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प्रोपियोनिक एसिड (पीपीए) का उपयोग ऑटिज्म स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर जैसे तंत्रिका विकास संबंधी विकारों में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। पीपीए माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस, मेटाबॉलिज्म और टर्नओवर को बाधित करने के लिए जाना जाता है। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता, विखंडन और संलयन पर पीपीए के प्रभाव इन तंत्रों की जटिल लौकिक प्रकृति के कारण समस्याग्रस्त बने हुए हैं। यहां, हम पूरक मात्रात्मक इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके यह जांच करते हैं कि पीपीए न्यूरॉन जैसी SH-SY5Y कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर, आकारिकी और गतिशीलता को कैसे प्रभावित करता है। पीपीए (5 mM) ने माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र (p < 0.01), फेरेट व्यास और परिधि (p < 0.05), और क्षेत्र 2 (p < 0.01) में महत्वपूर्ण कमी का कारण बना। माइटोकॉन्ड्रियल इवेंट लोकेटर विश्लेषण ने विखंडन और संलयन घटनाओं में महत्वपूर्ण वृद्धि (p < 0.05) दिखाई, जिससे तनाव की स्थिति में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की अखंडता बनी रही। इसके अतिरिक्त, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) और OPA1 (p < 0.05) की mRNA अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय कमी देखी गई। यह तनाव की स्थितियों में कार्य को बनाए रखने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, जैवजनन और गतिशीलता के पुनर्निर्माण को दर्शाता है। हमारा डेटा माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता पर PPA के प्रभावों के बारे में नई जानकारी प्रदान करता है और माइटोकॉन्ड्रियल तनाव प्रतिक्रियाओं में शामिल जटिल नियामक तंत्रों के अध्ययन के लिए इमेजिंग तकनीकों की उपयोगिता को उजागर करता है।
माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा उत्पादन और जैवसंश्लेषण में अपनी विशिष्ट भूमिकाओं के अलावा कई कोशिकीय कार्यों में अभिन्न भागीदार होते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय कैल्शियम सिग्नलिंग, चयापचय और रेडॉक्स समस्थिति, सूजन संबंधी सिग्नलिंग, एपिजेनेटिक संशोधनों, कोशिका प्रसार, विभेदन और प्रोग्राम्ड सेल डेथ1 का प्रमुख नियामक है। विशेष रूप से, माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय तंत्रिका कोशिकाओं के विकास, अस्तित्व और कार्य के लिए महत्वपूर्ण है और तंत्रिका विकृति के विभिन्न रूपों में व्यापक रूप से शामिल है2,3,4।
पिछले एक दशक में, चयापचय स्थिति तंत्रिकाजनन, विभेदन, परिपक्वता और प्लास्टिसिटी के केंद्रीय नियामक के रूप में उभरी है5,6। हाल ही में, माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और गतिशीलता माइटोसिस के विशेष रूप से महत्वपूर्ण घटक बन गए हैं, जो एक गतिशील प्रक्रिया है जो कोशिकाओं के भीतर स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया का एक पूल बनाए रखती है। माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता जटिल परस्पर निर्भर मार्गों द्वारा विनियमित होती है, जो माइटोकॉन्ड्रियल जैवजनन और जैवऊर्जा से लेकर माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन, संलयन, परिवहन और निकासी तक फैली हुई है7,8। इनमें से किसी भी एकीकृत तंत्र में व्यवधान स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के रखरखाव को बाधित करता है और तंत्रिका विकास के लिए गंभीर कार्यात्मक परिणाम देता है9,10। वास्तव में, माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता का अविनियमन कई मनोरोग, तंत्रिका अपक्षयी और तंत्रिका विकास संबंधी विकारों में देखा जाता है, जिसमें ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकार (एएसडी) भी शामिल है11,12।
एएसडी एक जटिल आनुवंशिक और एपिजेनेटिक संरचना वाला विषम तंत्रिका विकास विकार है। एएसडी की आनुवंशिकता निर्विवाद है, लेकिन इसके अंतर्निहित आणविक कारण अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आए हैं। प्रीक्लिनिकल मॉडल, नैदानिक ​​अध्ययन और मल्टी-ओमिक्स आणविक डेटासेट से प्राप्त संचित आंकड़े एएसडी में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के बढ़ते प्रमाण प्रदान करते हैं13,14। हमने पहले एएसडी से पीड़ित रोगियों के एक समूह में जीनोम-व्यापी डीएनए मेथाइलेशन स्क्रीन किया था और माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय मार्गों के साथ समूहित विभेदक रूप से मेथाइलेटेड जीन की पहचान की थी15। इसके बाद हमने माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस और गतिशीलता के केंद्रीय नियामकों के विभेदक मेथाइलेशन की रिपोर्ट की, जो एएसडी में बढ़े हुए एमटीडीएनए कॉपी नंबर और परिवर्तित मूत्र चयापचय प्रोफाइल से जुड़ा था16। हमारे आंकड़े इस बात के बढ़ते प्रमाण प्रदान करते हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और समस्थिति एएसडी के रोगजनन में केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता, आकारिकी और कार्य के बीच संबंधों की क्रियाविधि संबंधी समझ में सुधार करना, द्वितीयक माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता से चिह्नित तंत्रिका संबंधी रोगों पर चल रहे शोध का एक प्रमुख लक्ष्य है।
माइटोकॉन्ड्रियल तनाव प्रतिक्रियाओं में विशिष्ट जीनों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए अक्सर आणविक तकनीकों का उपयोग किया जाता है। हालांकि, माइटोटिक नियंत्रण तंत्रों की बहुआयामी और क्षणिक प्रकृति के कारण यह दृष्टिकोण सीमित हो सकता है। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल जीनों की विभेदक अभिव्यक्ति कार्यात्मक परिवर्तनों का एक अप्रत्यक्ष संकेतक है, विशेष रूप से क्योंकि आमतौर पर केवल सीमित संख्या में जीनों का ही विश्लेषण किया जाता है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल कार्य और जैव-ऊर्जा के अध्ययन के लिए अधिक प्रत्यक्ष विधियों का प्रस्ताव दिया गया है17। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता से निकटता से संबंधित है। माइटोकॉन्ड्रियल आकार, संपर्क और संरचना ऊर्जा उत्पादन और माइटोकॉन्ड्रियल और कोशिका अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं5,18। इसके अलावा, माइटोसिस के विभिन्न घटक माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के उपयोगी अंतिम बिंदुओं के रूप में कार्य कर सकते हैं और बाद के यांत्रिक अध्ययनों के लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं।
माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान को ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) का उपयोग करके सीधे देखा जा सकता है, जिससे कोशिकीय अतिसंरचना का विस्तृत अध्ययन संभव हो पाता है। TEM जीन प्रतिलेखन, प्रोटीन अभिव्यक्ति या कोशिका समूहों में माइटोकॉन्ड्रियल कार्यात्मक मापदंडों पर निर्भर रहने के बजाय, व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के रिज़ॉल्यूशन पर माइटोकॉन्ड्रियल क्रिस्टी की आकृति विज्ञान, आकार और संरचना को प्रत्यक्ष रूप से प्रदर्शित करता है।17,19,20 इसके अतिरिक्त, TEM माइटोकॉन्ड्रिया और अन्य ऑर्गेनेल, जैसे कि एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और ऑटोफैगोसोम के बीच अंतःक्रियाओं के अध्ययन को सुगम बनाता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल कार्य और समस्थिति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।21,22 इस प्रकार, यह TEM को विशिष्ट मार्गों या जीनों पर ध्यान केंद्रित करने से पहले माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु बनाता है। जैसे-जैसे न्यूरोपैथोलॉजी के लिए माइटोकॉन्ड्रियल कार्य अधिकाधिक प्रासंगिक होता जा रहा है, इन विट्रो न्यूरोनल मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और गतिशीलता का प्रत्यक्ष और मात्रात्मक अध्ययन करने की स्पष्ट आवश्यकता है।
