनिटोल युक्त लाइयोफिलाइज्ड नैनोकणों और मैनिटोल युक्त और बिना मैनिटोल युक्त स्प्रे-ड्राइड नैनोकणों की अंतःकोशिकीय प्रतिदीप्ति तीव्रता का मूल्यांकन किया गया। मैनिटोल (चित्र 6a) की मात्रा मुक्त इंसुलिन समूह की तुलना में क्रमशः 4.3, 2.6, 2.4 और 4.1 गुना अधिक थी (चित्र 6b)। ये परिणाम बताते हैं कि एनकैप्सुलेटेड इंसुलिन, मुक्त इंसुलिन की तुलना में कोशिकीय अवशोषण में अधिक शक्तिशाली है, जिसका मुख्य कारण अध्ययन में उत्पादित इंसुलिन-युक्त नैनोकणों का छोटा आकार है।
ताज़ा तैयार किए गए नैनोपार्टिकल्स और निर्जलित नैनोपार्टिकल्स के साथ 4 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद हेपजी2 कोशिकाओं द्वारा अवशोषण: (ए) हेपजी2 कोशिकाओं द्वारा एफआईटीसी-इंसुलिन अवशोषण का वितरण। (बी) फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषित प्रतिदीप्ति तीव्रता का ज्यामितीय माध्य (एन = 3), * मुक्त इंसुलिन की तुलना में पी < 0.05।
इसी प्रकार, CLSM छवियों से पता चला कि ताज़ा तैयार किए गए FITC-इंसुलिन-युक्त NPs और FITC-इंसुलिन-युक्त स्प्रे-ड्राइड NPs (मैनिटोल के बिना) की FITC फ्लोरेसेंस तीव्रता अन्य नमूनों की तुलना में कहीं अधिक मजबूत थी (चित्र 6a)। इसके अलावा, मैनिटोल मिलाने से घोल की उच्च चिपचिपाहट के कारण कोशिकीय अवशोषण में प्रतिरोध बढ़ गया, जिसके परिणामस्वरूप इंसुलिन का प्रसार कम हो गया। ये परिणाम बताते हैं कि मैनिटोल-मुक्त स्प्रे-ड्राइड NPs ने उच्चतम कोशिकीय अवशोषण दक्षता प्रदर्शित की क्योंकि पुनर्घुलन के बाद उनके कणों का आकार फ्रीज-ड्राइड NPs की तुलना में छोटा था।
चिटोसन (औसत आणविक भार 100 KDa, 75–85% डीएसेटिलेटेड) सिग्मा-एल्ड्रिच (ओकविले, ओंटारियो, कनाडा) से खरीदा गया था। सोडियम ट्रिपॉलीफॉस्फेट (टीपीपी) वीडब्ल्यूआर (रैडनर, पेंसिल्वेनिया, यूएसए) से खरीदा गया था। इस अध्ययन में प्रयुक्त रिकॉम्बिनेंट मानव इंसुलिन फिशर साइंटिफिक (वाल्थम, एमए, यूएसए) से प्राप्त किया गया था। फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी)-लेबल वाला मानव इंसुलिन और 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल डाइहाइड्रोक्लोराइड (डीएपीआई) सिग्मा-एल्ड्रिच (ओकविले, ओंटारियो, कनाडा) से खरीदे गए थे। हेपजी2 सेल लाइन एटीसीसी (मनासास, वर्जीनिया, यूएसए) से प्राप्त की गई थी। अन्य सभी अभिकर्मक विश्लेषणात्मक या क्रोमैटोग्राफिक ग्रेड के थे।
0.1% एसिटिक एसिड युक्त डबल डिस्टिल्ड वाटर (डीडी वाटर) में घोलकर 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर सीएस घोल तैयार करें। टीपीपी और इंसुलिन के 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर घोल को क्रमशः डीडी वाटर और 0.1% एसिटिक एसिड में घोलकर तैयार करें। प्री-इमल्शन को पॉलीट्रॉन पीसीयू-2-110 हाई-स्पीड होमोजेनाइज़र (ब्रिंकमैन इंड. वेस्टबरी, न्यूयॉर्क, यूएसए) से तैयार किया गया था। तैयारी प्रक्रिया इस प्रकार है: सबसे पहले, 2 मिलीलीटर टीपीपी घोल को 4 मिलीलीटर इंसुलिन घोल में मिलाया जाता है, और मिश्रण को 30 मिनट तक हिलाकर अच्छी तरह मिलाया जाता है। फिर, मिश्रित घोल को सिरिंज के माध्यम से सीएस घोल में बूंद-बूंद करके उच्च गति से हिलाते हुए (10,000 आरपीएम) डाला जाता है। मिश्रण को 30 मिनट के लिए बर्फ के स्नान में उच्च गति से हिलाते हुए (15,000 आरपीएम) रखा जाता है, और क्रॉस-लिंक्ड इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स प्राप्त करने के लिए उन्हें एक निश्चित पीएच पर समायोजित किया जाता है। कणों के आकार को और अधिक समरूप बनाने और कम करने के लिए, इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स को एक प्रोब-टाइप सोनिकेटर (यूपी 200एसटी, हिल्स्चर अल्ट्रासोनिक्स, टेल्टो, जर्मनी) का उपयोग करके आइस बाथ में अतिरिक्त 30 मिनट के लिए सोनिकेट किया गया।
इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स (एनपी) के जेड-औसत व्यास, पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (पीडीआई) और ज़ेटा पोटेंशियल का परीक्षण 25°C पर डीडी पानी में घोलकर, लाइटसाइज़र 500 (एंटोन पार, ग्राज़, ऑस्ट्रिया) का उपयोग करके डायनेमिक लाइट स्कैटरिंग (डीएलएस) माप द्वारा किया गया। आकारिकी और आकार वितरण का लक्षण वर्णन हिताची एच7600 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) (हिताची, टोक्यो, जापान) द्वारा किया गया, और छवियों का विश्लेषण बाद में हिताची इमेजिंग सॉफ्टवेयर (हिताची, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके किया गया। इंसुलिन एनपी की एनकैप्सुलेशन दक्षता (ईई) और लोडिंग क्षमता (एलसी) का आकलन करने के लिए, एनपी को 100 केडीए के आणविक भार कट-ऑफ वाली अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबों में पिपेट किया गया और 30 मिनट के लिए 500 एक्सजी पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। फ़िल्ट्रेट में अनएनकैप्सुलेटेड इंसुलिन की मात्रा का निर्धारण एजिलेंट 1100 सीरीज एचपीएलसी सिस्टम (एजिलेंट, सांता क्लारा, कैलिफोर्निया, यूएसए) का उपयोग करके किया गया। इसमें एक चतुर्धातुक पंप, ऑटोसेम्प्लर, कॉलम हीटर और डीएडी डिटेक्टर शामिल हैं। इंसुलिन का विश्लेषण सी18 कॉलम (ज़ोरबैक्स, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, एजिलेंट, यूएसए) द्वारा किया गया और 214 nm पर इसका पता लगाया गया। मोबाइल चरण एसीटोनिट्राइल और पानी था, जिसमें 0.1% टीएफए था, ग्रेडिएंट अनुपात 10/90 से 100/0 तक था, और इसे 10 मिनट तक चलाया गया। मोबाइल चरण को 1.0 मिली/मिनट की प्रवाह दर पर पंप किया गया। कॉलम का तापमान 20 °C पर सेट किया गया था। समीकरण (1) और समीकरण (2) का उपयोग करके ईई और एलसी के प्रतिशत की गणना करें।
इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स (एनपी) को अनुकूलित करने के लिए 2.0 से 4.0 तक के विभिन्न सीएस/इंसुलिन अनुपातों का परीक्षण किया गया। तैयारी के दौरान सीएस घोल की अलग-अलग मात्राएँ मिलाई गईं, जबकि इंसुलिन/टीपीपी मिश्रण को स्थिर रखा गया। सभी घोलों (इंसुलिन, टीपीपी और सीएस) को मिलाने के बाद मिश्रण के पीएच को सावधानीपूर्वक नियंत्रित करके 4.0 से 6.5 के पीएच रेंज में इंसुलिन एनपी तैयार किए गए। इंसुलिन एनपी के निर्माण को अनुकूलित करने के लिए विभिन्न पीएच मानों और सीएस/इंसुलिन द्रव्यमान अनुपातों पर इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स की ऊर्जा दक्षता (ईई) और कण आकार का मूल्यांकन किया गया।
