वर्तमान पता: कोलोन 50931, जर्मनी, कोलोन एक्सीलेंस क्लस्टर रिसर्च ऑन सेलुलर स्ट्रेस रिस्पांस इन एजिंग-रिलेटेड डिजीज (CECAD)।
माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के कारण होने वाले न्यूरोडीजेनरेशन को अपरिवर्तनीय माना जाता है क्योंकि न्यूरॉन्स की मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी सीमित होती है, लेकिन शरीर में न्यूरोनल मेटाबोलिज्म की सेल ऑटोनॉमी पर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के प्रभाव को अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है। यहाँ, हम माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन डायनामिक्स में गड़बड़ी के कारण प्रगतिशील OXPHOS की कमी वाले पुरकिंजे न्यूरॉन्स के सेल-विशिष्ट प्रोटीओम का परिचय देते हैं। हमने पाया कि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन ने प्रोटीओमिक्स के क्षेत्र में एक गहरा बदलाव लाया, जिसके परिणामस्वरूप अंततः कोशिका मृत्यु से पहले सटीक मेटाबोलिक प्रोग्रामों का क्रमिक सक्रियण हुआ। अप्रत्याशित रूप से, हमने पाइरुवेट कार्बोक्सिलेज (PCx) और अन्य एंटी-एजिंग एंजाइमों के स्पष्ट प्रेरण का पता लगाया जो TCA चक्र के मध्यवर्ती पदार्थों की पूर्ति करते हैं। PCx के अवरोध ने ऑक्सीडेटिव तनाव और न्यूरोडीजेनरेशन को बढ़ा दिया, जिससे पता चलता है कि एथेरोस्क्लेरोसिस OXPHOS की कमी वाले न्यूरॉन्स में सुरक्षात्मक प्रभाव डालता है। टर्मिनली डीजेनरेटेड न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन की बहाली इन मेटाबोलिक विशेषताओं को पूरी तरह से उलट देती है, जिससे कोशिका मृत्यु को रोका जा सकता है। हमारे निष्कर्षों से उन पूर्व अज्ञात मार्गों की पहचान होती है जो माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के प्रति लचीलापन प्रदान करते हैं और यह दर्शाते हैं कि रोग के अंतिम चरणों में भी न्यूरोडीजेनरेशन को उलटा जा सकता है।
तंत्रिका ऊर्जा चयापचय को बनाए रखने में माइटोकॉन्ड्रिया की केंद्रीय भूमिका मानव माइटोकॉन्ड्रियल रोगों से जुड़े व्यापक तंत्रिका संबंधी लक्षणों द्वारा रेखांकित की जाती है। इनमें से अधिकांश रोग माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले जीन उत्परिवर्तन (1, 2) या माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता से संबंधित जीन विनाश के कारण होते हैं, जो अप्रत्यक्ष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) की स्थिरता को प्रभावित करते हैं (3, 4)। पशु मॉडलों में किए गए अध्ययनों से पता चला है कि आसपास के ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता की प्रतिक्रिया में, रूढ़िवादी चयापचय मार्ग (5-7) सक्रिय हो सकते हैं, जो इन जटिल रोगों के रोगजनन की गहन समझ के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं। इसके विपरीत, मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रियल एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पादन की सामान्य विफलता के कारण विशिष्ट कोशिका प्रकारों में होने वाले चयापचय परिवर्तनों की हमारी समझ मौलिक है (8), जो रोग की रोकथाम या न्यूरोडीजेनरेशन को रोकने के लिए उपयोग किए जा सकने वाले चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने की आवश्यकता पर बल देती है (9)। जानकारी की कमी इस तथ्य में निहित है कि तंत्रिका कोशिकाओं को आसपास के ऊतकों की कोशिकाओं की तुलना में बहुत सीमित चयापचय लचीलापन वाला माना जाता है (10)। यह देखते हुए कि ये कोशिकाएं सिनैप्टिक संचरण को बढ़ावा देने और चोट और रोग की स्थितियों पर प्रतिक्रिया करने के लिए न्यूरॉन्स को मेटाबोलाइट्स की आपूर्ति के समन्वय में केंद्रीय भूमिका निभाती हैं, मस्तिष्क ऊतक की चुनौतीपूर्ण स्थितियों के अनुकूल कोशिका चयापचय की क्षमता लगभग केवल ग्लियल कोशिकाओं तक ही सीमित है (11-14)। इसके अलावा, मस्तिष्क ऊतक की अंतर्निहित कोशिकीय विषमता विशिष्ट न्यूरोनल उपसमूहों में होने वाले चयापचय परिवर्तनों के अध्ययन में काफी बाधा डालती है। परिणामस्वरूप, न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के सटीक कोशिकीय और चयापचय परिणामों के बारे में बहुत कम जानकारी है।
माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के चयापचय संबंधी परिणामों को समझने के लिए, हमने माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली संलयन (Mfn2) के विनाश के कारण होने वाले न्यूरोडीजेनरेशन के विभिन्न चरणों में पुरकिंजे न्यूरॉन्स (PNs) को पृथक किया। हालाँकि मनुष्यों में Mfn2 उत्परिवर्तन चारकोट-मैरी-टूथ टाइप 2A (15) के रूप में जानी जाने वाली वंशानुगत मोटर संवेदी न्यूरोपैथी के एक रूप से जुड़ा है, चूहों में Mfn2 का सशर्त विनाश ऑक्सीकरण-फॉस्फोरिलेशन (OXPHOS) शिथिलता को प्रेरित करने की एक सुस्थापित विधि है। विभिन्न न्यूरोनल उपप्रकार (16-19) और परिणामस्वरूप न्यूरोडीजेनरेटिव फेनोटाइप प्रगतिशील न्यूरोलॉजिकल लक्षणों के साथ होते हैं, जैसे कि गति विकार (18, 19) या सेरेबेलर एटैक्सिया (16)। लेबल-मुक्त मात्रात्मक (LFQ) प्रोटीओमिक्स, मेटाबोलॉमिक्स, इमेजिंग और वायरोलॉजिकल विधियों के संयोजन का उपयोग करके, हमने दिखाया कि प्रगतिशील न्यूरोडीजेनरेशन, पाइरुवेट कार्बोक्सिलेज (PCx) और अन्य कारकों को दृढ़ता से प्रेरित करता है जो जीवित कोशिकाओं में आर्टेरियोस्क्लेरोसिस में शामिल एंजाइमों की अभिव्यक्ति को प्रभावित करते हैं। इस निष्कर्ष की प्रासंगिकता को सत्यापित करने के लिए, हमने विशेष रूप से Mfn2-कमी वाली कोशिकाओं में PCx की अभिव्यक्ति को कम किया, और पाया कि इस प्रक्रिया ने ऑक्सीडेटिव तनाव को बढ़ा दिया और न्यूरोडीजेनरेशन को तेज कर दिया, इस प्रकार यह सिद्ध हुआ कि एज़ोस्पर्मिया कोशिका मृत्यु के लिए चयापचय अनुकूलन क्षमता प्रदान करता है। MFN2 की तीव्र अभिव्यक्ति गंभीर ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरस (OXPHOS) की कमी, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की भारी खपत और स्पष्ट रूप से टूटे हुए माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क वाली टर्मिनल डीजेनरेशन कोशिकाओं को पूरी तरह से ठीक कर सकती है, जो इस बात पर और जोर देती है कि न्यूरोडीजेनरेशन का यह रूप कोशिका मृत्यु से पहले रोग की उन्नत अवस्था में भी ठीक हो सकता है।
Mfn2 नॉकआउट PN में माइटोकॉन्ड्रिया को देखने के लिए, हमने एक ऐसे चूहे की नस्ल का उपयोग किया जो Cre-निर्भर माइटोकॉन्ड्रिया को पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) (mtYFP) (20) Cre अभिव्यक्ति को लक्षित करने की अनुमति देता है और हमने जीवित अवस्था में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान की जाँच की। हमने पाया कि PN में Mfn2 जीन के नष्ट होने से माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का धीरे-धीरे विभाजन होता है (चित्र S1A), और सबसे पहला परिवर्तन 3 सप्ताह की आयु में देखा गया। इसके विपरीत, कैलबिंडिन इम्यूनोस्टेनिंग के नुकसान से स्पष्ट PN कोशिका परत का पर्याप्त क्षरण 12 सप्ताह की आयु तक शुरू नहीं हुआ (चित्र 1, A और B)। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान में सबसे पहले परिवर्तनों और तंत्रिका कोशिका मृत्यु की प्रत्यक्ष शुरुआत के बीच समय के अंतर ने हमें कोशिका मृत्यु से पहले माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता द्वारा उत्पन्न चयापचय परिवर्तनों की जाँच करने के लिए प्रेरित किया। हमने YFP (YFP+)-व्यक्त करने वाले PN (चित्र 1C) और नियंत्रण चूहों (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP :: L7-cre), जिन्हें आगे CTRL कहा गया है (चित्र S1B), को अलग करने के लिए एक फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) आधारित रणनीति विकसित की। YFP सिग्नल की सापेक्ष तीव्रता के आधार पर गेटिंग रणनीति के अनुकूलन से हमें PN के YFP+ बॉडी (YFPhigh) को गैर-PN (YFPneg) (चित्र S1B) या संभावित फ्लोरोसेंट एक्सॉन/डेन्ड्रिटिक टुकड़ों (YFPlow; चित्र S1D, बाएँ) से शुद्ध करने की अनुमति मिलती है, जिसकी पुष्टि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्र S1D, दाएँ) द्वारा की गई। वर्गीकृत आबादी की पहचान सत्यापित करने के लिए, हमने LFQ प्रोटीओमिक्स और फिर प्रिंसिपल कंपोनेंट विश्लेषण किया, और पाया कि YFPhigh और YFPneg कोशिकाओं के बीच स्पष्ट अलगाव है (चित्र S1C)। YFPhigh कोशिकाओं में ज्ञात PN मार्करों (अर्थात Calb1, Pcp2, Grid2 और Itpr3) का शुद्ध संवर्धन देखा गया (21, 22), लेकिन न्यूरॉन्स या अन्य प्रकार की कोशिकाओं में सामान्य रूप से व्यक्त होने वाले प्रोटीनों का कोई संवर्धन नहीं देखा गया (चित्र 1D)। स्वतंत्र प्रयोगों में एकत्रित वर्गीकृत YFPhigh कोशिकाओं के नमूनों के बीच तुलना करने पर सहसंबंध गुणांक > 0.9 पाया गया, जो जैविक प्रतिकृतियों के बीच अच्छी पुनरुत्पादकता दर्शाता है (चित्र S1E)। संक्षेप में, इन आंकड़ों ने व्यवहार्य PN के तीव्र और विशिष्ट अलगाव की हमारी योजना को मान्य किया। क्योंकि उपयोग की गई L7-cre ड्राइवर प्रणाली प्रसव के बाद पहले सप्ताह में मोज़ेक पुनर्संयोजन को प्रेरित करती है (23), हमने CTRL और सशर्त (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) न्यूरॉन्स से चूहों को छांटना शुरू किया। पुनर्संयोजन पूरा होने के बाद, इसे 4 सप्ताह की आयु में Mfn2cKO कहा जाता है। अंतिम बिंदु के रूप में, हमने 8 सप्ताह की आयु को चुना, जब स्पष्ट माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन के बावजूद पीएन परत बरकरार थी (चित्र 1बी और चित्र एस1ए)। कुल मिलाकर, हमने 3013 प्रोटीनों की मात्रा निर्धारित की, जिनमें से लगभग 22% माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीओम पर आधारित माइटोकार्टा 2.0 एनोटेशन पर आधारित थे (चित्र 1ई) (24)। 8वें सप्ताह में किए गए विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला कि सभी प्रोटीनों में से केवल 10.5% में महत्वपूर्ण परिवर्तन हुए थे (चित्र 1एफ और चित्र एस1एफ), जिनमें से 195 प्रोटीन डाउन-रेगुलेटेड थे और 120 प्रोटीन अप-रेगुलेटेड थे (चित्र 1एफ)। यह ध्यान देने योग्य है कि इस डेटा सेट के "नवीन मार्ग विश्लेषण" से पता चलता है कि विभेदक रूप से व्यक्त जीन मुख्य रूप से विशिष्ट चयापचय मार्गों के एक सीमित समूह से संबंधित हैं (चित्र 1जी)। दिलचस्प बात यह है कि हालांकि OXPHOS और कैल्शियम सिग्नलिंग से संबंधित मार्गों का डाउनरेगुलेशन फ्यूजन-कमी वाले PNs में माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन की पुष्टि करता है, वहीं अन्य श्रेणियां जिनमें मुख्य रूप से अमीनो एसिड मेटाबोलिज्म शामिल है, काफी हद तक अपरेगुलेटेड होती हैं, जो माइटोकॉन्ड्रियल PNs में होने वाले मेटाबोलिज्म के अनुरूप है। रीवायरिंग सुसंगत है।