इस लेख में, हम ऑटिज़्म स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर में माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के न्यूरोनल मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता का अध्ययन करते हैं। हमने पहले माइटोकॉन्ड्रियल प्रोपियोनिल-कोए कार्बोक्सिलेज एंजाइम पीसीसी की एक उप-इकाई, एएसडी15 में प्रोपियोनिल-कोए कार्बोक्सिलेज बीटा (पीसीसीबी) के विभेदक मिथाइलेशन की रिपोर्ट की थी। पीसीसी के अनियमित होने से प्रोपियोनिल व्युत्पन्न पदार्थों, जिनमें प्रोपियोनिक एसिड (पीपीए)23,24,25 शामिल हैं, का विषाक्त संचय होता है। पीपीए को न्यूरोनल चयापचय को बाधित करने और जीवित जीवों में व्यवहार को बदलने के लिए दिखाया गया है और यह एएसडी26,27,28 में शामिल न्यूरोडेवलपमेंटल तंत्रों के अध्ययन के लिए एक स्थापित पशु मॉडल है। इसके अतिरिक्त, पीपीए को इन विट्रो में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता, जैवजनन और श्वसन को बाधित करने के लिए रिपोर्ट किया गया है और न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को मॉडल करने के लिए इसका व्यापक रूप से उपयोग किया गया है29,30। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और गतिशीलता पर पीपीए-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का प्रभाव अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं गया है।
इस अध्ययन में SH-SY5Y कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, गतिशीलता और कार्य पर PPA के प्रभावों को मापने के लिए पूरक इमेजिंग तकनीकों का उपयोग किया गया है। सबसे पहले, हमने माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और अल्ट्रास्ट्रक्चर17,31,32 में परिवर्तनों को देखने के लिए एक TEM विधि विकसित की। माइटोकॉन्ड्रिया33 की गतिशील प्रकृति को देखते हुए, हमने PPA तनाव के तहत विखंडन और संलयन घटनाओं के बीच संतुलन, माइटोकॉन्ड्रियल संख्या और आयतन में परिवर्तनों को मापने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल इवेंट लोकलाइज़र (MEL) विश्लेषण का भी उपयोग किया। अंत में, हमने यह जांच की कि क्या माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और गतिशीलता, जीवजनन, विखंडन और संलयन में शामिल जीनों की अभिव्यक्ति में परिवर्तनों से संबंधित हैं। कुल मिलाकर, हमारे डेटा माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता को नियंत्रित करने वाले तंत्रों की जटिलता को स्पष्ट करने की चुनौती को दर्शाते हैं। हम SH-SY5Y कोशिकाओं में माइटोसिस के एक मापने योग्य अभिसारी अंतिम बिंदु के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के अध्ययन में TEM की उपयोगिता पर प्रकाश डालते हैं। इसके अतिरिक्त, हम इस बात पर ज़ोर देते हैं कि मेटाबोलिक तनाव के जवाब में गतिशील घटनाओं को कैप्चर करने वाली इमेजिंग तकनीकों के साथ संयुक्त रूप से TEM डेटा सबसे समृद्ध जानकारी प्रदान करता है। तंत्रिका कोशिका विभाजन को समर्थन देने वाले आणविक नियामक तंत्रों का आगे का अध्ययन तंत्रिका तंत्र और न्यूरोडीजेनरेटिव रोगों के माइटोकॉन्ड्रियल घटक में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।
माइटोकॉन्ड्रियल तनाव उत्पन्न करने के लिए, SH-SY5Y कोशिकाओं को 3 mM और 5 mM सोडियम प्रोपियोनेट (NaP) का उपयोग करके PPA से उपचारित किया गया। TEM से पहले, नमूनों को उच्च दाब वाले हिमांक और हिमांक का उपयोग करके क्रायोजेनिक नमूना तैयार किया गया (चित्र 1a)। हमने तीन जैविक प्रतिकृतियों में माइटोकॉन्ड्रियल आबादी के आठ रूपात्मक मापदंडों को मापने के लिए एक स्वचालित माइटोकॉन्ड्रियल छवि विश्लेषण पाइपलाइन विकसित की। हमने पाया कि PPA उपचार ने चार मापदंडों को महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित किया: क्षेत्रफल 2, क्षेत्रफल, परिधि और फेरेट व्यास (चित्र 1b-e)। 3 mM और 5 mM PPA उपचार दोनों के साथ क्षेत्रफल 2 में महत्वपूर्ण कमी आई (क्रमशः p = 0.0183 और p = 0.002) (चित्र 1b), जबकि क्षेत्रफल (p = 0.003), परिधि (p = 0.0106) और फेरेट व्यास सभी में महत्वपूर्ण कमी आई। नियंत्रण समूह की तुलना में 5 mM उपचार समूह में महत्वपूर्ण कमी (p = 0.0172) देखी गई (चित्र 1c–e)। क्षेत्रफल और परिधि में महत्वपूर्ण कमी से पता चला कि 5 mM PPA से उपचारित कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया छोटे और अधिक गोल थे, और ये माइटोकॉन्ड्रिया नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में कम लंबे थे। यह फेरेट व्यास में महत्वपूर्ण कमी के अनुरूप भी है, जो कणों के किनारों के बीच की सबसे बड़ी दूरी में कमी को दर्शाने वाला एक स्वतंत्र पैरामीटर है। क्रिस्टी की अल्ट्रास्ट्रक्चर में परिवर्तन देखे गए: PPA तनाव के प्रभाव में क्रिस्टी कम स्पष्ट हो गए (चित्र 1a, पैनल B)। हालांकि, सभी छवियों में क्रिस्टी की अल्ट्रास्ट्रक्चर स्पष्ट रूप से प्रतिबिंबित नहीं हुई, इसलिए इन परिवर्तनों का मात्रात्मक विश्लेषण नहीं किया गया। ये TEM डेटा तीन संभावित परिदृश्यों को दर्शा सकते हैं: (1) PPA विखंडन को बढ़ाता है या संलयन को रोकता है, जिससे मौजूदा माइटोकॉन्ड्रिया का आकार सिकुड़ जाता है; (2) बढ़ी हुई बायोजेनेसिस नए, छोटे माइटोकॉन्ड्रिया का निर्माण करती है या (3) दोनों तंत्रों को एक साथ प्रेरित करती है। हालांकि इन स्थितियों को टीईएम द्वारा स्पष्ट रूप से नहीं पहचाना जा सकता है, लेकिन महत्वपूर्ण आकारिकीय परिवर्तन पीपीए तनाव के तहत माइटोकॉन्ड्रियल होमियोस्टेसिस और गतिशीलता में बदलाव का संकेत देते हैं। इसके बाद हमने इन गतिकी और इनके अंतर्निहित संभावित तंत्रों को और अधिक विस्तार से समझने के लिए अतिरिक्त मापदंडों का अध्ययन किया।
प्रोपियोनिक एसिड (पीपीए) माइटोकॉन्ड्रिया की आकृति को बदल देता है। (a) प्रतिनिधि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) छवियां दर्शाती हैं कि पीपीए उपचार बढ़ने के साथ माइटोकॉन्ड्रिया का आकार घटता है और वे छोटे और अधिक गोल हो जाते हैं; क्रमशः 0 mM (अनुपचारित), 3 mM और 5 mM। लाल तीर माइटोकॉन्ड्रिया को इंगित करते हैं। (b–e) 24 घंटे तक पीपीए से उपचारित SH-SY5Y कोशिकाओं को टीईएम के लिए तैयार किया गया और परिणामों का विश्लेषण फिजी/इमेजजे का उपयोग करके किया गया। आठ मापदंडों में से चार ने नियंत्रण (अनुपचारित, 0 mM पीपीए) और उपचारित (3 mM और 5 mM पीपीए) कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। (b) क्षेत्र 2, (c) क्षेत्रफल, (d) परिधि, (e) फेरेट व्यास। महत्वपूर्ण अंतर (p < 0.05) निर्धारित करने के लिए एक-तरफ़ा विश्लेषण (नियंत्रण बनाम उपचार) और डनेट के बहु-तुलना परीक्षण का उपयोग किया गया। डेटा बिंदु प्रत्येक कोशिका के लिए औसत माइटोकॉन्ड्रियल मान दर्शाते हैं, और त्रुटि बार माध्य ± SEM को दर्शाते हैं। प्रदर्शित डेटा n = 3, प्रति प्रतिकृति कम से कम 24 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है; कुल 266 छवियों का विश्लेषण किया गया; * का अर्थ है p < 0.05, ** का अर्थ है p < 0.01।