अनुकूलित इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स को एल्यूमीनियम कंटेनर पर रखा गया और टिशू पेपर से ढककर टेप से कसकर बांध दिया गया। इसके बाद, स्क्रू से कसे हुए कंटेनरों को लैबकोंको फ्रीज़ज़ोन फ्रीज़ ड्रायर (लैबकोंको, कैनसस सिटी, एमओ, यूएसए) में रखा गया, जिसमें एक ट्रे ड्रायर लगा हुआ था। तापमान और वैक्यूम दबाव को पहले 2 घंटों के लिए -10 डिग्री सेल्सियस और 0.350 टॉर पर सेट किया गया, और शेष 22 घंटों के लिए 0 डिग्री सेल्सियस और 0.120 टॉर पर सेट किया गया ताकि सूखे इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स प्राप्त हो सकें।
एनकैप्सुलेटेड इंसुलिन बनाने के लिए बुची मिनी स्प्रे ड्रायर बी-290 (बुची, फ्लाविल, स्विट्जरलैंड) का उपयोग किया गया था। चयनित सुखाने के पैरामीटर थे: तापमान 100 डिग्री सेल्सियस, फीड फ्लो 3 लीटर/मिनट और गैस फ्लो 4 लीटर/मिनट।
निर्जलीकरण से पहले और बाद में इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स का लक्षण वर्णन FTIR-ATR स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके किया गया। निर्जलित नैनोपार्टिकल्स के साथ-साथ मुक्त इंसुलिन और चिटोसन का विश्लेषण एक स्पेक्ट्रम 100 FTIR स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (पेर्किनएल्मर, वाल्थम, मैसाचुसेट्स, यूएसए) का उपयोग करके किया गया, जिसमें एक सार्वभौमिक ATR सैंपलिंग एक्सेसरी (पेर्किनएल्मर, वाल्थम, मैसाचुसेट्स, यूएसए) लगी हुई थी। 4000-600 cm2 की आवृत्ति सीमा में 4 cm2 के रिज़ॉल्यूशन पर 16 स्कैन से सिग्नल औसत प्राप्त किए गए।
शुष्क इंसुलिन नैनोकणों की आकृति विज्ञान का आकलन हेलिओस नैनोलैब 650 फोकस्ड आयन बीम-स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एफआईबी-एसईएम) (एफईआई, हिल्सबोरो, ओरेगन, यूएसए) द्वारा ली गई फ्रीज-ड्राइड और स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोकणों की एसईएम छवियों द्वारा किया गया। मुख्य पैरामीटर के रूप में वोल्टेज 5 केवी और करंट 30 एमए का उपयोग किया गया।
सभी निर्जलित इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स को डीडी पानी में पुनः घोला गया। निर्जलीकरण के बाद उनकी गुणवत्ता का आकलन करने के लिए कण आकार, पीडीआई, ईई और एलसी का पुनः परीक्षण पहले बताई गई विधि का उपयोग करके किया गया। लंबे समय तक भंडारण के बाद एनहाइड्रोइंसुलिन नैनोपार्टिकल्स के गुणों का परीक्षण करके उनकी स्थिरता का भी आकलन किया गया। इस अध्ययन में, निर्जलीकरण के बाद सभी नैनोपार्टिकल्स को तीन महीने के लिए रेफ्रिजरेटर में रखा गया। तीन महीने के भंडारण के बाद, नैनोपार्टिकल्स के आकार, पीडीआई, ईई और एलसी का परीक्षण किया गया।
निर्जलीकरण के बाद नैनोपार्टिकल्स की सुरक्षा में इंसुलिन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, 5 मिलीलीटर पुनर्गठित नैनोपार्टिकल्स को 45 मिलीलीटर कृत्रिम गैस्ट्रिक द्रव (पीएच 1.2, जिसमें 1% पेप्सिन हो), आंतों के द्रव (पीएच 6.8, जिसमें 1% ट्रिप्सिन हो) या काइमोट्रिप्सिन घोल (100 ग्राम/मिलीलीटर, फॉस्फेट बफर में, पीएच 7.8) में घोलें। इन्हें 37°C पर 100 आरपीएम की गति से हिलाते हुए इनक्यूबेट किया गया। विभिन्न समय बिंदुओं पर 500 माइक्रोलीटर घोल एकत्र किया गया और एचपीएलसी द्वारा इंसुलिन की सांद्रता निर्धारित की गई।