(A) CTRL और Mfn2cKO चूहों के सेरिबेलर सेक्शन की प्रतिनिधि कॉन्फोकल तस्वीरें, जो PNs (कैल्बिंडिन, ग्रे) के क्रमिक नुकसान को दर्शाती हैं; नाभिकों को DAPI से काउंटरस्टेन किया गया था। (B) (A) का मात्रात्मक विश्लेषण (एक-तरफ़ा विश्लेषण, ***P<0.001; n = तीन चूहों से 4 से 6 वृत्त)। (C) प्रायोगिक कार्यप्रणाली। (D) पुरकिंजे (ऊपर) और अन्य कोशिका प्रकारों (मध्य) के लिए विशिष्ट मार्करों का हीट मैप वितरण। (E) वर्गीकृत PN में पहचाने गए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन की संख्या दर्शाने वाला वेन आरेख। (F) 8 सप्ताह में Mfn2cKO न्यूरॉन्स में विभेदक रूप से व्यक्त प्रोटीन का ज्वालामुखी प्लॉट (महत्व कट-ऑफ मान 1.3)। (G) रचनात्मकता मार्ग विश्लेषण 8 सप्ताह के रूप में वर्गीकृत Mfn2cKO PN में पांच सबसे महत्वपूर्ण अप-रेगुलेशन (लाल) और डाउन-रेगुलेशन (नीला) मार्गों को दर्शाता है। प्रत्येक पहचाने गए प्रोटीन का औसत अभिव्यक्ति स्तर दर्शाया गया है। ग्रेस्केल हीट मैप: समायोजित P मान। ns, महत्वहीन।
प्रोटीओमिक्स डेटा से पता चला कि कॉम्प्लेक्स I, III और IV की प्रोटीन अभिव्यक्ति धीरे-धीरे कम हो गई। कॉम्प्लेक्स I, III और IV सभी में आवश्यक mtDNA-एनकोडेड सबयूनिट्स थे, जबकि कॉम्प्लेक्स II, जो केवल न्यूक्लियर-कोडेड था, मूल रूप से अप्रभावित रहा (चित्र 2A और चित्र S2A)। प्रोटीओमिक्स परिणामों के अनुरूप, सेरेबेलर ऊतक अनुभागों के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने दिखाया कि PN में कॉम्प्लेक्स IV के MTCO1 (माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम C ऑक्सीडेज सबयूनिट 1) सबयूनिट का स्तर धीरे-धीरे कम हो गया (चित्र 2B)। mtDNA-एनकोडेड सबयूनिट Mtatp8 में उल्लेखनीय कमी आई (चित्र S2A), जबकि न्यूक्लियर-एनकोडेड ATP सिंथेस सबयूनिट का स्थिर-अवस्था स्तर अपरिवर्तित रहा, जो ज्ञात स्थिर ATP सिंथेस सबअसेंबली F1 कॉम्प्लेक्स के अनुरूप है जब mtDNA अभिव्यक्ति स्थिर होती है। गठन सुसंगत है। इंटरप्ट (7)। सॉर्ट किए गए Mfn2cKO PNs में mtDNA स्तर का रियल-टाइम पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) द्वारा मूल्यांकन करने पर mtDNA कॉपी संख्या में क्रमिक कमी की पुष्टि हुई। नियंत्रण समूह की तुलना में, 8 सप्ताह की आयु में, mtDNA स्तर का केवल लगभग 20% ही बरकरार रहा (चित्र 2C)। इन परिणामों के अनुरूप, Mfn2cKO PNs की कन्फोकल माइक्रोस्कोपी स्टेनिंग का उपयोग DNA का पता लगाने के लिए किया गया, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोटाइड्स की समय-निर्भर खपत दिखाई दी (चित्र 2D)। हमने पाया कि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन क्षरण और तनाव प्रतिक्रिया में शामिल कुछ उम्मीदवार ही अप-रेगुलेटेड थे, जिनमें Lonp1, Afg3l2 और Clpx, और OXPHOS कॉम्प्लेक्स असेंबली कारक शामिल हैं। एपोप्टोसिस में शामिल प्रोटीन के स्तर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया (चित्र S2B)। इसी प्रकार, हमने पाया कि कैल्शियम परिवहन में शामिल माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम चैनलों में केवल मामूली परिवर्तन हुए हैं (चित्र S2C)। इसके अतिरिक्त, ऑटोफैगी से संबंधित प्रोटीनों के मूल्यांकन में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं पाया गया, जो कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा इन विवो में देखे गए ऑटोफैगोसोम के प्रत्यक्ष प्रेरण के अनुरूप है (चित्र S3)। हालांकि, पीएन में प्रगतिशील ऑक्स्फ़ोसिफ़िकेशनल शिथिलता के साथ स्पष्ट अल्ट्रास्ट्रक्चरल माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन भी देखे गए। 5 और 8 सप्ताह की आयु के एमएफएन2सीकेओ पीएन के कोशिका निकायों और डेंड्रिटिक वृक्षों में माइटोकॉन्ड्रियल समूह देखे जा सकते हैं, और आंतरिक झिल्ली संरचना में गहन परिवर्तन हुए हैं (चित्र S4, A और B)। इन अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनों और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए में महत्वपूर्ण कमी के अनुरूप, टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (टीएमआरएम) के साथ तीव्र सेरेब्रल सेरेबेलर स्लाइस के विश्लेषण से पता चला कि एमएफएन2सीकेओ पीएन में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में उल्लेखनीय कमी आई है (चित्र S4C)।
(A) OXPHOS कॉम्प्लेक्स के अभिव्यक्ति स्तर का समय-क्रम विश्लेषण। केवल उन प्रोटीनों पर विचार करें जिनका P<0.05 8 सप्ताह पर है (दो-तरफ़ा ANOVA)। बिंदीदार रेखा: CTRL की तुलना में कोई समायोजन नहीं। (B) बाएँ: एंटी-MTCO1 एंटीबॉडी से चिह्नित सेरिबेलर अनुभाग का एक उदाहरण (स्केल बार, 20 μm)। पुरकिंजे कोशिका निकायों द्वारा घेरा गया क्षेत्र पीले रंग से ढका हुआ है। दाएँ: MTCO1 स्तरों का परिमाणीकरण (एक-तरफ़ा विचरण विश्लेषण; तीन चूहों से विश्लेषित 7 से 20 कोशिकाएँ)। (C) छांटे गए PN में mtDNA प्रतिलिपि संख्या का qPCR विश्लेषण (एक-तरफ़ा विचरण विश्लेषण; 3 से 7 चूहे)। (D) बाएँ: एंटी-DNA एंटीबॉडी से चिह्नित सेरिबेलर स्लाइस का एक उदाहरण (स्केल बार, 20 μm)। पुरकिंजे कोशिका निकायों द्वारा घेरा गया क्षेत्र पीले रंग से ढका हुआ है। दाएँ: mtDNA क्षति का परिमाणीकरण (एक-तरफ़ा विश्लेषण; तीन चूहों से 5 से 9 कोशिकाएँ)। (E) एक तीव्र सेरेब्रल अनुभाग का उदाहरण जिसमें संपूर्ण-कोशिका पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग में mitoYFP + पुरकिंजे कोशिकाएँ (तीर) दिखाई दे रही हैं। (F) IV वक्र का परिमाणीकरण। (G) CTRL और Mfn2cKO पुरकिंजे कोशिकाओं में डीपोलराइज़िंग करंट इंजेक्शन की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग। ऊपरी ट्रेस: ​​पहला पल्स जिसने AP को ट्रिगर किया। निचला ट्रेस: ​​अधिकतम AP आवृत्ति। (H) पोस्टसिनेप्टिक सहज इनपुट (sPSPs) का परिमाणीकरण। प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग ट्रेस और उसका ज़ूम अनुपात (I) में दिखाया गया है। एक-तरफ़ा विश्लेषण ने तीन चूहों से 5 से 20 कोशिकाओं का विश्लेषण किया। डेटा को माध्य±SEM के रूप में व्यक्त किया गया है; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001। (J) छिद्रित पैच क्लैंप मोड का उपयोग करके रिकॉर्ड किए गए सहज AP के प्रतिनिधि ट्रेस। ऊपरी रेखा: अधिकतम AP आवृत्ति। निचली रेखा: एक AP का ज़ूम। (K) (J) के अनुसार औसत और अधिकतम AP आवृत्ति का परिमाणीकरण करें। मैन-व्हिटनी परीक्षण; चार चूहों से 5 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। डेटा को माध्य±SEM के रूप में दर्शाया गया है; महत्वपूर्ण नहीं।
8 सप्ताह पुराने Mfn2cKO PN में स्पष्ट OXPHOS क्षति पाई गई, जो यह दर्शाती है कि न्यूरॉन्स का शारीरिक कार्य गंभीर रूप से असामान्य है। इसलिए, हमने तीव्र सेरेब्रल स्लाइस में होल-सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग करके 4 से 5 सप्ताह और 7 से 8 सप्ताह की आयु में OXPHOS-कमी वाले न्यूरॉन्स की निष्क्रिय विद्युत विशेषताओं का विश्लेषण किया (चित्र 2E)। अप्रत्याशित रूप से, Mfn2cKO न्यूरॉन्स का औसत विश्राम झिल्ली विभव और इनपुट प्रतिरोध नियंत्रण के समान था, हालांकि कोशिकाओं के बीच सूक्ष्म अंतर थे (तालिका 1)। इसी प्रकार, 4 से 5 सप्ताह की आयु में, धारा-वोल्टेज संबंध (IV वक्र) में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं पाया गया (चित्र 2F)। हालांकि, 7 से 8 सप्ताह पुराने कोई भी Mfn2cKO न्यूरॉन IV प्रक्रिया (हाइपरपोलराइजेशन चरण) में जीवित नहीं रहे, जो दर्शाता है कि इस अंतिम चरण में हाइपरपोलराइजेशन विभव के प्रति स्पष्ट संवेदनशीलता है। इसके विपरीत, Mfn2cKO न्यूरॉन्स में, बार-बार होने वाले एक्शन पोटेंशियल (AP) डिस्चार्ज उत्पन्न करने वाले डीपोलराइजिंग करंट अच्छी तरह से सहन किए जाते हैं, जो दर्शाता है कि उनके समग्र डिस्चार्ज पैटर्न 8 सप्ताह पुराने कंट्रोल न्यूरॉन्स से महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं हैं (तालिका 1 और चित्र 2G)। इसी प्रकार, सहज पोस्टसिनेप्टिक करंट (sPSCs) की आवृत्ति और आयाम कंट्रोल समूह के समान थे, और घटनाओं की आवृत्ति 4 सप्ताह से 5 सप्ताह, 7 सप्ताह से 8 सप्ताह तक समान वृद्धि के साथ बढ़ी (चित्र 2, H और I)। PNs में सिनेप्टिक परिपक्वता की अवधि (25)। छिद्रित PNs पैच के बाद भी समान परिणाम प्राप्त हुए। यह विन्यास सेलुलर ATP दोषों के संभावित मुआवजे को रोकता है, जैसा कि होल-सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग में हो सकता है। विशेष रूप से, Mfn2cKO न्यूरॉन्स के रेस्टिंग मेम्ब्रेन पोटेंशियल और सहज फायरिंग आवृत्ति प्रभावित नहीं हुए (चित्र 2, J और K)। संक्षेप में, ये परिणाम दर्शाते हैं कि स्पष्ट OXPHOS शिथिलता वाले PN उच्च-आवृत्ति निर्वहन पैटर्न का अच्छी तरह से सामना कर सकते हैं, जो यह दर्शाता है कि एक क्षतिपूर्ति तंत्र मौजूद है जो उन्हें लगभग सामान्य विद्युतशारीरिक प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने की अनुमति देता है।