पीपीए के प्रति माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता की प्रतिक्रिया को और अधिक स्पष्ट करने के लिए, हमने माइटोकॉन्ड्रिया को टेट्रामेथिलरोडामाइन एथिल एस्टर (टीएमआरई) से रंगा और 3 और 5 एम.एम. पीपीए पर 24 घंटे बाद माइटोकॉन्ड्रिया के स्थान और मात्रा का निर्धारण करने के लिए टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी और एम.ई.एल. विश्लेषण का उपयोग किया। विखंडन और संलयन की घटनाओं का उपचार। (चित्र 2ए)। एम.ई.एल. विश्लेषण के बाद, माइटोकॉन्ड्रियल संरचनाओं की संख्या और उनके औसत आयतन को निर्धारित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया का आगे विश्लेषण किया गया। हमने 3 mM पर होने वाली विखंडन घटनाओं की संख्या में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण वृद्धि देखी [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] जबकि नियंत्रण की तुलना में 5 mM पर विखंडन [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] और संलयन [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] और संलयन [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] घटनाओं में उल्लेखनीय वृद्धि हुई (चित्र 3b)। 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] और 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] दोनों सांद्रताओं पर माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि हुई (चित्र 3c), जबकि प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियल संरचना का औसत आयतन अपरिवर्तित रहा (चित्र 3c-3d)। कुल मिलाकर, यह दर्शाता है कि माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता का पुनर्निर्माण एक क्षतिपूर्ति प्रतिक्रिया के रूप में कार्य करता है जो माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की अखंडता को सफलतापूर्वक बनाए रखता है। 3 mM PPA पर विखंडन घटनाओं की संख्या में वृद्धि से पता चलता है कि माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या में वृद्धि आंशिक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन के कारण है, लेकिन यह देखते हुए कि औसत माइटोकॉन्ड्रियल आयतन लगभग अपरिवर्तित रहता है, जैवजनन को एक अतिरिक्त क्षतिपूर्ति प्रतिक्रिया के रूप में नकारा नहीं जा सकता है। हालांकि, ये आंकड़े TEM द्वारा देखी गई छोटी, गोल माइटोकॉन्ड्रियल संरचनाओं के अनुरूप हैं और PPA द्वारा प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता में महत्वपूर्ण परिवर्तन भी प्रदर्शित करते हैं।
प्रोपियोनिक अम्ल (पीपीए) माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की अखंडता बनाए रखने के लिए गतिशील माइटोकॉन्ड्रियल रीमॉडलिंग को प्रेरित करता है। SH-SY5Y कोशिकाओं को संवर्धित किया गया, 24 घंटे के लिए 3 और 5 mM पीपीए से उपचारित किया गया और TMRE और होचस्ट 33342 से रंगा गया, जिसके बाद MEL विश्लेषण किया गया। (a) प्रत्येक स्थिति के लिए समय 2 (t2) पर रंग और द्विआधारी अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण दर्शाने वाली प्रतिनिधि समय-अंतराल माइक्रोस्कोपी छवियां। प्रत्येक द्विआधारी छवि में इंगित चयनित क्षेत्रों को बढ़ाया गया है और समय के साथ गतिशीलता को दर्शाने के लिए तीन अलग-अलग समय फ्रेम (t1-t3) पर 3D में प्रदर्शित किया गया है; संलयन घटनाओं को हरे रंग में हाइलाइट किया गया है; विखंडन घटनाओं को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है। (b) प्रति स्थिति गतिशील घटनाओं की औसत संख्या। (c) प्रति कोशिका माइटोकॉन्ड्रियल संरचनाओं की औसत संख्या। (d) प्रति कोशिका प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियल संरचना का औसत आयतन (µm³)। प्रदर्शित डेटा प्रत्येक उपचार समूह में n = 15 कोशिकाओं का प्रतिनिधि है। त्रुटि बार माध्य ± एसईएम को दर्शाते हैं, स्केल बार = 10 μm, * p < 0.05।
प्रोपियोनिक एसिड (पीपीए) माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता से जुड़े जीनों के ट्रांसक्रिप्शनल दमन का कारण बनता है। SH-SY5Y कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 3 और 5 mM पीपीए से उपचारित किया गया। सापेक्ष जीन मात्रा का निर्धारण RT-qPCR का उपयोग करके किया गया और इसे B2M के सापेक्ष सामान्यीकृत किया गया। माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस जीन (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 और (d) NFE2L2। माइटोकॉन्ड्रियल संलयन और विखंडन जीन (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 और (i) DRP1। महत्वपूर्ण अंतर (p < 0.05) का परीक्षण वन-वे ANOVA (नियंत्रण बनाम उपचार) और डनेट के बहु-तुलना परीक्षण का उपयोग करके किया गया: * p < 0.05 को इंगित करता है, ** p < 0.01 को इंगित करता है, और **** p < 0.0001 को इंगित करता है। बार औसत अभिव्यक्ति ± SEM को दर्शाते हैं। प्रदर्शित डेटा n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), और n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) जैविक प्रतिकृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
टीईएम और एमईएल विश्लेषणों से प्राप्त डेटा संयुक्त रूप से इंगित करता है कि पीपीए माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और गतिशीलता को परिवर्तित करता है। हालांकि, ये इमेजिंग तकनीकें इन प्रक्रियाओं को संचालित करने वाले अंतर्निहित तंत्रों के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करती हैं। इसलिए हमने पीपीए उपचार के प्रतिक्रिया में माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता, जीवजनन और समसूत्री विभाजन के नौ प्रमुख नियामकों की mRNA अभिव्यक्ति की जांच की। हमने 3 mM और 5 mM पीपीए के साथ 24 घंटे के उपचार के बाद सेल मायलोमा ऑन्कोजीन (cMYC), न्यूक्लियर रेस्पिरेटरी फैक्टर (NRF1), माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 1 (TFAM), NFE2-जैसे ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर BZIP (NFE2L2), गैस्ट्रिन-जैसे प्रोटीन 2 (STOML2), ऑप्टिक नर्व एट्रोफी 1 (OPA1), माइटोफ्यूसिन 1 (MFN1), माइटोफ्यूसिन 2 (MFN2) और डायनामिन-संबंधित प्रोटीन 1 (DRP1) की मात्रा निर्धारित की। हमने 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 और p < 0.0001, क्रमशः) और 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA उपचार का अवलोकन किया (चित्र 3a–c)। mRNA अभिव्यक्ति में कमी खुराक पर निर्भर थी: cMYC, NRF1 और TFAM की अभिव्यक्ति 3 mM पर क्रमशः 5.7, 2.6 और 1.9 गुना और 5 mM पर 11.2, 3 और 2.2 गुना कम हो गई। इसके विपरीत, केंद्रीय रेडॉक्स बायोजेनेसिस जीन NFE2L2 PPA की किसी भी सांद्रता पर अपरिवर्तित रहा, हालांकि अभिव्यक्ति में कमी का एक समान खुराक-निर्भर रुझान देखा गया (चित्र 3d)।