ताज़ा तैयार और निर्जलित इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स के इन विट्रो रिलीज व्यवहार का परीक्षण डायलिसिस बैग विधि (आणविक भार कट-ऑफ 100 kDa, स्पेक्ट्रा पोर इंक.) द्वारा किया गया। ताज़ा तैयार और पुनर्गठित शुष्क नैनोपार्टिकल्स को pH 2.5, pH 6.6 और pH 7.0 (0.1 M फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन, PBS) वाले तरल पदार्थों में डायलिसिस किया गया ताकि क्रमशः पेट, ग्रहणी और ऊपरी छोटी आंत के pH वातावरण का अनुकरण किया जा सके। सभी नमूनों को 37°C पर 200 rpm की निरंतर गति से हिलाते हुए इनक्यूबेट किया गया। 5 मिलीलीटर डायलिसिस बैग के बाहर के तरल पदार्थ को निम्नलिखित समय पर निकाला गया: 0.5, 1, 2, 3, 4 और 6 घंटे, और तुरंत ताज़ा डायलाइसेट से आयतन को फिर से भर दिया गया। तरल पदार्थ में इंसुलिन संदूषण का विश्लेषण HPLC द्वारा किया गया, और नैनोपार्टिकल्स से इंसुलिन रिलीज की दर की गणना मुक्त इंसुलिन रिलीज और कुल एन्कैप्सुलेटेड इंसुलिन के अनुपात से की गई। नैनोकण (समीकरण 3)।
मानव हेपेटोसेल्यूलर कार्सिनोमा सेल लाइन HepG2 कोशिकाओं को 60 मिमी व्यास की डिश में डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में उगाया गया, जिसमें 10% भ्रूण बोवाइन सीरम, 100 IU/mL पेनिसिलिन और 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन29 शामिल थे। कल्चर को 37°C, 95% सापेक्ष आर्द्रता और 5% CO2 पर बनाए रखा गया। अपटेक assays के लिए, HepG2 कोशिकाओं को 1 × 10⁵ कोशिकाओं/ml की सांद्रता पर 8-वेल Nunc Lab-Tek चैम्बर स्लाइड सिस्टम (Thermo Fisher, NY, USA) पर बोया गया। साइटोटॉक्सिसिटी assays के लिए, उन्हें 96-वेल प्लेट्स (Corning, NY, USA) में 5 × 10⁴ कोशिकाओं/ml की सांद्रता पर बोया गया।
ताज़ा तैयार और निर्जलित इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स (एनपी)30 की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए एमटीटी परख का उपयोग किया गया था। हेपजी2 कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों में 5 × 104 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर बोया गया और परीक्षण से पहले 7 दिनों तक संवर्धित किया गया। इंसुलिन एनपी को संवर्धन माध्यम में विभिन्न सांद्रता (50 से 500 माइक्रोग्राम/एमएल) में पतला किया गया और फिर कोशिकाओं को दिया गया। 24 घंटे के ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस से 3 बार धोया गया और अतिरिक्त 4 घंटे के लिए 0.5 मिलीग्राम/एमएल एमटीटी युक्त माध्यम के साथ ऊष्मायन किया गया। साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन टेकान इनफिनिट एम200 प्रो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर प्लेट रीडर (टेकान, मैन्नेडॉर्फ, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करके 570 एनएम पर पीले टेट्राज़ोलियम एमटीटी के बैंगनी फोरमाज़ान में एंजाइमेटिक कमी को मापकर किया गया था।
नैनोपार्टिकल्स (एनपी) की कोशिकीय अवशोषण दक्षता का परीक्षण कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा किया गया। ननक लैब-टेक चैम्बर स्लाइड सिस्टम के प्रत्येक वेल में मुक्त FITC-इंसुलिन, FITC-इंसुलिन-युक्त एनपी और 25 μg/mL निर्जलित FITC-इंसुलिन एनपी को समान सांद्रता पर उपचारित किया गया और 4 घंटे तक इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को पीबीएस से 3 बार धोया गया और 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड से स्थिर किया गया। नाभिकों को 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI) से रंगा गया। इंसुलिन के स्थानीयकरण का अवलोकन ओलंपस FV1000 लेजर स्कैनिंग/टू-फोटॉन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (ओलंपस, शिंजुकु सिटी, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके किया गया। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, 10 μg/mL मुक्त FITC-इंसुलिन की समान सांद्रता का उपयोग किया गया। FITC-इंसुलिन से भरे नैनोपार्टिकल्स और पुनर्घुलनशील निर्जलित FITC-इंसुलिन नैनोपार्टिकल्स को HepG2 कोशिकाओं से युक्त 96-वेल प्लेटों में डाला गया और 4 घंटे तक इनक्यूबेट किया गया। 4 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को निकालकर FBS से तीन बार धोया गया। प्रत्येक नमूने में 5 × 10⁴ कोशिकाओं का विश्लेषण BD LSR II फ्लो साइटोमीटर (BD, फ्रैंकलिन लेक्स, न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमेरिका) द्वारा किया गया।
सभी मानों को माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया गया है। सभी समूहों के बीच तुलना का आकलन आईबीएम एसपीएसएस स्टैटिस्टिक्स 26 फॉर मैक (आईबीएम, एंडिकॉट, न्यूयॉर्क, यूएसए) द्वारा वन-वे एनोवा या टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया था।
यह अध्ययन स्प्रे ड्राइंग की लचीलता और क्षमता को दर्शाता है, जो मानक फ्रीज-ड्राइंग विधियों की तुलना में क्रॉस-लिंक्ड चिटोसन/टीपीपी/इंसुलिन नैनोकणों को निर्जलित करने में सक्षम है। इसमें बल्किंग एजेंट या क्रायोप्रोटेक्टेंट का उपयोग करने की क्षमता और उच्च भार वहन क्षमता के साथ बेहतर पुनर्निर्माण होता है। अनुकूलित इंसुलिन नैनोकणों का औसत कण आकार 318 एनएम और एनकैप्सुलेशन दक्षता 99.4% थी। निर्जलीकरण के बाद एसईएम और एफटीआईआर परिणामों से पता चला कि गोलाकार संरचना केवल स्प्रे-ड्राइड नैनोकणों में ही बनी रही, जिनमें मैनिटोल का प्रयोग किया गया था और जिनमें मैनिटोल नहीं था, और मैनिटोल के साथ लाइयोफिलाइज्ड नैनोकणों में भी, लेकिन मैनिटोल के बिना लाइयोफिलाइज्ड नैनोकण निर्जलीकरण के दौरान विघटित हो गए। पुनर्निर्माण क्षमता परीक्षण में, मैनिटोल के बिना स्प्रे-ड्राइड इंसुलिन नैनोकणों ने सबसे छोटा औसत कण आकार और पुनर्निर्माण पर उच्चतम भार वहन क्षमता दिखाई। इन सभी निर्जलित नैनोकणों के रिलीज व्यवहार से पता चला कि वे पीएच = 2.5 और पीएच = 7 के विलयनों में तेजी से रिलीज हुए, और पीएच = 7 के विलयनों में बहुत स्थिर थे। 6.5. अन्य पुनर्घुलनशील निर्जलित नैनोकणों की तुलना में, मैनिटोल के बिना स्प्रे-ड्राइड किए गए नैनोकणों ने सबसे तेज़ रिलीज दिखाया। यह परिणाम कोशिकीय अवशोषण परीक्षण में देखे गए परिणाम के अनुरूप है, क्योंकि मैनिटोल की अनुपस्थिति में स्प्रे-ड्राइड किए गए नैनोकणों ने लगभग पूरी तरह से ताज़ा तैयार किए गए नैनोकणों की कोशिकीय अवशोषण दक्षता को बनाए रखा। ये परिणाम बताते हैं कि मैनिटोल-मुक्त स्प्रे ड्राइंग द्वारा तैयार किए गए शुष्क इंसुलिन नैनोकण अन्य निर्जल खुराक रूपों, जैसे मौखिक गोलियों या जैव-चिपकने वाली फिल्मों में आगे की प्रक्रिया के लिए सबसे उपयुक्त हैं।
बौद्धिक संपदा संबंधी मुद्दों के कारण, वर्तमान अध्ययन के दौरान उत्पन्न और/या विश्लेषण किए गए डेटासेट सार्वजनिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, लेकिन उचित अनुरोध पर संबंधित लेखकों से प्राप्त किए जा सकते हैं।
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