डेटा को माध्य ± एसईएम (एक-तरफ़ा विश्लेषण, होल्म-सिडक बहु-तुलना परीक्षण; *P<0.05) के रूप में दर्शाया गया है। इकाई संख्या कोष्ठकों में दर्शायी गई है।
हमने यह पता लगाने का प्रयास किया कि क्या प्रोटिओमिक्स डेटासेट (चित्र 1G) में किसी श्रेणी में ऐसे मार्ग शामिल हैं जो गंभीर OXPHOS की कमी का प्रतिकार कर सकते हैं, जिससे यह स्पष्ट हो सके कि प्रभावित PN लगभग सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (चित्र 2, E से K) क्यों बनाए रख सकता है। प्रोटिओमिक्स विश्लेषण से पता चला कि शाखित श्रृंखला अमीनो एसिड (BCAA) के अपचय में शामिल एंजाइमों का स्तर काफी बढ़ गया था (चित्र 3A और चित्र S5A), और अंतिम उत्पाद एसिटाइल-CoA (CoA) या सक्सिनिल CoA धमनीकाठिन्य एसिड (TCA) चक्र में ट्राइकार्बोक्सिलेट की पूर्ति कर सकता है। हमने पाया कि BCAA ट्रांसएमिनेज 1 (BCAT1) और BCAT2 दोनों की मात्रा में वृद्धि हुई है। ये α-केटोग्लूटारेट (26) से ग्लूटामेट उत्पन्न करके BCAA अपचय के पहले चरण को उत्प्रेरित करते हैं। ब्रांच्ड चेन कीटो एसिड डीहाइड्रोजनेज (BCKD) कॉम्प्लेक्स बनाने वाली सभी सबयूनिट्स अपग्रेड हो जाती हैं (यह कॉम्प्लेक्स परिणामी BCAA कार्बन कंकाल के बाद के और अपरिवर्तनीय डीकार्बोक्सीलेशन को उत्प्रेरित करता है) (चित्र 3A और चित्र S5A)। हालांकि, छांटे गए PN में BCAA में कोई स्पष्ट परिवर्तन नहीं पाया गया, जो इन आवश्यक अमीनो एसिड के बढ़े हुए सेलुलर अपटेक या TCA चक्र को पूरक करने के लिए अन्य स्रोतों (ग्लूकोज या लैक्टिक एसिड) के उपयोग के कारण हो सकता है (चित्र S5B)। OXPHOS की कमी वाले PN ने 8 सप्ताह की उम्र में ग्लूटामिन अपघटन और ट्रांसएमीनेशन गतिविधियों में भी वृद्धि दिखाई, जो माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइम ग्लूटामिनेज (GLS) और ग्लूटामिन पाइरुवेट ट्रांसएमीनेज 2 (GPT2) के अपग्रेड से परिलक्षित हो सकती है (चित्र 3, A और C)। यह उल्लेखनीय है कि जीएलएस का अप-विनियमन स्प्लिस किए गए आइसोफॉर्म ग्लूटामिनेस सी (जीएलएस-जीएसी) तक सीमित है (एमएफएन2सीकेओ/सीटीआरएल का परिवर्तन लगभग 4.5 गुना है, पी = 0.05), और कैंसर ऊतकों में इसका विशिष्ट अप-विनियमन माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जी का समर्थन कर सकता है। (27)।
(A) हीट मैप 8 सप्ताह में निर्दिष्ट मार्ग के लिए प्रोटीन स्तर में गुना परिवर्तन दर्शाता है। (B) एंटी-PCx एंटीबॉडी से लेबल किए गए सेरेबेलर स्लाइस का उदाहरण (स्केल बार, 20 μm)। पीला तीर पुरकिंजे कोशिका पिंड की ओर इंगित करता है। (C) समय-क्रम प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण को एथेरोस्क्लेरोसिस के लिए एक महत्वपूर्ण उम्मीदवार के रूप में पहचाना गया (मल्टीपल टी-टेस्ट, *FDR <5%; n = 3-5 चूहे)। (D) ऊपर: एक योजनाबद्ध आरेख जो [1-13C]पाइरुवेट ट्रेसर में निहित लेबल किए गए कार्बन के प्रवेश के विभिन्न तरीकों को दर्शाता है (अर्थात, PDH या ट्रांस-धमनी मार्ग के माध्यम से)। नीचे: वायलिन चार्ट एकल-लेबल किए गए कार्बन (M1) के प्रतिशत को दर्शाता है जो [1-13C]पाइरुवेट के साथ तीव्र सेरेबेलर स्लाइस को लेबल करने के बाद एस्पार्टिक एसिड, साइट्रिक एसिड और मैलिक एसिड में परिवर्तित हो जाता है (युग्मित टी-टेस्ट; ** P <0.01)। (E) निर्दिष्ट पथ का व्यापक समय इतिहास विश्लेषण। केवल उन प्रोटीनों पर विचार करें जिनका P<0.05 8 सप्ताह पर है। खंडित रेखा: कोई समायोजन मान नहीं (दो-तरफ़ा विचरण विश्लेषण; * P <0.05; *** P <0.001)। डेटा को माध्य±SEM के रूप में दर्शाया गया है।
हमारे विश्लेषण में, BCAA कैटाबोलिज्म प्रमुख अप-रेगुलेशन मार्गों में से एक बन गया है। यह तथ्य दृढ़ता से इंगित करता है कि OXPHOS की कमी वाले PN में TCA चक्र में प्रवेश करने वाले वेंटिलेशन वॉल्यूम में परिवर्तन हो सकता है। यह न्यूरोनल मेटाबोलिक रीवायरिंग का एक प्रमुख रूप हो सकता है, जिसका गंभीर OXPHOS शिथिलता के रखरखाव के दौरान न्यूरोनल फिजियोलॉजी और अस्तित्व पर सीधा प्रभाव पड़ सकता है। इस परिकल्पना के अनुरूप, हमने पाया कि मुख्य एंटी-एथेरोस्क्लेरोटिक एंजाइम PCx अप-रेगुलेटेड है (Mfn2cKO/CTRL लगभग 1.5 गुना बदलता है; चित्र 3A), जो पाइरुवेट को ऑक्सैलोएसीटेट में परिवर्तित करने को उत्प्रेरित करता है (28), जिसके बारे में माना जाता है कि मस्तिष्क के ऊतकों में इसकी अभिव्यक्ति एस्ट्रोसाइट्स तक ही सीमित है (29, 30)। प्रोटिओमिक्स परिणामों के अनुरूप, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ने दिखाया कि OXPHOS-कमी वाले PN में PCx अभिव्यक्ति विशेष रूप से और महत्वपूर्ण रूप से बढ़ी हुई थी, जबकि PCx प्रतिक्रियाशीलता मुख्य रूप से नियंत्रण के आसन्न बर्गमैन ग्लियल कोशिकाओं तक ही सीमित थी (चित्र 3B)। PCx के देखे गए अपग्रेडेशन का कार्यात्मक परीक्षण करने के लिए, हमने तीव्र सेरेबेलर स्लाइस को [1-13C]पाइरुवेट ट्रेसर से उपचारित किया। जब पाइरुवेट को पाइरुवेट डीहाइड्रोजनेज (PDH) द्वारा ऑक्सीकृत किया गया, तो इसका आइसोटोप लेबल गायब हो गया, लेकिन संवहनी प्रतिक्रियाओं द्वारा पाइरुवेट के चयापचय के दौरान यह TCA चक्र मध्यवर्ती में शामिल हो जाता है (चित्र 3D)। हमारे प्रोटिओमिक्स डेटा के समर्थन में, हमने Mfn2cKO स्लाइस के एस्पार्टिक एसिड में इस ट्रेसर से बड़ी संख्या में मार्कर देखे, जबकि साइट्रिक एसिड और मैलिक एसिड में भी एक मध्यम प्रवृत्ति थी, हालांकि यह महत्वपूर्ण नहीं थी (चित्र 3D)।
माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए जीन (Tfam) को विशेष रूप से नष्ट करने के कारण माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता वाले माइटोपार्क चूहों के डोपामाइन न्यूरॉन्स में (चित्र S6B), PCx अभिव्यक्ति भी काफी हद तक बढ़ गई थी (31), यह दर्शाता है कि एसीटोन एसिड आर्टेरियोस्क्लेरोसिस रोग की घटना शरीर में न्यूरोनल OXPHOS की शिथिलता के दौरान विनियमित होती है। यह ध्यान देने योग्य है कि यह पाया गया है कि न्यूरॉन्स में व्यक्त होने वाले विशिष्ट एंजाइम (32-34) जो आर्टेरियोस्क्लेरोसिस से जुड़े हो सकते हैं, OXPHOS की कमी वाले PNs में काफी हद तक बढ़ जाते हैं, जैसे कि प्रोपियोनिल-CoA कार्बोक्सिलेज (PCC-A), मैलोनिल-CoA जो प्रोपियोनिल-CoA को सक्सिनिल-CoA में परिवर्तित करता है और माइटोकॉन्ड्रियल मैलिक एंजाइम 3 (ME3), जिसकी मुख्य भूमिका मैलेट से पाइरूवेट को पुनर्प्राप्त करना है (चित्र 3, A और C) (33, 35)। इसके अतिरिक्त, हमने Pdk3 एंजाइम में उल्लेखनीय वृद्धि पाई, जो PDH को फॉस्फोराइलेट करता है और इस प्रकार उसे निष्क्रिय कर देता है (36), जबकि PDH को सक्रिय करने वाले Pdp1 एंजाइम या PDH एंजाइम कॉम्प्लेक्स में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया (चित्र 3A)। लगातार, Mern2cKO PNs में, PDH कॉम्प्लेक्स के पाइरुवेट डिहाइड्रोजनेज E1 घटक के α1 सबयूनिट α (PDHE1α) सबयूनिट का Ser293 में फॉस्फोराइलेशन (जो PDH की एंजाइम गतिविधि को बाधित करने के लिए जाना जाता है) बढ़ गया था (चित्र S6C)। पाइरुवेट की कोई संवहनी पहुँच नहीं है।
अंततः, हमने पाया कि सेरीन और ग्लाइसिन जैवसंश्लेषण का सुपर पाथवे, संबंधित माइटोकॉन्ड्रियल फोलेट (1C) चक्र और प्रोलाइन जैवसंश्लेषण (चित्र 1G और चित्र S5C) सभी सक्रियण प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण रूप से अप-रेगुलेटेड होते हैं, जैसा कि रिपोर्टों में बताया गया है। आसपास के ऊतक माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन (5-7) के साथ सक्रिय होते हैं। इन प्रोटिओमिक्स डेटा का समर्थन करने वाले कॉन्फोकल विश्लेषण से पता चला कि OXPHOS की अनुपस्थिति वाले PN में, 8 सप्ताह के चूहों के सेरेबेलर स्लाइस को माइटोकॉन्ड्रियल फोलेट चक्र के एक प्रमुख एंजाइम, सेरीन हाइड्रॉक्सीमिथाइलट्रांसफरेज 2 (SHMT2) के संपर्क में लाया गया। महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया देखी गई (चित्र S5D)। 13 CU-ग्लूकोज-इनक्यूबेटेड एक्यूट सेरेबेलर स्लाइस में, मेटाबोलिक ट्रेसिंग प्रयोगों ने सेरीन और प्रोलाइन जैवसंश्लेषण के अप-रेगुलेशन की पुष्टि की, जिससे पता चलता है कि कार्बन आइसोफॉर्म का सेरीन और प्रोलाइन में प्रवाह बढ़ गया (चित्र S5E)। चूंकि जीएलएस और जीपीटी2 द्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाएं ग्लूटामिन से ग्लूटामेट के संश्लेषण और ग्लूटामेट तथा α-केटोग्लूटारेट के बीच ट्रांसएमीनेशन के लिए जिम्मेदार हैं, इसलिए उनका अपग्रेडेशन यह दर्शाता है कि ऑक्सफोस-कमी वाले न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट की मांग बढ़ जाती है। इसका उद्देश्य प्रोलाइन के बढ़े हुए जैवसंश्लेषण को बनाए रखना हो सकता है (चित्र S5C)। इन परिवर्तनों के विपरीत, पीएन-विशिष्ट Mfn2cKO चूहों से सेरेबेलर एस्ट्रोसाइट्स के एक प्रोटीओमिक विश्लेषण से पता चला कि इन मार्गों (सभी एंटीपेरोक्सीडेस सहित) की अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ, इस प्रकार यह प्रदर्शित होता है कि यह चयापचय संबंधी पुनर्निर्देशन विघटित पीएन के लिए चयनात्मक है (चित्र S6, D से G)।
संक्षेप में, इन विश्लेषणों से पीएन में विशिष्ट चयापचय मार्गों की अस्थायी सक्रियता के महत्वपूर्ण रूप से भिन्न पैटर्न सामने आए। यद्यपि असामान्य न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रियल कार्यप्रणाली प्रारंभिक एथेरोस्क्लेरोसिस और 1C रीमॉडलिंग (चित्र 3E और चित्र S5C) को जन्म दे सकती है, और यहां तक ​​कि I और IV कॉम्प्लेक्स की अभिव्यक्ति में अनुमानित परिवर्तन भी ला सकती है, सेरीन डी नोवो संश्लेषण में परिवर्तन केवल बाद के चरणों में ही स्पष्ट हुए। OXPHOS शिथिलता (चित्र 3E और चित्र S5C)। ये निष्कर्ष एक अनुक्रमिक प्रक्रिया को परिभाषित करते हैं जिसमें तनाव-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल (1C चक्र) और साइटोप्लाज्मिक (सेरीन जैवसंश्लेषण) प्रतिक्रिया, TCA चक्र में एथेरोस्क्लेरोसिस की वृद्धि के साथ तालमेल बिठाकर न्यूरोनल चयापचय को नया आकार देती है।