हमने विखंडन और संलयन के नियमन में शामिल शास्त्रीय जीनों की अभिव्यक्ति का भी अध्ययन किया। STOML2 को संलयन, माइटोफेजी और जैवजनन में शामिल माना जाता है, और इसकी अभिव्यक्ति 3 mM (2.4 गुना परिवर्तन) और 5 mM (2.8 गुना परिवर्तन) PPA द्वारा काफी कम हो गई (p < 0.0001) (चित्र 1)। 3d)। इसी प्रकार, OPA1 संलयन जीन की अभिव्यक्ति 3 mM (1.6 गुना परिवर्तन) और 5 mM (1.9 गुना परिवर्तन) PPA पर कम हो गई (क्रमशः p = 0.006 और p = 0.0024) (चित्र 3f)। हालांकि, 24 घंटे के PPA तनाव के तहत संलयन जीन MFN1, MFN2 या विखंडन जीन DRP1 की अभिव्यक्ति में हमें कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिला (चित्र 3g–i)। इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि चार संलयन और विखंडन प्रोटीन (OPA1, MFN1, MFN2 और DRP1) के स्तर समान परिस्थितियों में अपरिवर्तित रहे (चित्र 4a–d)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ये आंकड़े एक निश्चित समय बिंदु को दर्शाते हैं और PPA तनाव के प्रारंभिक चरणों के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति या गतिविधि स्तरों में होने वाले परिवर्तनों को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। हालांकि, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 और OPA1 की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय, जैवजनन और गतिशीलता के महत्वपूर्ण प्रतिलेखन संबंधी अनियमितता को इंगित करती है। इसके अतिरिक्त, ये आंकड़े माइटोकॉन्ड्रियल कार्य में अंतिम अवस्था के परिवर्तनों का प्रत्यक्ष अध्ययन करने के लिए इमेजिंग तकनीकों की उपयोगिता को उजागर करते हैं।
प्रोपियोनिक एसिड (पीपीए) उपचार के बाद फ्यूजन और फिशन फैक्टर प्रोटीन के स्तर में कोई परिवर्तन नहीं हुआ। SH-SY5Y कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 3 और 5 mM पीपीए से उपचारित किया गया। प्रोटीन के स्तर का मापन वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा किया गया, और अभिव्यक्ति स्तरों को कुल प्रोटीन के सापेक्ष सामान्यीकृत किया गया। औसत प्रोटीन अभिव्यक्ति और लक्षित तथा कुल प्रोटीन के प्रतिनिधि वेस्टर्न ब्लॉट दिखाए गए हैं। a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1। बार माध्य ± SEM दर्शाते हैं, और प्रदर्शित डेटा n = 3 जैविक प्रतिकृतियों का प्रतिनिधि है। एक-तरफ़ा विश्लेषण और डनेट परीक्षण का उपयोग करके बहु-तुलना (p < 0.05) की गई। मूल जेल और ब्लॉट चित्र S1 में दिखाए गए हैं।
माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन कई तरह की बीमारियों से जुड़ा है, जिनमें मेटाबोलिक, कार्डियोवैस्कुलर और मस्कुलर बीमारियों से लेकर न्यूरोलॉजिकल बीमारियां शामिल हैं।1,10 कई न्यूरोडीजेनरेटिव और न्यूरोडीजेनरेटिव बीमारियां माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जुड़ी हैं, जो मस्तिष्क के जीवनकाल में इन ऑर्गेनेल के महत्व को उजागर करती हैं। इन बीमारियों में पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग और एएसडी3,4,18 शामिल हैं। हालांकि, इन बीमारियों का अध्ययन करने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों तक पहुंचना मुश्किल है, खासकर क्रियाविधि के स्तर पर, जिससे सेलुलर मॉडल सिस्टम एक आवश्यक विकल्प बन जाते हैं। इस अध्ययन में, हम पीपीए-उपचारित SH-SY5Y कोशिकाओं का उपयोग करके एक सेलुलर मॉडल सिस्टम का उपयोग करते हैं ताकि न्यूरोनल बीमारियों, विशेष रूप से ऑटिज्म स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर में देखे गए माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को दोहराया जा सके। न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल डायनामिक्स का अध्ययन करने के लिए इस पीपीए मॉडल का उपयोग एएसडी के एटियलॉजी में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।
हमने माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में परिवर्तनों को देखने के लिए टीईएम के उपयोग की संभावना का पता लगाया। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टीईएम की प्रभावशीलता को अधिकतम करने के लिए इसका सही उपयोग आवश्यक है। क्रायो-नमूनों की तैयारी से कोशिकीय घटकों को एक साथ स्थिर करके और कलाकृतियों के निर्माण को कम करके तंत्रिका संरचनाओं का बेहतर संरक्षण संभव होता है।34 इसके अनुरूप, हमने देखा कि न्यूरॉन जैसी SH-SY5Y कोशिकाओं में अक्षुण्ण उपकोशिकीय अंग और लम्बी माइटोकॉन्ड्रिया थीं (चित्र 1a)। यह तंत्रिका कोशिका मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए क्रायोजेनिक तैयारी तकनीकों की उपयोगिता को उजागर करता है। यद्यपि टीईएम डेटा के वस्तुनिष्ठ विश्लेषण के लिए मात्रात्मक माप महत्वपूर्ण हैं, फिर भी इस बात पर कोई सहमति नहीं है कि माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान परिवर्तनों की पुष्टि करने के लिए किन विशिष्ट मापदंडों को मापा जाना चाहिए। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का मात्रात्मक रूप से अध्ययन करने वाले कई अध्ययनों17,31,32 के आधार पर, हमने एक स्वचालित माइटोकॉन्ड्रियल छवि विश्लेषण पाइपलाइन विकसित की है जो आठ आकृति विज्ञान मापदंडों को मापती है, अर्थात्: क्षेत्रफल, क्षेत्रफल², पहलू अनुपात, परिधि, वृत्ताकारता, डिग्री, फेरेट व्यास। और गोलाई।
इनमें से, पीपीए ने क्षेत्रफल 2, क्षेत्रफल, परिधि और फेरेट व्यास को काफी हद तक कम कर दिया (चित्र 1b–e)। इससे पता चला कि माइटोकॉन्ड्रिया छोटे और अधिक गोल हो गए, जो पिछले अध्ययनों के अनुरूप है जिनमें पीपीए30-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल तनाव के 72 घंटे बाद माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्रफल में कमी देखी गई थी। ये रूपात्मक विशेषताएं माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन का संकेत दे सकती हैं, जो माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क से क्षतिग्रस्त घटकों को अलग करने और माइटोफेजी35,36,37 के माध्यम से उनके अपघटन को बढ़ावा देने के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है। दूसरी ओर, औसत माइटोकॉन्ड्रियल आकार में कमी बढ़ी हुई बायोजेनेसिस से जुड़ी हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप छोटे नवजात माइटोकॉन्ड्रिया का निर्माण होता है। बढ़ा हुआ विखंडन या बायोजेनेसिस माइटोकॉन्ड्रियल तनाव के विरुद्ध माइटोसिस को बनाए रखने के लिए एक क्षतिपूर्ति प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल वृद्धि में कमी, संलयन में बाधा या अन्य स्थितियों को भी नकारा नहीं जा सकता है।
हालांकि टीईएम द्वारा निर्मित उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के स्तर पर रूपात्मक विशेषताओं के निर्धारण की अनुमति देती हैं, यह विधि एक ही समय में दो-आयामी स्नैपशॉट उत्पन्न करती है। चयापचय तनाव के लिए गतिशील प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, हमने माइटोकॉन्ड्रिया को टीएमआरई से रंगा और एमईएल विश्लेषण के साथ टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया, जो समय के साथ माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क में परिवर्तनों के उच्च-थ्रूपुट 3डी दृश्यीकरण की अनुमति देता है33,38। हमने पीपीए तनाव के तहत माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता में सूक्ष्म लेकिन महत्वपूर्ण परिवर्तन देखे (चित्र 2)। 3 एमएम पर, विखंडन घटनाओं की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जबकि संलयन घटनाएं नियंत्रण के समान ही रहीं। 5 एमएम पीपीए पर विखंडन और संलयन दोनों घटनाओं की संख्या में वृद्धि देखी गई, लेकिन ये परिवर्तन लगभग आनुपातिक थे, जिससे पता चलता है कि विखंडन और संलयन गतिकी उच्च सांद्रता पर संतुलन तक पहुंच जाती है (चित्र 2बी)। 3 और 5 mM PPA दोनों सांद्रताओं पर माइटोकॉन्ड्रियल आयतन का औसत अपरिवर्तित रहा, जिससे यह संकेत मिलता है कि माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की अखंडता संरक्षित रही (चित्र 2d)। यह गतिशील माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की हल्की चयापचय संबंधी तनाव के प्रति प्रतिक्रिया करने और नेटवर्क विखंडन के बिना समस्थिति को प्रभावी ढंग से बनाए रखने की क्षमता को दर्शाता है। 3 mM PPA पर, विखंडन में वृद्धि एक नए संतुलन में संक्रमण को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त है, लेकिन PPA की उच्च सांद्रता द्वारा प्रेरित तनाव के प्रति प्रतिक्रिया में अधिक गहन गतिज पुनर्निर्माण की आवश्यकता होती है।