आठ सप्ताह पुराने OXPHOS-कमी वाले PN उच्च-आवृत्ति उत्तेजना गतिविधि को बनाए रख सकते हैं और माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता की भरपाई के लिए महत्वपूर्ण चयापचय पुनर्संयोजन से गुजर सकते हैं। इस खोज से एक दिलचस्प संभावना उत्पन्न होती है कि इस समय भी, इन कोशिकाओं को न्यूरोडीजेनरेशन में देरी या रोकथाम के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप की आवश्यकता हो सकती है। हमने दो स्वतंत्र हस्तक्षेपों के माध्यम से इस संभावना को हल किया। पहली विधि में, हमने एक Cre-निर्भर एडिनो-एसोसिएटेड वायरस (AAV) वेक्टर डिज़ाइन किया ताकि MFN2 को OXPHOS-कमी वाले PN में इन विवो में चुनिंदा रूप से व्यक्त किया जा सके (चित्र S7A)। MFN2 और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन mCherry (Mfn2-AAV) को एन्कोड करने वाले AAV को इन विट्रो में प्राथमिक न्यूरॉन कल्चर में सत्यापित किया गया, जिससे MFN2 Cre-निर्भर तरीके से व्यक्त हुआ और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान को बचाया गया, जिससे Mfn2cKO न्यूरॉन्स में न्यूरोम्यूटेशन को रोका जा सका (चित्र S7, B, D और E)। इसके बाद, हमने इन विवो प्रयोग किए, जिसमें 8 सप्ताह पुराने Mfn2-AAV को स्टीरियोटैक्टिकली Mfn2cKO और नियंत्रण चूहों के सेरेब्रल कॉर्टेक्स में पहुंचाया गया, और 12 सप्ताह पुराने चूहों का विश्लेषण किया गया (चित्र 4A)। उपचारित Mfn2cKO चूहे मर गए (चित्र 1, A और B) (16)। इन विवो वायरल ट्रांसडक्शन के परिणामस्वरूप कुछ सेरेब्रल सर्किलों में PN की चयनात्मक अभिव्यक्ति हुई (चित्र S7, G और H)। केवल mCherry (Ctrl-AAV) व्यक्त करने वाले नियंत्रण AAV के इंजेक्शन का Mfn2cKO जानवरों में न्यूरोडीजेनरेशन की डिग्री पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा। इसके विपरीत, Mfn2-AAV के साथ ट्रांसड्यूस किए गए Mfn2cKO के विश्लेषण से PN कोशिका परत का एक महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाई दिया (चित्र 4, B और C)। विशेष रूप से, न्यूरॉन घनत्व नियंत्रण जानवरों से लगभग अप्रभेद्य प्रतीत होता है (चित्र 4, B और C, और चित्र S7, H और I)। न्यूरोनल मृत्यु को रोकने में MFN1 की अभिव्यक्ति समान रूप से प्रभावी है, लेकिन MFN2 की नहीं (चित्र 4C और चित्र S7, C और F)। इससे पता चलता है कि एक्टोपिक MFN1 की अभिव्यक्ति MFN2 की कमी को प्रभावी ढंग से पूरा कर सकती है। एकल PN स्तर पर किए गए आगे के विश्लेषण से पता चला कि Mfn2-AAV ने माइटोकॉन्ड्रिया की अल्ट्रास्ट्रक्चर को काफी हद तक ठीक कर दिया, mtDNA के स्तर को सामान्य किया और एंटी-एंजियोजेनेसिस मार्कर PCx की उच्च अभिव्यक्ति को उलट दिया (चित्र 4, C से E)। आराम की स्थिति में ठीक हुए Mfn2cKO चूहों के दृश्य निरीक्षण से पता चला कि उनकी मुद्रा और मोटर लक्षण (गति S1 से S3) बेहतर हो गए थे। निष्कर्षतः, ये प्रयोग दर्शाते हैं कि OXPHOS की गंभीर कमी वाले PNs में MFN2 का विलंबित पुन: परिचय mtDNA की खपत को उलटने और एथेरोस्क्लेरोसिस को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, जिससे जीवित प्राणियों में एक्सोन अध:पतन और न्यूरोनल मृत्यु को रोका जा सकता है।
(A) एक योजना जो संकेतित चयापचय मार्ग के सक्रिय होने पर MFN2 को एनकोड करने वाले AAV को इंजेक्ट करने के लिए प्रायोगिक कार्यक्रम को दर्शाती है। (B) 12 सप्ताह पुराने सेरेबेलर स्लाइस की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां, जिन्हें 8 सप्ताह में Mfn2cKO चूहों में ट्रांसड्यूस किया गया और एंटी-कैल्बिंडिन एंटीबॉडी से लेबल किया गया। दाएँ: एक्सॉन फाइबर का स्केलिंग। एक्सॉन ज़ूम का स्केल 450 और 75 μm है। (C) बाएँ: AAV ट्रांसडक्शन लूप (AAV+) में पुरकिंजे कोशिका घनत्व का मात्रात्मक विश्लेषण (एक-तरफ़ा विश्लेषण; n = 3 चूहे)। दाएँ: 12वें सप्ताह में ट्रांसड्यूस किए गए PN में mtDNA फोकस विश्लेषण (अयुग्मित t-परीक्षण; तीन चूहों से 6 कोशिकाएँ)। * P <0.05; ** P <0.01। (D) दर्शाए गए वायरल वैक्टरों से ट्रांसड्यूस किए गए Mfn2cKO सेरिबेलर सेक्शन के PN के प्रतिनिधि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। गुलाबी मास्क डेंड्राइट्स द्वारा घेरे गए क्षेत्र को दर्शाता है, और पीला बिंदीदार वर्ग दाईं ओर दिए गए ज़ूम को दर्शाता है; n नाभिक को दर्शाता है। स्केल बार, 1μm। (E) 12 सप्ताह में ट्रांसड्यूस किए गए PN में PCx स्टेनिंग का एक उदाहरण दिखाता है। स्केल बार, 20μm। OE, ओवरएक्सप्रेशन; FC, फोल्ड चेंज।
अंत में, हमने ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरस (OXPHOS) शिथिलता से प्रभावित पीएन कोशिकाओं में पेरोक्सीडेज-प्रेरित कोशिका उत्तरजीविता के महत्व की जांच की। हमने माउस पीसीएक्स एमआरएनए (AAV-shPCx) को लक्षित करने वाले AAV-shRNA (शॉर्ट हेयरपिन आरएनए) को एन्कोड करने वाला mCherry उत्पन्न किया, और वायरस या इसके स्क्रैम्बल्ड कंट्रोल (AAV-scr) को Mfn2cKO चूहों के सेरिबेलम में इंजेक्ट किया। इंजेक्शन चौथे सप्ताह की आयु में (चित्र 5A) दिया गया ताकि पीसीएक्स अभिव्यक्ति में वृद्धि (चित्र 3C) और पीएन कोशिका परत के बरकरार रहने (चित्र 1A) के दौरान प्रभावी पीसीएक्स नॉकडाउन प्राप्त किया जा सके। यह ध्यान देने योग्य है कि पीसीएक्स को नॉकडाउन करने (चित्र S8A) से पीएन मृत्यु में उल्लेखनीय तेजी आती है, जो संक्रमित वलय तक ही सीमित है (चित्र 5, B और C)। PCx अप-रेगुलेशन द्वारा प्रेरित चयापचय प्रभावों के तंत्र को समझने के लिए, हमने PCx नॉकडाउन और AAV-मध्यस्थता वाले ऑप्टिकल बायोसेन्सर Grx1-roGFP2 की एक साथ अभिव्यक्ति के बाद PNs की रेडॉक्स स्थिति का अध्ययन किया (चित्र S8, B से D) ताकि ग्लूटाथियोन पेप्टाइड रेडॉक्स क्षमता में सापेक्ष परिवर्तन का मूल्यांकन किया जा सके (38)। इसके बाद, FLIM स्थितियों को सत्यापित करने के बाद, हमने 7-सप्ताह पुराने Mfn2cKO या नियंत्रण सहोदरों के तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में दो-फोटॉन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) की, ताकि साइटोप्लाज्मिक रेडॉक्स स्थिति में संभावित परिवर्तनों का पता लगाया जा सके (चित्र S8, E से G)। विश्लेषण से पता चला कि PCx अभिव्यक्ति रहित एकल Mfn2cKO PNs की ऑक्सीकरण अवस्था में महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है, जो नियंत्रण न्यूरॉन्स या केवल स्क्रैम्बल shRNA व्यक्त करने वाले Mfn2cKO PNs से भिन्न है (चित्र 5, D और E)। जब PCx अभिव्यक्ति को डाउन-रेगुलेट किया गया, तो अत्यधिक ऑक्सीकृत अवस्था दिखाने वाले Mfn2cKO PN का प्रतिशत तीन गुना से अधिक बढ़ गया (चित्र 5E), यह दर्शाता है कि PCx अप-रेगुलेशन ने पतित न्यूरॉन्स की रेडॉक्स क्षमता को बनाए रखा।
(A) एक आरेख जो संकेतित चयापचय मार्ग के सक्रिय होने पर shPCx को एनकोड करने वाले AAV को इंजेक्ट करने के लिए प्रायोगिक कार्यक्रम को दर्शाता है। (B) 4 सप्ताह की आयु में एंटी-कैल्सीन्यूरिन एंटीबॉडी के साथ ट्रांसड्यूस और लेबल किए गए Mfn2cKO चूहों के 8 सप्ताह पुराने सेरेबेलर अनुभागों की प्रतिनिधि कॉन्फोकल तस्वीरें। स्केल बार, 450μm। (C) AAV-ट्रांसड्यूस लूप में पुरकिंजे कोशिका घनत्व का मात्रात्मक विश्लेषण (एक-तरफ़ा विश्लेषण; n = 3 से 4 चूहे)। डेटा को माध्य±SEM के रूप में व्यक्त किया गया है; ***P<0.001। (D) प्रतिनिधि FLIM चित्र निर्दिष्ट प्रायोगिक स्थितियों के तहत ग्लूटाथियोन रेडॉक्स सेंसर Grx1-roGFP2 व्यक्त करने वाले 7 सप्ताह पुराने PN की औसत जीवन अवधि को दर्शाता है। LUT (लुक-अप टेबल) अनुपात: उत्तरजीविता समय अंतराल (पिकोसेकंड में)। स्केल बार, 25μm। (E) हिस्टोग्राम (D) से Grx1-roGFP2 जीवनकाल मानों का वितरण दर्शाता है (प्रत्येक स्थिति में दो चूहों में n=158 से 368 कोशिकाएँ)। प्रत्येक हिस्टोग्राम के ऊपर पाई चार्ट उन कोशिकाओं की संख्या दर्शाता है जिनका जीवनकाल मान CTRL-AAV-scr में औसत जीवनकाल मान के 1 SD से अधिक (लाल, ऑक्सीकृत) या कम (नीला, घटा हुआ) है। (F) प्रस्तावित मॉडल न्यूरोनल PCx के अपरेगुलेशन के सुरक्षात्मक प्रभाव को दर्शाता है।
कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत डेटा दर्शाता है कि MFN2 की पुनः अभिव्यक्ति गंभीर OXPHOS की कमी, गंभीर mtDNA क्षय और अत्यंत असामान्य इस्टा-जैसी आकृति विज्ञान वाले उन्नत PN को पूरी तरह से ठीक कर सकती है, जिससे उन्नत रोगों में भी निरंतर प्रगति सुनिश्चित होती है। न्यूरोडीजेनरेशन कोशिका मृत्यु से पूर्व की अवस्था का प्रतिवर्ती प्रमाण प्रदान करता है। चयापचयीय लचीलेपन की यह डिग्री न्यूरॉन्स की एथेरोस्क्लेरोसिस (TCA चक्र का पुनर्व्यवस्थापन) प्रेरित करने की क्षमता से और भी अधिक बल प्राप्त करती है, जो OXPHOS की कमी वाले PN में PCx अभिव्यक्ति को बाधित करती है और कोशिका मृत्यु को बढ़ाती है, जिससे एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाती है (चित्र 5F)।
इस अध्ययन में, हमने यह प्रमाण प्रस्तुत किया कि ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरस (OXPHOS) शिथिलता के प्रति न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया, चयापचय कार्यक्रमों द्वारा सक्रिय विभेदक सक्रियण मार्ग के माध्यम से धीरे-धीरे टीसीए चक्र एथेरोस्क्लेरोसिस की ओर अभिसरित होती है। हमने कई पूरक विधियों के साथ प्रोटिओमिक विश्लेषण की पुष्टि की और यह प्रकट किया कि गंभीर माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता से प्रभावित होने पर, न्यूरॉन्स में चयापचयीय लचीलेपन का एक पूर्व अज्ञात रूप होता है। हमें आश्चर्य हुआ कि संपूर्ण पुनर्व्यवस्था प्रक्रिया आवश्यक रूप से उस अंतिम चयापचयीय अवस्था को चिह्नित नहीं करती है जो धीरे-धीरे और अपरिवर्तनीय रूप से न्यूरोडीजेनरेशन के साथ होती है, बल्कि हमारे डेटा से पता चलता है कि यह कोशिका मृत्यु से पहले की अवस्था में भी एक रखरखाव न्यूरॉन कार्यात्मक क्षतिपूर्ति तंत्र का निर्माण कर सकती है। यह निष्कर्ष इंगित करता है कि न्यूरॉन्स में शरीर में चयापचयीय प्लास्टिसिटी की एक महत्वपूर्ण डिग्री होती है। यह तथ्य सिद्ध करता है कि बाद में एमएफएन2 की पुनः शुरूआत प्रमुख चयापचयीय मार्करों की अभिव्यक्ति को उलट सकती है और न्यूरॉन्स के क्षरण को रोक सकती है। इसके विपरीत, यह एथेरोस्क्लेरोसिस को रोकता है और तंत्रिकाओं के विकास को गति देता है।
हमारे शोध के सबसे रोचक निष्कर्षों में से एक यह है कि OXPHOS की कमी वाले PN, उन एंजाइमों को बढ़ाकर TCA चक्र चयापचय को संशोधित कर सकते हैं जो विशेष रूप से धमनीकाठिन्य को उत्तेजित करते हैं। चयापचय संबंधी पुनर्व्यवस्था कैंसर कोशिकाओं की एक सामान्य विशेषता है, जिनमें से कुछ TCA चक्र मध्यवर्ती पदार्थों की पूर्ति के लिए ग्लूटामिन पर निर्भर करती हैं ताकि अपचायक समतुल्य उत्पन्न हो सकें, जो श्वसन श्रृंखला को संचालित करते हैं और लिपिड और न्यूक्लियोटाइड जैवसंश्लेषण अग्रदूतों के उत्पादन को बनाए रखते हैं (39, 40)। एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि परिधीय ऊतकों में OXPHOS शिथिलता का अनुभव करने पर, ग्लूटामिन/ग्लूटामेट चयापचय का पुनर्संयोजन भी एक प्रमुख विशेषता है (5, 41), जहाँ TCA चक्र में ग्लूटामिन के प्रवेश की दिशा OXPHOS क्षति की गंभीरता पर निर्भर करती है (41)। हालाँकि, शरीर में तंत्रिका चयापचय प्लास्टिसिटी की किसी भी समानता और रोग के संदर्भ में इसकी संभावित प्रासंगिकता के बारे में स्पष्ट प्रमाणों का अभाव है। हाल ही में किए गए एक इन विट्रो अध्ययन में, प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को न्यूरोट्रांसमिशन के लिए ग्लूटामेट पूल को जुटाने के लिए दिखाया गया, जिससे चयापचय तनाव की स्थितियों में ऑक्सीडेटिव चयापचय और एथेरोस्क्लेरोसिस को बढ़ावा मिलता है (42)। यह ध्यान देने योग्य है कि टीसीए चक्र एंजाइम सक्सिनेट डीहाइड्रोजनेज के औषधीय अवरोध के तहत, पाइरुवेट कार्बोक्सीलेशन को संवर्धित सेरेबेलर ग्रैन्यूल न्यूरॉन्स में ऑक्सैलोएसिटेट के संश्लेषण को बनाए रखने के लिए माना जाता है (34)। हालांकि, मस्तिष्क ऊतक के लिए इन तंत्रों की शारीरिक प्रासंगिकता (जहां एथेरोस्क्लेरोसिस मुख्य रूप से एस्ट्रोसाइट्स तक सीमित माना जाता है) का अभी भी महत्वपूर्ण शारीरिक महत्व है (43)। इस मामले में, हमारे डेटा से पता चलता है कि शरीर में OXPHOS द्वारा क्षतिग्रस्त PN को BCAA क्षरण और पाइरुवेट कार्बोक्सीलेशन में परिवर्तित किया जा सकता है, जो TCA पूल मध्यवर्ती के पूरक के दो मुख्य स्रोत हैं। हालांकि न्यूरोनल ऊर्जा चयापचय में बीसीएए अपचय के संभावित योगदान का प्रस्ताव दिया गया है, साथ ही न्यूरोट्रांसमिशन के लिए ग्लूटामेट और जीएबीए की भूमिका का भी (44), इन तंत्रों के लिए अभी तक कोई प्रमाण नहीं है। इसलिए, यह अनुमान लगाना आसान है कि निष्क्रिय पीएन्स, एथेरोस्क्लेरोसिस को बढ़ाकर, आत्मसात प्रक्रिया द्वारा संचालित टीसीए मध्यवर्ती पदार्थों की खपत की स्वतः भरपाई कर सकते हैं। विशेष रूप से, एस्पार्टिक एसिड की बढ़ी हुई मांग को बनाए रखने के लिए पीसीएक्स के अपग्रेडेशन की आवश्यकता हो सकती है, जैसा कि माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता वाली प्रवर्धित कोशिकाओं में सुझाया गया है (45)। हालांकि, हमारे मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण ने एमएफएन2सीकेओ पीएन्स में एस्पार्टिक एसिड के स्थिर-अवस्था स्तर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखाया (चित्र S6A), जो संभवतः प्रवर्धित कोशिकाओं और पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स के बीच एस्पार्टिक एसिड के विभिन्न चयापचय उपयोग को दर्शाता है। यद्यपि निष्क्रिय न्यूरॉन्स में PCx अपग्रेडेशन की सटीक क्रियाविधि अभी तक स्पष्ट नहीं हो पाई है, हमने प्रदर्शित किया कि यह अपरिपक्व प्रतिक्रिया न्यूरॉन्स की रेडॉक्स अवस्था को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जिसे सेरेबेलर स्लाइस पर FLIM प्रयोगों में प्रदर्शित किया गया था। विशेष रूप से, PNs को PCx को अपग्रेड करने से रोकने से अधिक ऑक्सीकृत अवस्था उत्पन्न हो सकती है और कोशिका मृत्यु में तेजी आ सकती है। BCAA के अपघटन की सक्रियता और पाइरूवेट का कार्बोक्सीलेशन माइटोकॉन्ड्रियल निष्क्रियता के परिधीय ऊतकों की विशेषता बताने के तरीके नहीं हैं (7)। इसलिए, वे OXPHOS-कमी वाले न्यूरॉन्स की एक प्रमुख विशेषता प्रतीत होती हैं, भले ही यह एकमात्र विशेषता न हो, जो न्यूरोडीजेनरेशन के लिए महत्वपूर्ण है।
सेरेबेलर रोग एक विषम प्रकार का न्यूरोडीजेनरेटिव रोग है जो आमतौर पर गतिभंग (अटैक्सिया) के रूप में प्रकट होता है और अक्सर पीएन (46) को नुकसान पहुंचाता है। यह न्यूरॉन आबादी माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के प्रति विशेष रूप से संवेदनशील होती है क्योंकि चूहों में इनका चयनात्मक अपघटन मानव स्पाइनोसेरेबेलर गतिभंग (16, 47, 48) के कई मोटर लक्षणों को पुन: उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है। रिपोर्टों के अनुसार, एक उत्परिवर्ती जीन वाला ट्रांसजेनिक माउस मॉडल मानव स्पाइनोसेरेबेलर गतिभंग (अटैक्सिया) से जुड़ा है और इसमें माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता (49, 50) पाई जाती है, जो पीएनपीएच में ऑक्सिफ़ोस की कमी के परिणामों के अध्ययन के महत्व पर जोर देती है। इसलिए, इस अद्वितीय न्यूरॉन आबादी को प्रभावी ढंग से अलग करना और उसका अध्ययन करना विशेष रूप से उपयुक्त है। हालांकि, यह देखते हुए कि पीएन दबाव के प्रति बहुत संवेदनशील होते हैं और संपूर्ण सेरेबेलर कोशिका आबादी का एक छोटा अनुपात बनाते हैं, कई ओमिक्स-आधारित अध्ययनों के लिए, उन्हें संपूर्ण कोशिकाओं के रूप में चयनात्मक रूप से अलग करना अभी भी एक चुनौतीपूर्ण पहलू है। हालांकि अन्य प्रकार की कोशिकाओं (विशेष रूप से वयस्क ऊतकों) के संदूषण को पूरी तरह से खत्म करना लगभग असंभव है, फिर भी हमने प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में व्यवहार्य न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए FACS के साथ एक प्रभावी पृथक्करण चरण को संयोजित किया, और संपूर्ण सेरिबेलम (51) के मौजूदा डेटा सेट की तुलना में काफी उच्च प्रोटीन कवरेज (लगभग 3000 प्रोटीन) प्राप्त किया। संपूर्ण कोशिकाओं की व्यवहार्यता को संरक्षित करते हुए, हमारे द्वारा प्रस्तुत विधि हमें न केवल माइटोकॉन्ड्रिया में चयापचय मार्गों में होने वाले परिवर्तनों की जांच करने की अनुमति देती है, बल्कि इसके साइटोप्लाज्मिक समकक्षों में होने वाले परिवर्तनों की भी जांच करने की अनुमति देती है, जो जटिल ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या के लिए कोशिका प्रकार को समृद्ध करने हेतु माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली टैग के उपयोग का पूरक है (52, 53)। हमारे द्वारा वर्णित विधि न केवल पुरकिंजे कोशिकाओं के अध्ययन से संबंधित है, बल्कि इसे माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के अन्य मॉडलों सहित रोगग्रस्त मस्तिष्क में चयापचय परिवर्तनों को संबोधित करने के लिए किसी भी प्रकार की कोशिका पर आसानी से लागू किया जा सकता है।
अंततः, हमने इस चयापचय पुनर्व्यवस्था प्रक्रिया के दौरान एक चिकित्सीय अवसर की पहचान की है जो कोशिकीय तनाव के प्रमुख लक्षणों को पूरी तरह से उलट सकता है और तंत्रिका क्षरण को रोक सकता है। इसलिए, यहाँ वर्णित पुनर्व्यवस्था के कार्यात्मक निहितार्थों को समझना, माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के दौरान तंत्रिका व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए संभावित उपचारों में मूलभूत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। अन्य तंत्रिका संबंधी रोगों पर इस सिद्धांत की प्रयोज्यता को पूरी तरह से उजागर करने के लिए, अन्य प्रकार की मस्तिष्क कोशिकाओं में ऊर्जा चयापचय में होने वाले परिवर्तनों का विश्लेषण करने के उद्देश्य से भविष्य में अनुसंधान की आवश्यकता है।
मिटोपार्क चूहों का वर्णन पहले किया जा चुका है (31)। Mfn2 जीन के दोनों ओर loxP वाले C57BL/6N चूहों का वर्णन पहले किया जा चुका है (18) और उन्हें L7-Cre चूहों के साथ संकरण कराया गया (23)। परिणामस्वरूप प्राप्त दोहरे विषमयुग्मजी संतानों का संकरण समयुग्मजी Mfn2loxP/Mfn2loxP चूहों के साथ कराया गया ताकि Mfn2 के लिए पुरकिंजे-विशिष्ट जीन नॉकआउट (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) उत्पन्न किए जा सकें। कुछ संकरणों में, अतिरिक्त संकरणों के माध्यम से Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP एलील (stop-mtYFP) को शामिल किया गया (20)। सभी पशु प्रक्रियाओं को यूरोपीय, राष्ट्रीय और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया और जर्मनी के उत्तरी राइन-वेस्टफेलिया स्थित पर्यावरण और पशु संरक्षण विभाग (लैंडेसाम्टफुरनेचुर) द्वारा अनुमोदित किया गया। पशु संबंधी कार्य यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघों के मार्गदर्शन का भी पालन करते हैं।