पीपीए तनाव की दोनों सांद्रताओं पर माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या में वृद्धि हुई, लेकिन औसत माइटोकॉन्ड्रियल आयतन में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ (चित्र 2सी)। यह बढ़ी हुई जैवजनन या बढ़े हुए विभाजन के कारण हो सकता है; हालाँकि, औसत माइटोकॉन्ड्रियल आयतन में महत्वपूर्ण कमी न होने के कारण, यह अधिक संभावना है कि जैवसंश्लेषण में वृद्धि हुई है। हालाँकि, चित्र 2 में दिए गए आंकड़े दो क्षतिपूर्ति तंत्रों के अस्तित्व का समर्थन करते हैं: विखंडन घटनाओं की संख्या में वृद्धि, जो माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन के उन्नयन के अनुरूप है, और घटनाओं की संख्या में वृद्धि, जो माइटोकॉन्ड्रियल जैवजनन के अनुरूप है। अंततः, हल्के तनाव के लिए गतिशील क्षतिपूर्ति में विखंडन, संलयन, जैवजनन और माइटोफेजी से जुड़ी एक साथ होने वाली प्रक्रियाएं शामिल हो सकती हैं। यद्यपि पिछले लेखकों ने दिखाया है कि पीपीए माइटोसिस30,39 और माइटोफेजी29 को बढ़ाता है, हम पीपीए के जवाब में माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन और संलयन गतिशीलता के पुनर्निर्माण के प्रमाण प्रस्तुत करते हैं। ये आंकड़े टीईएम द्वारा देखे गए रूपात्मक परिवर्तनों की पुष्टि करते हैं और पीपीए-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता से जुड़े तंत्रों के बारे में और अधिक जानकारी प्रदान करते हैं।
क्योंकि न तो टीईएम और न ही एमईएल विश्लेषण ने देखे गए रूपात्मक परिवर्तनों के अंतर्निहित जीन नियामक तंत्रों का प्रत्यक्ष प्रमाण प्रदान किया, इसलिए हमने माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय, जैवजनन और गतिशीलता में शामिल जीनों की आरएनए अभिव्यक्ति की जांच की। cMYC प्रोटो-ऑन्कोजीन एक प्रतिलेखन कारक है जो माइटोकॉन्ड्रिया, ग्लाइकोलिसिस, अमीनो एसिड और फैटी एसिड चयापचय40 के नियमन में शामिल है। इसके अलावा, cMYC लगभग 600 माइटोकॉन्ड्रियल जीनों की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए जाना जाता है जो माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिलेखन, अनुवाद और जटिल संयोजन में शामिल हैं, जिनमें NRF1 और TFAM41 शामिल हैं। NRF1 और TFAM माइटोसिस के दो केंद्रीय नियामक हैं, जो mtDNA प्रतिकृति को सक्रिय करने के लिए PGC-1α के अनुप्रवाह कार्य करते हैं। यह मार्ग cAMP और AMPK सिग्नलिंग द्वारा सक्रिय होता है और ऊर्जा व्यय और चयापचय तनाव के प्रति संवेदनशील होता है। हमने माइटोकॉन्ड्रियल जैवजनन के एक रेडॉक्स नियामक, NFE2L2 की भी जांच की, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या PPA के प्रभाव ऑक्सीडेटिव तनाव द्वारा मध्यस्थ हो सकते हैं।
यद्यपि NFE2L2 की अभिव्यक्ति अपरिवर्तित रही, हमने 3 mM और 5 mM PPA के साथ 24 घंटे के उपचार के बाद cMYC, NRF1 और TFAM की अभिव्यक्ति में लगातार खुराक-निर्भर कमी पाई (चित्र 3a-c)। cMYC अभिव्यक्ति का डाउनरेगुलेशन पहले माइटोकॉन्ड्रियल तनाव की प्रतिक्रिया के रूप में रिपोर्ट किया गया है42, और इसके विपरीत, cMYC अभिव्यक्ति का डाउनरेगुलेशन माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय, नेटवर्क कनेक्टिविटी और झिल्ली ध्रुवीकरण को रीमॉडल करके माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता का कारण बन सकता है43। दिलचस्प बात यह है कि cMYC माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन और संलयन के नियमन में भी शामिल है42,43 और कोशिका विभाजन के दौरान DRP1 फॉस्फोरिलेशन और माइटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण को बढ़ाने के लिए जाना जाता है44, साथ ही न्यूरोनल स्टेम कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल रूपात्मक रीमॉडलिंग में मध्यस्थता करता है45। वास्तव में, cMYC-कमी वाले फाइब्रोब्लास्ट कम माइटोकॉन्ड्रियल आकार प्रदर्शित करते हैं, जो PPA43 तनाव द्वारा प्रेरित परिवर्तनों के अनुरूप है। ये आंकड़े cMYC और माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता के बीच एक दिलचस्प लेकिन अभी तक अस्पष्ट संबंध को दर्शाते हैं, जो PPA तनाव-प्रेरित रीमॉडलिंग के भविष्य के अध्ययनों के लिए एक दिलचस्प लक्ष्य प्रदान करते हैं।
NRF1 और TFAM की कमी cMYC की एक महत्वपूर्ण ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर के रूप में भूमिका के अनुरूप है। ये आंकड़े मानव कोलोन कैंसर कोशिकाओं पर किए गए पिछले अध्ययनों के भी अनुरूप हैं, जिनमें दिखाया गया है कि PPA ने 22 घंटे में NRF1 mRNA अभिव्यक्ति को कम कर दिया, जो ATP की कमी और ROS46 में वृद्धि से संबंधित था। इन लेखकों ने यह भी बताया कि TFAM अभिव्यक्ति 8.5 घंटे में बढ़ गई, लेकिन 22 घंटे में अपने मूल स्तर पर वापस आ गई। इसके विपरीत, किम एट अल. (2019) ने दिखाया कि SH-SY5Y कोशिकाओं में PPA तनाव के 4 घंटे बाद TFAM mRNA अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय कमी आई; हालांकि, 72 घंटे के बाद, TFAM प्रोटीन अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय वृद्धि हुई और mtDNA कॉपी संख्या में भी उल्लेखनीय वृद्धि हुई। इस प्रकार, 24 घंटे के बाद हमने जो माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस जीन की संख्या में कमी देखी, वह इस संभावना को खारिज नहीं करती कि माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या में वृद्धि पहले के समय बिंदुओं पर बायोजेनेसिस की सक्रियता से संबंधित है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि पीपीए 4 घंटे 30 मिनट पर एसएच-एसवाई5वाई कोशिकाओं में पीजीसी-1α एमआरएनए और प्रोटीन को काफी हद तक बढ़ाता है, जबकि प्रोपियोनिक एसिड 12 घंटे 39 मिनट पर पीजीसी-1α के माध्यम से बछड़े के हेपेटोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस को बढ़ाता है। दिलचस्प बात यह है कि पीजीसी-1α न केवल एनआरएफ1 और टीएफएएम का प्रत्यक्ष ट्रांसक्रिप्शनल नियामक है, बल्कि विखंडन और संलयन को विनियमित करके एमएफएन2 और डीआरपी1 की गतिविधि को भी नियंत्रित करता है।47 कुल मिलाकर, यह पीपीए द्वारा प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल क्षतिपूर्ति प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने वाले तंत्रों के घनिष्ठ संबंध को उजागर करता है। इसके अलावा, हमारे डेटा पीपीए तनाव के तहत बायोजेनेसिस और चयापचय के ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के महत्वपूर्ण अव्यवस्था को दर्शाते हैं।
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 और DRP1 जीन माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन, संलयन और गतिशीलता के केंद्रीय नियामकों में से हैं37,48,49। माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता में कई अन्य जीन भी शामिल हैं, हालांकि, STOML2, OPA1 और MFN2 को पहले ASD समूहों में अलग-अलग मिथाइलेटेड पाया गया है,16 और कई स्वतंत्र अध्ययनों ने माइटोकॉन्ड्रियल तनाव के जवाब में इन प्रतिलेखन कारकों में परिवर्तन की सूचना दी है50,51। 52. 3 mM और 5 mM PPA उपचार द्वारा OPA1 और STOML2 दोनों की अभिव्यक्ति में उल्लेखनीय कमी आई (चित्र 3e, f)। OPA1, MFN1 और 2 के साथ प्रत्यक्ष अंतःक्रिया के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल संलयन के शास्त्रीय नियामकों में से एक है और क्रिस्टी रीमॉडेलिंग और माइटोकॉन्ड्रियल आकारिकी में भूमिका निभाता है53। माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता में STOML2 की सटीक भूमिका अभी भी स्पष्ट नहीं है, लेकिन साक्ष्य बताते हैं कि यह माइटोकॉन्ड्रियल संलयन, जैवजनन और माइटोफेजी में भूमिका निभाता है।