गर्भवती महिला के गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन को एनेस्थीसिया देने के बाद, चूहे के भ्रूण को अलग किया गया (E13)। कॉर्टेक्स को 10 mM हेपेस युक्त हैंक्स बैलेंस्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (HBSS) में विच्छेदित किया गया और पैपेन (20 U/ml) और सिस्टीन (1μg/ml) युक्त डुलबेको मॉडिफाइड ईगल्स मीडियम पर स्थानांतरित किया गया। ऊतक को DMEM में 37°C पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया और एंजाइमेटिक पाचन द्वारा अलग किया गया, फिर 10% भ्रूण बोवाइन सीरम युक्त DMEM में यांत्रिक रूप से पीसा गया। कोशिकाओं को पॉलीलाइसिन से लेपित कांच के कवरस्लिप पर 2×10⁶ प्रति 6 cm कल्चर डिश के घनत्व पर या इमेजिंग विश्लेषण के लिए 0.5×10⁵ कोशिकाओं/cm² के घनत्व पर बोया गया। 4 घंटे बाद, माध्यम को 1% B27 सप्लीमेंट और 0.5 mM ग्लूटामैक्स युक्त न्यूरोबेसल सीरम-मुक्त माध्यम से बदल दिया गया। प्रयोग के दौरान न्यूरॉन्स को 37°C और 5% CO2 पर रखा गया और सप्ताह में एक बार उन्हें पोषक तत्व दिए गए। इन विट्रो में पुनर्संयोजन प्रेरित करने के लिए, दूसरे दिन न्यूरॉन्स को निम्नलिखित AAV9 वायरस वेक्टर के 3μl (24-वेल कल्चर डिश) या 0.5μl (24-वेल प्लेट) से उपचारित किया गया: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, कैटलॉग संख्या 105530-AAV9) और AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, कैटलॉग संख्या 105545-AAV9)।
माउस Mfn1 और Mfn2 पूरक डीएनए (क्रमशः Addgene प्लास्मिड #23212 और #23213 से प्राप्त) को C-टर्मिनस पर V5 अनुक्रम (GKPIPNPLLGLDST) से चिह्नित किया गया है, और T2A अनुक्रम के माध्यम से mCherry के साथ फ्रेम में फ्यूज किया गया है। Grx1-roGFP2 हाइडेलबर्ग टीपी डिक डीएफकेजेड (ड्यूश्स क्रेब्सफोर्सचुंग्सज़ेंट्रम) द्वारा उपहार स्वरूप प्राप्त हुआ है। पारंपरिक क्लोनिंग विधियों का उपयोग करके tdTomato कैसेट को प्रतिस्थापित करके, कैसेट को pAAV-CAG-FLEX-tdTomato बैकबोन (Addgene संदर्भ संख्या 28306) में सबक्लोन किया गया, जिससे pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 और pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 वेक्टर उत्पन्न हुए। इसी प्रकार की रणनीति का उपयोग नियंत्रण वेक्टर pAAV-CAG-FLEX-mCherry उत्पन्न करने के लिए किया गया। AAV-shPCx कंस्ट्रक्ट बनाने के लिए, एक प्लास्मिड AAV वेक्टर (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) की आवश्यकता होती है, जिसमें माउस PCx को लक्षित करने वाले shRNA को एन्कोड करने वाला DNA अनुक्रम (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) होता है। U6 प्रमोटर के नियंत्रण में, CMV प्रमोटर के नियंत्रण में mCherry का उपयोग किया जाता है। सहायक AAV वैक्टर का उत्पादन निर्माता के निर्देशों (Cell Biolabs) के अनुसार किया गया था। संक्षेप में, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) कोडिंग जीन, साथ ही कोडिंग AAV1 कैप्सिड प्रोटीन और सहायक प्रोटीन को ले जाने वाले ट्रांसफ़र प्लास्मिड का उपयोग करके 293AAV कोशिकाओं का क्षणिक ट्रांसफ़ेक्शन किया गया। प्लास्मिड को कैल्शियम फॉस्फेट विधि का उपयोग करके पैक किया गया। शुष्क बर्फ/इथेनॉल बाथ में फ्रीज़-थॉ चक्रों द्वारा कच्चे वायरस सुपरनेटेंट को प्राप्त किया गया और कोशिकाओं को फॉस्फेट बफ़र्ड सलाइन (PBS) में लाइस किया गया। AAV वेक्टर को असंतुलित आयोडिक्सानोल ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन (32,000 आरपीएम और 4°C पर 24 घंटे) द्वारा शुद्ध किया गया और एमिकन अल्ट्रा-15 सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर का उपयोग करके सांद्रित किया गया। AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 जीनोम कॉपी (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) और AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) का जीनोम टाइटर पहले बताए अनुसार (54) रियल-टाइम क्वांटिटेटिव PCR (qPCR) द्वारा मापा गया।
प्राथमिक न्यूरॉन्स को बर्फ़-ठंडे 1x PBS में खुरचकर निकाला गया, पेलेट बनाया गया और फिर फॉस्फेटेज और प्रोटीएज अवरोधक (रोश) युक्त 0.5% ट्राइटन X-100 / 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट/PBS लाइसिस बफर में समरूपीकृत किया गया। प्रोटीन की मात्रा का निर्धारण बाइकिंचोनिनिक एसिड परख (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके किया गया। इसके बाद प्रोटीन को SDS-पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पृथक किया गया और फिर पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड झिल्ली (जीई हेल्थकेयर) पर ब्लॉट किया गया। गैर-विशिष्ट साइटों को ब्लॉक करें और प्राथमिक एंटीबॉडी (विवरण के लिए तालिका S1 देखें) के साथ TBST (ट्रिस-बफर्ड सलाइन विद ट्विन) में 5% दूध में इनक्यूबेट करें। धुलाई के चरण और द्वितीयक एंटीबॉडी को TBST में इनक्यूबेट करें। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ +4°C पर रात भर इनक्यूबेट करें। धोने के बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी को कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए लगाएं। इसके बाद, उसी ब्लॉट को एंटी-β-एक्टिन एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करके, समान लोडिंग की पुष्टि की गई। केमिल्यूमिनेसेंस में परिवर्तित करके और केमिल्यूमिनेसेंस को बढ़ाकर (जीई हेल्थकेयर) इसका पता लगाया गया।
ग्लास कवरस्लिप पर पहले से ही बोए गए न्यूरॉन्स को कमरे के तापमान पर निर्धारित समय पर 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए)/पीबीएस से स्थिर किया गया। कवरस्लिप को पहले कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस से और फिर ब्लॉकिंग बफर [3% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए)/पीबीएस] से संतृप्त किया गया। दूसरे दिन, कवरस्लिप को ब्लॉकिंग बफर से धोया गया और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए उपयुक्त फ्लोरोफोर-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया; अंत में, नमूनों को पीबीएस में अच्छी तरह से धोया गया, 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) से काउंटरस्टेन किया गया और फिर एक्वा-पॉली/माउंट के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्थिर किया गया।
चूहों (नर और मादा) को केटामाइन (130 मिलीग्राम/किलोग्राम) और ज़ाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) के अंतःपेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा बेहोश किया गया और कार्प्रोफेन एनाल्जेसिक (5 मिलीग्राम/किलोग्राम) को सबक्यूटेनियस रूप से दिया गया। फिर उन्हें एक गर्म पैड से सुसज्जित स्टीरियोटैक्टिक उपकरण (कोफ़) में रखा गया। खोपड़ी को खोलकर, डेंटल ड्रिल का उपयोग करके सेरेब्रल कॉर्टेक्स के उस हिस्से को पतला किया गया जो मिसबोन (लैम्डा से: टेल 1.8, लेटरल 1, जो लोब्यूल IV और V के अनुरूप है) के अनुरूप है। नीचे की रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुँचाए बिना, घुमावदार सिरिंज सुई का उपयोग करके खोपड़ी में सावधानीपूर्वक एक छोटा छेद बनाया गया। फिर पतली खींची हुई कांच की केशिका को धीरे-धीरे सूक्ष्म छिद्र (ड्यूरा मेटर के उदर भाग पर -1.3 से -1 तक) में डाला जाता है, और 200 से 300 एनएल एएवी को माइक्रो-इंजेक्टर (नारिशिगे) में मैन्युअल सिरिंज (नारिशिगे) से कम दबाव पर 10 से 20 मिनट की अवधि में कई बार इंजेक्ट किया जाता है। इंजेक्शन के बाद, वायरस को पूरी तरह से फैलने देने के लिए केशिका को 10 मिनट के लिए वहीं रखा जाता है। केशिकाओं को निकालने के बाद, घाव की सूजन को कम करने और जानवर को ठीक होने देने के लिए त्वचा को सावधानीपूर्वक टांके लगाकर बंद कर दिया जाता है। ऑपरेशन के बाद कई दिनों तक जानवरों को दर्द निवारक (कैस्पोफेन) दिया गया, इस दौरान उनकी शारीरिक स्थिति की सावधानीपूर्वक निगरानी की गई और फिर निर्धारित समय पर उन्हें इच्छामृत्यु दे दी गई। सभी प्रक्रियाएं यूरोपीय, राष्ट्रीय और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार की गईं और जर्मनी के नॉर्थ राइन-वेस्टफेलिया स्थित लैंडेसाम्टफुरनेचुर ऑफ उमवेल्ट एंड वेरब्राउचशुट्ज़ द्वारा अनुमोदित की गईं।
पशुओं को केटामाइन (100 मिलीग्राम/किलोग्राम) और ज़ाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) से बेहोश किया गया, और हृदय को पहले 0.1 एम पीबीएस से, और फिर पीबीएस में 4% पीएफए ​​से परफ्यूज़ किया गया। ऊतक को विच्छेदित किया गया और 4°C पर रात भर 4% पीएफए/पीबीएस में स्थिर किया गया। पीबीएस में स्थिर मस्तिष्क से सैजिटल सेक्शन (50 μm मोटे) तैयार करने के लिए एक वाइब्रेटिंग नाइफ (लीका माइक्रोसिस्टम्स जीएमबीएच, वियना, ऑस्ट्रिया) का उपयोग किया गया। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न हो, मुक्त-तैरते हुए सेक्शन की स्टेनिंग ऊपर वर्णित (13) के अनुसार कमरे के तापमान पर और हिलाते हुए की गई। संक्षेप में, सबसे पहले, प्राप्त स्लाइस को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस के साथ पारगम्य बनाया गया; कुछ एपिटोप्स (Pcx और Shmt2) के लिए, इस चरण के बजाय स्लाइस को 80°C (PH 9) पर ट्रिस-EDTA बफर में 25 मिनट तक गर्म करें। इसके बाद, सेक्शन को प्राथमिक एंटीबॉडी (तालिका S1 देखें) के साथ ब्लॉकिंग बफर (3% BSA/PBS) में 4°C पर रात भर हिलाते हुए इनक्यूबेट किया गया। अगले दिन, सेक्शन को ब्लॉकिंग बफर से धोया गया और उपयुक्त फ्लोरोफोर-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया; अंत में, सेक्शन को PBS में अच्छी तरह से धोया गया, DAPI से काउंटर-स्टेन किया गया, और फिर एक्वापॉलीमाउंट के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर फिक्स किया गया।