STOML2 माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन युग्मन और श्वसन श्रृंखला परिसरों के निर्माण को बनाए रखने में शामिल है54,55 और कैंसर कोशिकाओं की चयापचय विशेषताओं को गहराई से बदलने के लिए दिखाया गया है56। अध्ययनों से पता चला है कि STOML2, BAN और कार्डियोलिपिन के साथ परस्पर क्रिया के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और जैवजनन को बढ़ावा देता है55, 57, 58। इसके अतिरिक्त, स्वतंत्र अध्ययनों से पता चला है कि STOML2 और PINK1 के बीच परस्पर क्रिया माइटोफेजी को नियंत्रित करती है59,60। विशेष रूप से, STOML2 को MFN2 के साथ सीधे बातचीत करने और उसे स्थिर करने के लिए रिपोर्ट किया गया है और यह OPA1 क्षरण के लिए जिम्मेदार प्रोटीएज़ को रोककर लंबे OPA1 आइसोफॉर्म को स्थिर करने में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है53,61,62। PPA प्रतिक्रियाओं में देखी गई STOML2 अभिव्यक्ति में कमी इन संलयन प्रोटीनों को यूबिक्विटिन- और प्रोटीसोम-निर्भर मार्गों के माध्यम से क्षरण के प्रति अधिक संवेदनशील बना सकती है48। हालांकि पीपीए के प्रति गतिशील प्रतिक्रिया में एसटीओएमएल2 और ओपीए1 की सटीक भूमिका स्पष्ट नहीं है, इन संलयन जीनों की घटी हुई अभिव्यक्ति (चित्र 3) विखंडन और संलयन के बीच संतुलन को बिगाड़ सकती है और माइटोकॉन्ड्रियल आकार में कमी ला सकती है (चित्र 3)। 1)।
दूसरी ओर, OPA1 प्रोटीन की अभिव्यक्ति 24 घंटे बाद भी अपरिवर्तित रही, जबकि PPA उपचार के बाद MFN1, MFN2 या DRP1 के mRNA और प्रोटीन स्तरों में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ (चित्र 3g-i, चित्र 4)। इससे यह संकेत मिलता है कि माइटोकॉन्ड्रियल संलयन और विखंडन में शामिल इन कारकों के नियमन में कोई परिवर्तन नहीं हुआ है। हालांकि, यह ध्यान देने योग्य है कि इन चारों जीनों में से प्रत्येक पोस्टट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों (PTMs) द्वारा भी विनियमित होता है जो प्रोटीन गतिविधि को नियंत्रित करते हैं। OPA1 के आठ वैकल्पिक स्प्लिस वेरिएंट हैं जो माइटोकॉन्ड्रिया में प्रोटियोलाइटिक रूप से विखंडित होकर दो अलग-अलग आइसोफॉर्म बनाते हैं। लंबे और छोटे आइसोफॉर्म के बीच संतुलन अंततः माइटोकॉन्ड्रियल संलयन और माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के रखरखाव में OPA1 की भूमिका निर्धारित करता है। DRP1 की गतिविधि कैल्शियम/कैल्मोडुलिन-निर्भर प्रोटीन काइनेज II (CaMKII) फॉस्फोरिलेशन द्वारा नियंत्रित होती है, जबकि DRP1 का अपघटन यूबिक्विटिनेशन और SUMOylation65 द्वारा नियंत्रित होता है। अंततः, DRP1 और MFN1/2 दोनों GTPases हैं, इसलिए इनकी गतिविधि माइटोकॉन्ड्रिया में GTP उत्पादन की दर से प्रभावित हो सकती है66। अतः, यद्यपि इन प्रोटीनों की अभिव्यक्ति स्थिर रहती है, यह प्रोटीन गतिविधि या स्थान में कोई परिवर्तन नहीं दर्शाती है67,68। वास्तव में, मौजूदा PTM प्रोटीन भंडार अक्सर तीव्र तनाव प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए जिम्मेदार रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करते हैं। हमारे मॉडल में मध्यम चयापचय तनाव की उपस्थिति में, यह संभावना है कि PTM संलयन और विखंडन प्रोटीनों की बढ़ी हुई गतिविधि को बढ़ावा देता है ताकि mRNA या प्रोटीन स्तर पर इन जीनों के अतिरिक्त सक्रियण की आवश्यकता के बिना माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता को पर्याप्त रूप से बहाल किया जा सके।
कुल मिलाकर, उपरोक्त आंकड़े माइटोकॉन्ड्रियल आकारिकी के जटिल और समय-निर्भर नियमन और इन तंत्रों को स्पष्ट करने की चुनौतियों को उजागर करते हैं। जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, सबसे पहले मार्ग में विशिष्ट लक्ष्य जीनों की पहचान करना आवश्यक है। हालांकि, हमारे आंकड़े दर्शाते हैं कि एक ही मार्ग में जीन एक ही तनाव के प्रति एक ही तरह से प्रतिक्रिया नहीं करते हैं। वास्तव में, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एक ही मार्ग में विभिन्न जीन अलग-अलग अस्थायी प्रतिक्रिया प्रोफाइल प्रदर्शित कर सकते हैं30,46। इसके अलावा, जटिल पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र हैं जो ट्रांसक्रिप्शन और जीन कार्य के बीच संबंध को बाधित करते हैं। प्रोटिओमिक अध्ययन पीटीएम और प्रोटीन कार्य के प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, लेकिन वे कम-थ्रूपुट विधियों, उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात और खराब रिज़ॉल्यूशन सहित चुनौतियां भी प्रस्तुत करते हैं।
इस संदर्भ में, टीईएम और एमईएल का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी का अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता और कार्य के बीच संबंध और यह रोग को कैसे प्रभावित करता है, जैसे मूलभूत प्रश्नों को संबोधित करने की अपार क्षमता रखता है। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि टीईएम माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन और गतिशीलता के अभिसारी अंतिम बिंदु के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल मॉर्फोलॉजी को मापने की एक प्रत्यक्ष विधि प्रदान करता है51। एमईएल भी त्रि-आयामी कोशिकीय वातावरण में विखंडन और संलयन घटनाओं को देखने की एक प्रत्यक्ष विधि प्रदान करता है, जिससे जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की अनुपस्थिति में भी गतिशील माइटोकॉन्ड्रियल रीमॉडलिंग का मात्रात्मक विश्लेषण संभव हो पाता है33। यहां हम द्वितीयक माइटोकॉन्ड्रियल रोगों में माइटोकॉन्ड्रियल इमेजिंग तकनीकों की उपयोगिता पर प्रकाश डालते हैं। इन रोगों की विशेषता आमतौर पर तीव्र माइटोकॉन्ड्रियल क्षति के बजाय माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के सूक्ष्म रीमॉडलिंग द्वारा चिह्नित दीर्घकालिक हल्के चयापचय तनाव से होती है। हालांकि, दीर्घकालिक तनाव के तहत माइटोसिस को बनाए रखने के लिए आवश्यक माइटोकॉन्ड्रियल क्षतिपूर्ति के गहन कार्यात्मक परिणाम होते हैं। तंत्रिका विज्ञान के संदर्भ में, इन क्षतिपूर्ति तंत्रों की बेहतर समझ माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जुड़े बहुआयामी न्यूरोपैथोलॉजी के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकती है।