नमूने की इमेजिंग के लिए एक लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप (TCS SP8-X या TCS डिजिटल लाइट शीट, लीका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग किया गया, जिसमें एक सफेद प्रकाश लेजर और एक 405 डायोड पराबैंगनी लेजर लगा हुआ था। फ्लोरोफोर को उत्तेजित करके और हाइब्रिड डिटेक्टर (HyDs) से सिग्नल एकत्र करके, LAS-X सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अनुक्रमिक मोड में नाइक्विस्ट सैंपलिंग के अनुरूप स्टैक्ड इमेज एकत्र की गईं: गैर-मात्रात्मक पैनलों के लिए, यह अत्यधिक गतिशील सिग्नल (उदाहरण के लिए, दैहिक कोशिकाओं और डेंड्राइट्स में) होता है (ब्राइटआर मोड में PN की संख्या का पता लगाने के लिए HyD का उपयोग करें)। बैकग्राउंड को कम करने के लिए 0.3 से 6 ns तक की गेटिंग लागू की गई।
छांटे गए कोशिकाओं का वास्तविक समय में चित्रण। 1% B27 सप्लीमेंट और 0.5 mM ग्लूटामैक्स युक्त न्यूरोबेसल-ए माध्यम में छांटने के बाद, कोशिकाओं को तुरंत पॉली-एल-लाइसिन लेपित कांच की स्लाइड (μ-स्लाइड 8 वेल, इबिडी, कैटलॉग नंबर 80826) पर बोया गया, और फिर कोशिकाओं को जमने देने के लिए इसे 37°C और 5% CO2 पर 1 घंटे के लिए रखा गया। वास्तविक समय में चित्रण एक लीका SP8 लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप पर किया गया, जिसमें एक सफेद लेजर, HyD, 63× [1.4 न्यूमेरिकल एपर्चर (NA)] ऑयल ऑब्जेक्टिव लेंस और एक हीटिंग स्टेज लगा हुआ था।
चूहे को कार्बन डाइऑक्साइड से तुरंत बेहोश किया गया और उसका सिर काट दिया गया, मस्तिष्क को खोपड़ी से तुरंत निकाल लिया गया और 200μm मोटी (13C लेबलिंग प्रयोग के लिए) या 275μm मोटी (दो फोटॉन प्रयोगों के लिए) सैजिटल सेक्शन में काटा गया, जिसमें निम्नलिखित सामग्री भरी हुई थी। आइसक्रीम (HM-650 V, थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्डोर्फ, जर्मनी) में निम्नलिखित पदार्थ भरे हुए थे: 125 mM बर्फ-ठंडा, कार्बन-संतृप्त (95% O2 और 5% CO2) कम Ca2 + कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25 mM NaHCO3, 25 mM ग्लूकोज, 0.5 mM CaCl2 और 3.5 mM MgCl2 (310 से 330 mmol का परासरण दाब)। प्राप्त मस्तिष्क के टुकड़ों को उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 और 2.0 mM MgCl2) माध्यम, pH 7.4 और 310 से 320 mmol युक्त पूर्व-इनक्यूबेशन कक्ष में स्थानांतरित करें।
इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, स्लाइस को एक विशेष इमेजिंग कक्ष में ले जाया गया, और प्रयोग को 32° से 33°C के स्थिर तापमान पर निरंतर ACSF परफ्यूजन के तहत किया गया। स्लाइस इमेजिंग के लिए, लीका 25x ऑब्जेक्टिव लेंस (NA 0.95, वाटर) और Ti: सैफायर लेजर (कैमेलियन विजन II, कोहेरेंट) से लैस मल्टीफ़ोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (TCS SP8 MP-OPO, लीका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग किया गया। FLIM मॉड्यूल (पिकोहार्प300, पिकोक्वांट) का भी उपयोग किया गया।
Grx1-roGFP2 का FLIM। सैजिटल ब्रेन स्लाइस में दो-फोटॉन FLIM द्वारा PN की साइटोप्लाज्मिक रेडॉक्स अवस्था में परिवर्तन को मापा गया, जहां Grx1-roGFP2 बायोसेन्सर ने PN को लक्षित किया। PN परत में, अधिग्रहण क्षेत्र को स्लाइस की सतह से लगभग 50 से 80 μm नीचे चुना गया ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एक व्यवहार्य PN (अर्थात्, डेंड्राइट्स के साथ बीडेड संरचना या न्यूरोनल रूपात्मक परिवर्तनों की कमी) और डबल पॉजिटिव roGFP2 सेंसर और shRNA PCx या इसके नियंत्रण अनुक्रम (प्रत्येक mCherry को सह-व्यक्त करते हुए) को एन्कोड करने वाला AAV मौजूद हो। 2x डिजिटल ज़ूम के साथ सिंगल-स्टैक छवियां एकत्र की गईं [उत्तेजना तरंगदैर्ध्य: 890 nm; 512 nm 512 पिक्सेल]। डिटेक्शन: आंतरिक HyD, फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (FITC) फ़िल्टर समूह] और 2 से 3 मिनट के भीतर इमेज एवरेजिंग का उपयोग कर्व फिटिंग के लिए पर्याप्त फोटॉन (कुल 1000 फोटॉन) एकत्र करने के लिए किया जाता है। Grx1-roGFP2 प्रोब की संवेदनशीलता और FLIM स्थितियों का सत्यापन परफ्यूजन ACSF में बाह्य 10 mM H2O2 (ऑक्सीकरण को अधिकतम करने के लिए, जिसके परिणामस्वरूप जीवनकाल बढ़ता है) और फिर 2 mM डाइथियोथ्रिटोल (अपचयन की मात्रा को कम करने के लिए, जिसके परिणामस्वरूप जीवनकाल घटता है) मिलाकर roGFP2 के जीवनकाल मान की निगरानी करके किया गया (चित्र S8, D से G)। प्राप्त परिणामों का विश्लेषण करने के लिए FLIMfit 5.1.1 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें, संपूर्ण छवि के एकल घातीय क्षय वक्र को मापे गए IRF (इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फ़ंक्शन) के अनुरूप बनाएं, और χ2 लगभग 1 है। एकल PN के जीवनकाल की गणना करने के लिए, तंत्रिका शरीर के चारों ओर मास्क को मैन्युअल रूप से खींचा गया था, और प्रत्येक मास्क में औसत जीवनकाल का उपयोग मात्रा निर्धारण के लिए किया गया था।
माइटोकॉन्ड्रियल पोटेंशियल विश्लेषण। एक्यूट सेक्शन को 30 मिनट के लिए परफ्यूज्ड ACSF में सीधे 100 nM TMRM मिलाकर इनक्यूबेट करने के बाद, PNs के माइटोकॉन्ड्रियल पोटेंशियल में परिवर्तन को टू-फोटॉन माइक्रोस्कोप द्वारा मापा गया। TMRM इमेजिंग 920 nm पर प्रोब को उत्तेजित करके और सिग्नल एकत्र करने के लिए आंतरिक HyD (टेट्रामेथिलरोडामाइन आइसोथियोसाइनेट: 585/40 nm) का उपयोग करके की गई; mtYFP की इमेजिंग के लिए समान उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उपयोग किया गया लेकिन एक अलग आंतरिक HyD (FITC: 525/50) का उपयोग किया गया। एकल कोशिका स्तर पर माइटोकॉन्ड्रियल पोटेंशियल का मूल्यांकन करने के लिए ImageJ के इमेज कैलकुलेटर प्लग-इन का उपयोग करें। संक्षेप में, प्लग-इन समीकरण: सिग्नल = min (mtYFP, TMRM) का उपयोग संबंधित चैनल की सिंगल-स्टैक कॉन्फोकल इमेज में पुरकिंजे सोमाली में TMRM सिग्नल दिखाने वाले माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र की पहचान करने के लिए किया जाता है। फिर परिणामी मास्क में पिक्सेल क्षेत्र का परिमाणीकरण किया जाता है, और फिर माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता दर्शाने वाले माइटोकॉन्ड्रियल अंश को प्राप्त करने के लिए mtYFP चैनल की संबंधित थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टैक छवि पर सामान्यीकृत किया जाता है।
छवि को ह्यूजेन्स प्रो (वैज्ञानिक वॉल्यूम इमेजिंग) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डीकनवोल्यूट किया गया। टाइलों की स्कैन की गई तस्वीरों के लिए, LAS-X सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए स्वचालित स्टिचिंग एल्गोरिदम का उपयोग करके एक टाइल का मोंटाज बनाया गया। छवि कैलिब्रेशन के बाद, छवि को आगे संसाधित करने और चमक और कंट्रास्ट को समान रूप से समायोजित करने के लिए ImageJ और Adobe Photoshop का उपयोग किया गया। ग्राफ़िक तैयार करने के लिए Adobe Illustrator का उपयोग किया गया।
mtDNA फोकस विश्लेषण। डीएनए के विरुद्ध एंटीबॉडी से लेबल किए गए मस्तिष्क खंडों पर mtDNA घावों की संख्या को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा मापा गया। प्रत्येक कोशिका के कोशिका शरीर और नाभिक के लिए एक लक्ष्य क्षेत्र बनाया गया, और संबंधित क्षेत्र की गणना मल्टी मेजर प्लग-इन (ImageJ सॉफ़्टवेयर) का उपयोग करके की गई। कोशिका शरीर क्षेत्र से नाभिकीय क्षेत्र को घटाकर कोशिका प्लाज्मिक क्षेत्र प्राप्त किया गया। अंत में, एनालाइज़ पार्टिकल्स प्लग-इन (ImageJ सॉफ़्टवेयर) का उपयोग थ्रेशोल्ड छवि पर mtDNA को इंगित करने वाले कोशिका प्लाज्मिक डीएनए बिंदुओं को स्वचालित रूप से मापने के लिए किया गया, और प्राप्त परिणामों को CTRL चूहों के PN औसत के सापेक्ष सामान्यीकृत किया गया। परिणामों को प्रति कोशिका न्यूक्लियोसाइड की औसत संख्या के रूप में व्यक्त किया गया है।
प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। एकल कोशिका स्तर पर PN में प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए ImageJ के इमेज कैलकुलेटर प्लग-इन का उपयोग करें। संक्षेप में, संबंधित चैनल की एकल-परत कॉन्फोकल छवि में, समीकरण: सिग्नल = min (mtYFP, एंटीबॉडी) के माध्यम से, पुरकिना में एक निश्चित एंटीबॉडी के प्रति प्रतिरक्षात्मकता दिखाने वाले माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र की पहचान की जाती है। फिर परिणामी मास्क में पिक्सेल क्षेत्र का परिमाणीकरण किया जाता है, और फिर प्रदर्शित प्रोटीन के माइटोकॉन्ड्रियल अंश को प्राप्त करने के लिए mtYFP चैनल की संबंधित थ्रेशोल्ड एकल-स्टैक छवि पर सामान्यीकृत किया जाता है।
पुरकिंजे कोशिका घनत्व विश्लेषण। इमेजजे के सेल काउंटर प्लगइन का उपयोग करके, गिनी गई पुरकिंजे कोशिकाओं की संख्या को मस्तिष्क के वलय की लंबाई से विभाजित करके पुरकिंजे घनत्व का मूल्यांकन किया गया।
नमूना तैयार करना और संग्रह करना। नियंत्रण समूह और Mfn2cKO चूहों के मस्तिष्क को 0.1 M फॉस्फेट बफर (PB) में 2% PFA/2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड में स्थिर किया गया, और फिर सिलिएट्स (लीका माइक्रोसिस्टम जीएमबीएच, वियना, ऑस्ट्रिया) का उपयोग करके कोरोनल सेक्शन तैयार किए गए (मोटाई 50 से 60 μm)। इसके बाद, PB बफर में 1% टेट्राऑक्साइड और 1.5% पोटेशियम फेरोसाइनाइड के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए स्थिर किया गया। सेक्शन को आसुत जल से तीन बार धोया गया, और फिर 1% यूरेनिल एसीटेट युक्त 70% इथेनॉल से 20 मिनट के लिए रंगा गया। इसके बाद, खंडों को ग्रेडेड अल्कोहल में निर्जलित किया गया और सिलिकॉन-लेपित कांच की स्लाइडों के बीच ड्यूरकुपान एसीएम (अरालडाइट कास्टिंग रेजिन एम) एपॉक्सी रेजिन (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी साइंसेज, कैटलॉग संख्या 14040) में एम्बेड किया गया, और अंत में 60°C पर ओवन में 48 घंटे के लिए पॉलीमराइज़ किया गया। सेरेब्रल कॉर्टेक्स क्षेत्र का चयन किया गया और लीका अल्ट्राकट (लीका माइक्रोसिस्टम जीएमबीएच, वियना, ऑस्ट्रिया) पर 50 एनएम अल्ट्राथिन खंड काटे गए और पॉलीस्टाइन फिल्म से लेपित 2×1 मिमी कॉपर स्लिट ग्रिड पर रखे गए। खंडों को 10 मिनट के लिए पानी में 4% यूरेनिल एसीटेट के घोल से रंगा गया, कई बार पानी से धोया गया, फिर 10 मिनट के लिए पानी में रेनॉल्ड्स लेड साइट्रेट से रंगा गया, और फिर कई बार पानी से धोया गया। सूक्ष्मदर्शी चित्र फिलिप्स सीएम100 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) और टीवीआईपीएस (टिट्ज़ वीडियो और इमेज प्रोसेसिंग सिस्टम) टेमकैम-एफ416 डिजिटल कैमरा (टीवीआईपीएस जीएमबीएच, गौटिंग, यूएसए) का उपयोग करके लिए गए थे। (जर्मनी)।