अंततः, हमारे डेटा न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता को नियंत्रित करने वाले जीन अभिव्यक्ति, प्रोटीन संशोधनों और प्रोटीन गतिविधि के बीच जटिल अंतःक्रियाओं के कार्यात्मक परिणामों को समझने के लिए इमेजिंग तकनीकों की उपयोगिता को उजागर करते हैं। हमने ASD के माइटोकॉन्ड्रियल घटक की जानकारी प्राप्त करने के लिए न्यूरोनल सेल मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता का मॉडल बनाने के लिए PPA का उपयोग किया। PPA से उपचारित SH-SY5Y कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल आकारिकी में परिवर्तन देखे गए: माइटोकॉन्ड्रिया छोटे और गोल हो गए, और TEM द्वारा देखने पर क्रिस्टी अस्पष्ट रूप से परिभाषित थे। MEL विश्लेषण से पता चलता है कि ये परिवर्तन हल्के चयापचय तनाव के जवाब में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को बनाए रखने के लिए विखंडन और संलयन घटनाओं में वृद्धि के साथ-साथ होते हैं। इसके अलावा, PPA माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय और समस्थिति के प्रतिलेखन विनियमन को महत्वपूर्ण रूप से बाधित करता है। हमने cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 और OPA1 को प्रमुख माइटोकॉन्ड्रियल नियामकों के रूप में पहचाना जो PPA तनाव से बाधित होते हैं और माइटोकॉन्ड्रियल आकारिकी और कार्य में PPA-प्रेरित परिवर्तनों को मध्यस्थ करने में भूमिका निभा सकते हैं। पीपीए-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन गतिविधि, स्थान निर्धारण और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में अस्थायी परिवर्तनों को बेहतर ढंग से समझने के लिए भविष्य में और अध्ययन की आवश्यकता है। हमारे डेटा माइटोकॉन्ड्रियल तनाव प्रतिक्रिया को नियंत्रित करने वाले नियामक तंत्रों की जटिलता और परस्पर निर्भरता को उजागर करते हैं और अधिक लक्षित क्रियाविधि संबंधी अध्ययनों के लिए टीईएम और अन्य इमेजिंग तकनीकों की उपयोगिता को प्रदर्शित करते हैं।
SH-SY5Y सेल लाइन (ECACC, 94030304-1VL) सिग्मा-एल्ड्रिच से खरीदी गई थी। SH-SY5Y कोशिकाओं को 25 cm² के फ्लास्क में डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम/F-12 पोषक मिश्रण (DMEM/F-12) और L-ग्लूटामाइन (SC09411, ScienCell) में 20% भ्रूण बोवाइन सीरम (FBS) (10493106, थर्मोफिशर साइंटिफिक) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (P4333-20ML, सिग्मा-एल्ड्रिच) मिलाकर 37°C तापमान और 5% CO₂ पर विकसित किया गया था। कोशिकाओं को 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (15400054, थर्मोफिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके 80% सघनता तक उपसंवर्धित किया गया, 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया और लगभग 7 × 10⁵ कोशिकाओं/मिलीलीटर के घनत्व पर प्लेट किया गया। सभी प्रयोग 19-22 पैसेज के बीच अविभेदित SH-SY5Y कोशिकाओं पर किए गए। पीपीए को NaP के रूप में दिया जाता है। NaP पाउडर (CAS संख्या 137-40-6, रासायनिक सूत्र C₃H₅NaO₂, P5436-100G, सिग्मा-एल्ड्रिच) को गर्म मिलीक्यू पानी में 1 M सांद्रता तक घोलें और 4 °C पर संग्रहित करें। उपचार के दिन, इस घोल को 1 M पीपीए के साथ सीरम-मुक्त माध्यम (एल-ग्लूटामाइन के साथ DMEM/F-12) में 3 mM और 5 mM पीपीए तक पतला करें। सभी प्रयोगों के लिए उपचार सांद्रता पीपीए की अनुपस्थिति (0 mM, नियंत्रण), 3 mM और 5 mM पीपीए थी। प्रयोग कम से कम तीन जैविक प्रतिकृतियों में किए गए।
SH-SY5Y कोशिकाओं को 25 cm⁻³ के फ्लास्क में 5.5 × 10⁵ कोशिकाएँ/ml की दर से बोया गया और 24 घंटे तक उगाया गया। PPA उपचार को 24 घंटे के इनक्यूबेशन से पहले फ्लास्क में डाला गया। सामान्य स्तनधारी ऊतक सबकल्चर प्रोटोकॉल (ऊपर वर्णित) का पालन करते हुए कोशिका पेलेट्स एकत्र किए गए। कोशिका पेलेट को 100 µl 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड, 1× PBS में घोलें और प्रसंस्करण तक 4 °C पर संग्रहित करें। SH-SY5Y कोशिकाओं को संक्षिप्त रूप से सेंट्रीफ्यूज किया गया ताकि कोशिकाएँ पेलेट हो जाएँ और 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड, 1× PBS घोल निकल जाए। अवक्षेप को आसुत जल में तैयार किए गए 4% एगारोज जेल में घोलें (एगारोज और अवक्षेप की मात्रा का अनुपात 1:1 है)। एगारोज के टुकड़ों को समतल प्लेटों पर ग्रिड पर रखा गया और उच्च दाब वाले हिमांक से पहले 1-हेक्साडेसीन से लेपित किया गया। नमूनों को 100% शुष्क एसीटोन में -90°C पर 24 घंटे के लिए जमाया गया। इसके बाद तापमान को -80°C तक बढ़ाया गया और 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड और 0.1% ग्लूटाराल्डिहाइड का घोल मिलाया गया। नमूनों को -80°C पर 24 घंटे के लिए रखा गया। इसके बाद, तापमान को कई दिनों में धीरे-धीरे कमरे के तापमान तक बढ़ाया गया: -80°C से -50°C तक 24 घंटे के लिए, -30°C तक 24 घंटे के लिए, -10°C तक 24 घंटे के लिए और अंत में कमरे के तापमान तक।
क्रायोजेनिक तैयारी के बाद, नमूनों को रेज़िन से संतृप्त किया गया और लीका रीचर्ट अल्ट्राकटएस अल्ट्रामाइक्रोटोम (लीका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग करके अतिपतली परतें (लगभग 100 एनएम) बनाई गईं। इन परतों को 2% यूरेनिल एसीटेट और लेड साइट्रेट से रंगा गया। नमूनों का अवलोकन 200 केवी (लैब6 ट्रांसमीटर) पर संचालित एफईआई टेक्नाई 20 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (थर्मोफिशर (पूर्व में एफईआई), आइंडहोवन, नीदरलैंड) और ट्रिडियम ऊर्जा फिल्टर से सुसज्जित गैटन सीसीडी कैमरा (गैटन, यूके) का उपयोग करके किया गया।
प्रत्येक तकनीकी प्रतिकृति में, कम से कम 24 एकल कोशिका छवियां प्राप्त की गईं, कुल मिलाकर 266 छवियां। सभी छवियों का विश्लेषण रीजन ऑफ इंटरेस्ट (आरओआई) मैक्रो और माइटोकॉन्ड्रिया मैक्रो का उपयोग करके किया गया। माइटोकॉन्ड्रिया मैक्रो प्रकाशित विधियों17,31,32 पर आधारित है और फिजी/इमेजजे69 में टीईएम छवियों के अर्ध-स्वचालित बैच प्रसंस्करण की अनुमति देता है। संक्षेप में: छवि को रोलिंग बॉल बैकग्राउंड सबट्रैक्शन (60 पिक्सेल त्रिज्या) और एफएफटी बैंडपास फ़िल्टर (क्रमशः 60 और 8 पिक्सेल ऊपरी और निचली सीमाओं का उपयोग करके) और 5% की अभिविन्यास सहनशीलता के साथ ऊर्ध्वाधर रेखा दमन का उपयोग करके उलटा और सीधा किया जाता है। संसाधित छवि को अधिकतम एन्ट्रॉपी एल्गोरिदम का उपयोग करके स्वचालित रूप से थ्रेशोल्ड किया जाता है और एक बाइनरी मास्क उत्पन्न किया जाता है। कच्ची टीईएम छवियों में मैन्युअल रूप से चयनित आरओआई से जुड़े छवि क्षेत्रों को निकाला गया, जो माइटोकॉन्ड्रिया की विशेषता बताते हैं और प्लाज्मा झिल्ली और अन्य उच्च-कंट्रास्ट क्षेत्रों को बाहर करते हैं। प्रत्येक निकाले गए ROI के लिए, 600 पिक्सेल से बड़े बाइनरी कणों का विश्लेषण किया गया, और कण क्षेत्र, परिधि, प्रमुख और गौण अक्ष, फेरेट व्यास, गोलाई और वृत्ताकारता को Fiji/ImageJ के अंतर्निहित मापन कार्यों का उपयोग करके मापा गया। मेरिल, फ़्लिपो और स्ट्रैक (2017) के अनुसार, इन आंकड़ों से क्षेत्रफल 2, कण पहलू अनुपात (प्रमुख से गौण अक्ष अनुपात) और आकार कारक (FF) की गणना की गई, जहाँ FF = परिधि 2/4pi x क्षेत्रफल है। पैरामीट्रिक सूत्र की परिभाषा मेरिल, फ़्लिपो और स्ट्रैक (2017) में पाई जा सकती है। उल्लिखित मैक्रो GitHub पर उपलब्ध हैं (डेटा उपलब्धता विवरण देखें)। औसतन, प्रति PPA उपचार लगभग 5,600 कणों का विश्लेषण किया गया, कुल मिलाकर लगभग 17,000 कणों का विश्लेषण किया गया (डेटा प्रदर्शित नहीं किया गया है)।
SH-SH5Y कोशिकाओं को 8-चैम्बर कल्चर डिश (थर्मोफिशर, #155411) में रात भर के लिए रखा गया ताकि वे चिपक सकें, और फिर उन्हें TMRE 1:1000 (थर्मोफिशर, #T669) और Hoechst 33342 1:200 (सिग्मा-एल्ड्रिच, H6024) के साथ इनक्यूबेट किया गया। 405 nm और 561 nm लेजर का उपयोग करके 10 मिनट के वातावरण में छवियां प्राप्त की गईं, और कच्ची छवियों को 12 क्रमिक समय बिंदुओं पर छवि फ्रेम के बीच 0.2 μm के az चरण के साथ 10 छवि माइक्रोग्राफ वाले z-स्टैक के रूप में प्राप्त किया गया। छवियों को कार्ल ज़ीस LSM780 ELYRA PS.1 सुपर-रिज़ॉल्यूशन प्लेटफॉर्म (कार्ल ज़ीस, ओबेरकोचेन, जर्मनी) का उपयोग करके LCI प्लान एपोक्रोमेट 100x/1.4 ऑयल DIC M27 लेंस के साथ एकत्र किया गया। संलयन और विखंडन घटनाओं, माइटोकॉन्ड्रियल संरचनाओं की औसत संख्या और प्रति कोशिका औसत माइटोकॉन्ड्रियल आयतन को मापने के लिए इमेजजे में पूर्व वर्णित पाइपलाइन और इमेजजे प्लगइन का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण किया गया था।33 एमईएल मैक्रोज़ गिटहब पर उपलब्ध हैं (डेटा उपलब्धता विवरण देखें)।
SH-SY5Y कोशिकाओं को उपचार से पहले 24 घंटे के लिए 0.3 × 10⁶ कोशिकाओं/मिलीलीटर के घनत्व पर छह-वेल प्लेटों में उगाया गया। RNA को Quick-RNA™ Miniprep प्रोटोकॉल (ZR R1055, Zymo Research) का उपयोग करके निकाला गया, जिसमें कुछ मामूली संशोधन किए गए: निकालने से पहले प्रत्येक वेल में 300 μl RNA लाइसिस बफर मिलाया गया और अंतिम चरण में प्रत्येक नमूने को 30 μl DNase/RNase इल्यूशन-मुक्त पानी से लाइसिस किया गया। सभी नमूनों की मात्रा और गुणवत्ता की जाँच NanoDrop ND-1000 UV-Vis स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके की गई। सेल लाइसैट से कुल प्रोटीन 200 μl RIPA लाइसिस बफर का उपयोग करके प्राप्त किया गया, और प्रोटीन सांद्रता को ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख70 का उपयोग करके निर्धारित किया गया।
कुछ संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए टेट्रो™ सीडीएनए संश्लेषण किट (BIO-65043, मेरिडियन बायोसाइंस) का उपयोग करके सीडीएनए संश्लेषण किया गया। 0.7 से 1 माइक्रोग्राम कुल आरएनए का उपयोग करके 20 माइक्रोलीटर अभिक्रियाओं में सीडीएनए का संश्लेषण किया गया। प्राइमर पूर्व प्रकाशित शोध पत्रों 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (तालिका S1) से चुने गए थे और संबंधित प्रोब इंटीग्रेटेड डीएनए टेक्नोलॉजीज के प्राइमरक्वेस्ट टूल का उपयोग करके डिजाइन किए गए थे। रुचि के सभी जीनों को नाभिकीय B2M जीन के सापेक्ष सामान्यीकृत किया गया था। STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC और OPA1 की जीन अभिव्यक्ति को RT-qPCR द्वारा मापा गया। मास्टर मिक्स में लूना टैग पॉलीमरेज़ (M3003L, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स), 10 μM फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर, सीडीएनए और पीसीआर-ग्रेड पानी शामिल थे, जिससे प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए अंतिम आयतन 10 μL प्राप्त हुआ। विभाजन और विखंडन जीन (DRP1, MFN1/2) की अभिव्यक्ति को टैकमैन मल्टीप्लेक्स एसेज़ का उपयोग करके मापा गया। लूना यूनिवर्सल प्रोब qPCR मास्टर मिक्स (M3004S, न्यू इंग्लैंड बायोलैब्स) का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार कुछ मामूली संशोधनों के साथ किया गया। मल्टीप्लेक्स RT-qPCR मास्टर मिक्स में 1X लूना टैग पॉलीमरेज़, 10 μM फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर, 10 μM प्रोब, सीडीएनए और पीसीआर-ग्रेड पानी शामिल हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए अंतिम आयतन 20 μL प्राप्त हुआ। RT-qPCR को रोटर-जीन Q 6-प्लेक्स (QIAGEN RG—क्रम संख्या: R0618110) का उपयोग करके किया गया। साइक्लिंग की स्थितियाँ तालिका S1 में दर्शाई गई हैं। सभी cDNA नमूनों को तीन बार प्रवर्धित किया गया और दस गुना तनुकरण की एक श्रृंखला का उपयोग करके एक मानक वक्र तैयार किया गया। डेटा की पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए, चक्र थ्रेशोल्ड मानक विचलन (Ct) >0.5 वाले तीन नमूनों में से आउटलायर्स को विश्लेषण से हटा दिया गया।30,72 सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की गणना 2-ΔΔCt79 विधि का उपयोग करके की गई।
प्रोटीन के नमूनों (60 μg) को लैमली लोडिंग बफर के साथ 2:1 के अनुपात में मिलाया गया और 12% रंगहीन प्रोटीन जेल (बायो-रैड #1610184) पर चलाया गया। प्रोटीन को ट्रांस-ब्लॉट टर्बो सिस्टम (#170-4155, बायो-रैड) का उपयोग करके PVDF (पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड) झिल्ली (#170-84156, बायो-रैड) पर स्थानांतरित किया गया। झिल्ली को ब्लॉक किया गया और उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी (OPA1, MFN1, MFN2, और DRP1) (1:1000 के अनुपात में तनुकृत) के साथ 48 घंटे तक इनक्यूबेट किया गया, इसके बाद द्वितीयक एंटीबॉडी (1:10,000 के अनुपात में) के साथ 1 घंटे तक इनक्यूबेट किया गया। फिर झिल्लियों को क्लैरिटी वेस्टर्न ECL सबस्ट्रेट (#170-5061, बायो-रैड) का उपयोग करके इमेज किया गया और बायो-रैड केमिडॉक MP सिस्टम का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया। वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लिए ImageLab संस्करण 6.1 का उपयोग किया गया था। मूल जेल और ब्लॉट चित्र S1 में दिखाए गए हैं। एंटीबॉडी संबंधी जानकारी तालिका S2 में दी गई है।
डेटा सेट को कम से कम तीन स्वतंत्र नमूनों के माध्य और माध्य की मानक त्रुटि (SEM) के रूप में प्रस्तुत किया गया है। गॉसियन वितरण और समान मानक विचलन मानकर विश्लेषण शुरू करने से पहले, शापिरो-विल्क्स परीक्षण का उपयोग करके डेटा सेट की सामान्यता का परीक्षण किया गया (जब तक कि अन्यथा न कहा गया हो)। इसके अतिरिक्त, सार्थकता निर्धारित करने के लिए फिशर के MEL LSD (p < 0.05), एक-तरफ़ा ANOVA (उपचार बनाम नियंत्रण माध्य), और डनेट के बहु-तुलना परीक्षण (p < 0.05) का उपयोग करके डेटा सेट का विश्लेषण किया गया। सार्थक p मानों को ग्राफ़ में *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 के रूप में दर्शाया गया है। सभी सांख्यिकीय विश्लेषण और ग्राफ़ GraphPad Prism 9.4.0 का उपयोग करके किए गए और तैयार किए गए।
TEM इमेज विश्लेषण के लिए Fiji/ImageJ मैक्रो GitHub पर सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro। माइटोकॉन्ड्रियल इवेंट लोकेटर (MEL) मैक्रो GitHub पर सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin।
मेलियाना ए., देवी एनएम और विजया ए. माइटोकॉन्ड्रिया: चयापचय, होमियोस्टेसिस, तनाव, उम्र बढ़ने और एपिजेनेटिक्स के मास्टर नियामक। इंडोनेशियाई। बायोमेडिकल साइंस। जे. 13, 221–241 (2021)।
बेन-शाचर, डी. सिज़ोफ्रेनिया में बहुआयामी माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता, कॉम्प्लेक्स I एक संभावित पैथोलॉजिकल लक्ष्य के रूप में। सिज़ोफ्रेनिया। संसाधन। 187, 3–10 (2017)।
बोस, ए. और बील, एम.एफ. पार्किंसंस रोग में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता। जे. न्यूरोकेमिस्ट्री। 139, 216–231 (2016)।
शर्मा वी.के., सिंह टी.जी. और मेहता वी. तनावग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया: अल्जाइमर रोग में आक्रमण के लक्ष्य। माइटोकॉन्ड्रिया 59, 48–57 (2021)।
बेलेंग्वेर पी., डुआर्टे जे.एम.एन., शूक पी.एफ. और फेरेरा जी.के. माइटोकॉन्ड्रिया और मस्तिष्क: जैवऊर्जा और अधिक। न्यूरोटॉक्सिन। संसाधन। 36, 219–238 (2019)।
रंगाराजू, वी. एट अल. प्लीओट्रोपिक माइटोकॉन्ड्रिया: न्यूरोनल विकास और रोग पर माइटोकॉन्ड्रिया का प्रभाव। जे. न्यूरोसाइंस. 39, 8200–8208 (2019).
कार्डानो-रामोस, सी. और मोराइस, वी.ए. न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस: कैसे और कहाँ। अंतर्राष्ट्रीयता। जे. मोह्र. विज्ञान। 22, 13059 (2021)।
यू, आर., लेंडाहल, यू., निस्टर, एम. और झाओ, जे. स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता का विनियमन: अवसर और चुनौतियाँ। फ्रंट. एंडोक्राइन. (लॉज़ेन) 11, 374 (2020)।
खाचो, एम. और स्लैक, आर.एस. न्यूरोजेनेसिस के विनियमन में माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता: विकासशील से वयस्क मस्तिष्क तक। विकास। गतिशील। 247, 47–53 (2018)।