AAV से संक्रमित चूहों के मस्तिष्क को अलग करके 1 मिमी मोटी सैजिटल सेक्शन में काटा गया, और AAV-संक्रमित रिंग (यानी, mCherry व्यक्त करने वाले) की पहचान करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेरिबेलम की जांच की गई। केवल उन्हीं प्रयोगों का उपयोग किया गया जिनमें AAV इंजेक्शन के परिणामस्वरूप कम से कम दो लगातार सेरिबेलर रिंगों में पुरकिंजे कोशिका परत (यानी लगभग पूरी परत) की बहुत उच्च ट्रांसडक्शन दक्षता प्राप्त होती है। AAV-ट्रांसड्यूस्ड लूप को रात भर पोस्ट-फिक्सेशन (0.1 M कोकोएट बफर में 4% PFA और 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड) के लिए माइक्रोडिसेक्ट किया गया और आगे संसाधित किया गया। EPON एम्बेडिंग के लिए, फिक्स्ड ऊतक को 0.1 M सोडियम कोकोएट बफर (एप्लिकेम) से धोया गया, और 0.1 M सोडियम कोकोएट बफर (एप्लिकेम) में 2% OsO4 (os, साइंस सर्विसेज; कैको) के साथ 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया, फिर 2 घंटे के लिए धोया गया। 0.1 M कोकामाइड बफर के साथ इस प्रक्रिया को 3 बार दोहराएं। इसके बाद, ऊतक को निर्जलित करने के लिए प्रत्येक इथेनॉल घोल को 4°C पर 15 मिनट के लिए इथेनॉल की बढ़ती हुई श्रृंखला में इनक्यूबेट किया गया। ऊतक को प्रोपलीन ऑक्साइड में स्थानांतरित किया गया और 4°C पर EPON (सिग्मा-एल्ड्रिच) में रात भर इनक्यूबेट किया गया। ऊतक को कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ताजे EPON में रखें, और फिर इसे 62°C पर 72 घंटे के लिए एम्बेड करें। 70 nm अल्ट्राथिन सेक्शन काटने के लिए एक अल्ट्रामाइक्रोटोम (लीका माइक्रोसिस्टम्स, UC6) और एक डायमंड नाइफ (डायटोम, बील, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करें, और 37°C पर 15 मिनट के लिए 1.5% यूरेनिल एसीटेट से और फिर 4 मिनट के लिए लेड साइट्रेट घोल से स्टेन करें। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी चित्र JEM-2100 Plus ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (JEOL) का उपयोग करके लिए गए थे, जिसमें Camera OneView 4K 16-बिट (Gatan) और DigitalMicrograph सॉफ़्टवेयर (Gatan) लगे हुए थे। विश्लेषण के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी चित्रों को 5000× या 10,000× डिजिटल ज़ूम के साथ प्राप्त किया गया था।
माइटोकॉन्ड्रिया का आकारिकी विश्लेषण। सभी विश्लेषणों के लिए, ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डिजिटल छवियों में प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रिया की रूपरेखा मैन्युअल रूप से बनाई गई थी। विभिन्न आकारिकी मापदंडों का विश्लेषण किया गया। माइटोकॉन्ड्रिया का घनत्व प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया, जो प्रत्येक कोशिका के कुल माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्रफल को कोशिका द्रव्य क्षेत्रफल से विभाजित करके प्राप्त किया गया (कोशिका द्रव्य क्षेत्रफल = कोशिका क्षेत्रफल - कोशिका केंद्रक क्षेत्रफल) × 100। माइटोकॉन्ड्रिया की गोलाई की गणना सूत्र [4π∙(क्षेत्रफल/परिधि²)] से की गई। माइटोकॉन्ड्रिया की आकारिकी का विश्लेषण किया गया और उनके मुख्य आकार के अनुसार उन्हें दो श्रेणियों ("नलिकाकार" और "छालाकार") में विभाजित किया गया।
ऑटोफैगोसोम/लाइसोसोम की संख्या और घनत्व का विश्लेषण। डिजिटल छवि में प्रत्येक ऑटोफैगोसोम/लाइसोसोम की रूपरेखा को मैन्युअल रूप से रेखांकित करने के लिए ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। ऑटोफैगोसोम/लाइसोसोम का क्षेत्रफल प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है, जिसकी गणना प्रत्येक कोशिका के कुल ऑटोफैगोसोम/लाइसोसोम संरचना क्षेत्रफल को कोशिका प्लाज्म क्षेत्रफल से विभाजित करके की जाती है (कोशिका प्लाज्म क्षेत्रफल = कोशिका क्षेत्रफल - केंद्रक क्षेत्रफल) × 100। ऑटोफैगोसोम/लाइसोसोम का घनत्व कुल संख्या को प्रति कोशिका ऑटोफैगोसोम/लाइसोसोम संरचनाओं की संख्या (कोशिका प्लाज्म क्षेत्रफल के संदर्भ में) से विभाजित करके गणना की जाती है (कोशिका प्लाज्म क्षेत्रफल = कोशिका क्षेत्रफल - केंद्रक क्षेत्रफल)।
तीव्र अनुभागन और नमूना तैयार करने के लिए लेबलिंग। ग्लूकोज लेबलिंग की आवश्यकता वाले प्रयोगों के लिए, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस को एक पूर्व-इनक्यूबेशन कक्ष में स्थानांतरित करें, जिसमें संतृप्त कार्बन (95% O2 और 5% CO2), उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 और 2.0 mM MgCl2, pH 7.4 और 310 से 320 mOsm पर समायोजित) होता है, जिसमें ग्लूकोज 13 C 6- ग्लूकोज प्रतिस्थापन (यूरिसोटॉप, कैटलॉग संख्या CLM-1396) होता है। पाइरुवेट लेबलिंग की आवश्यकता वाले प्रयोगों के लिए, मस्तिष्क के तीव्र स्लाइस को उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 और 2.0 mM MgCl2 मिलाकर pH 7.4 और 310 से 320 mOsm पर समायोजित करें) में स्थानांतरित करें, और 1 mM 1-[1-13C]पाइरुवेट (यूरिसोटॉप, कैटलॉग संख्या CLM-1082) मिलाएं। इन स्लाइस को 37°C पर 90 मिनट तक इनक्यूबेट करें। प्रयोग के अंत में, नमूनों को 75 mM अमोनियम कार्बोनेट युक्त जलीय विलयन (pH 7.4) से शीघ्रता से धोया गया, और फिर 40:40:20 (v:v:v) एसीटोनिट्राइल (ACN): मेथनॉल: जल के मिश्रण में समरूपीकृत किया गया। नमूनों को 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखने के बाद, उन्हें 4°C पर 10 मिनट के लिए 21,000 g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और साफ सुपरनेटेंट को स्पीडवैक कंसंट्रेटर में सुखाया गया। परिणामी सूखे मेटाबोलाइट पेलेट को विश्लेषण तक -80°C पर संग्रहित किया गया।
13 C-लेबल वाले अमीनो एसिड का लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS) विश्लेषण के लिए, मेटाबोलाइट पेलेट को 75 μl LC-MS ग्रेड पानी (हनीवेल) में पुनः निलंबित किया गया। 4°C पर 5 मिनट के लिए 21,000 g पर सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद, स्पष्ट किए गए सुपरनेटेंट के 20 μl का उपयोग अमीनो एसिड फ्लक्स विश्लेषण के लिए किया गया, जबकि शेष अर्क का उपयोग तुरंत आयन विश्लेषण के लिए किया गया (नीचे देखें)। अमीनो एसिड विश्लेषण पहले वर्णित बेंजोइल क्लोराइड व्युत्पन्न प्रोटोकॉल (55, 56) का उपयोग करके किया गया था। पहले चरण में, 20 μl मेटाबोलाइट एक्सट्रैक्ट में 10 μl 100 mM सोडियम कार्बोनेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) मिलाया गया, और फिर LC ग्रेड ACN में 10 μl 2% बेंजॉयल क्लोराइड (सिग्मा-एल्ड्रिच) मिलाया गया। नमूने को थोड़ी देर के लिए वर्टेक्स किया गया और फिर 20°C पर 5 मिनट के लिए 21,000 g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। साफ किए गए सुपरनेटेंट को एक शंक्वाकार कांच के इंसर्ट (200 μl आयतन) वाले 2 ml ऑटोसेम्प्लर वायल में स्थानांतरित किया गया। नमूनों का विश्लेषण Q-Exactive (QE)-HF (अल्ट्रा हाई फील्ड ऑर्बिट्रैप) उच्च-रिज़ॉल्यूशन परिशुद्धता मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) से जुड़े एक्विटी iClass अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस LC सिस्टम (वाटर्स) का उपयोग करके किया गया। विश्लेषण के लिए, व्युत्पन्न नमूने के 2 μl को 1.8 μm कणों वाले 100 × 1.0 mm उच्च-शक्ति सिलिका T3 कॉलम (वाटर्स) में इंजेक्ट किया गया। प्रवाह दर 100 μl/मिनट है, और बफर प्रणाली में बफर A (पानी में 10 mM अमोनियम फॉर्मेट और 0.15% फॉर्मिक एसिड) और बफर B (ACN) शामिल हैं। ग्रेडिएंट इस प्रकार है: 0 मिनट पर 0% B; 0 से 0.1 मिनट पर 0% B; 0 से 0.5 मिनट पर 0 से 15% B; 0.5 से 14 मिनट पर 15 से 17% B; 0.5 से 14 मिनट पर 17 से 55% B; 14 से 14.5 मिनट पर 55 से 70% B; 18 मिनट पर 14.5 से 70 से 100% B। 18 से 19 मिनट पर 100% B; 19 से 19.1 मिनट पर 100 से 0% B; 19.1 से 28 मिनट पर 0% B (55, 56)। QE-HF मास स्पेक्ट्रोमीटर धनात्मक आयनीकरण मोड में m/z (द्रव्यमान/आवेश अनुपात) की 50 से 750 की द्रव्यमान सीमा के साथ संचालित होता है। लागू रिज़ॉल्यूशन 60,000 है, और प्राप्त गेन कंट्रोल (AGC) आयन लक्ष्य 3×10⁶ है, और अधिकतम आयन समय 100 मिलीसेकंड है। हीटेड इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) स्रोत 3.5 kV के स्प्रे वोल्टेज, 250°C के केशिका तापमान, 60 AU (मनमाना इकाई) के शीथ वायु प्रवाह और 20 AU के सहायक वायु प्रवाह पर संचालित होता है। S लेंस को 60 AU पर सेट किया गया है।
13C लेबल वाले कार्बनिक अम्लों का आयन क्रोमेटोग्राफी-एमएस विश्लेषण। शेष मेटाबोलाइट अवक्षेप (55 μl) का विश्लेषण QE-HF मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) से जुड़े डायोनेक्स आयन क्रोमेटोग्राफी सिस्टम (ICS 5000+, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके किया गया। संक्षेप में, 5 μl मेटाबोलाइट अर्क को HPLC (2 mm × 250 mm, कण आकार 4 μm, थर्मो फिशर साइंटिफिक) से सुसज्जित डायोनेक्स आयनपैक AS11-HC कॉलम में पुश-इन पार्शियल लूप मोड में 1 के फिलिंग अनुपात के साथ इंजेक्ट किया गया। इसके बाद डायोनेक्स आयनपैक AG11-HC गार्ड कॉलम (2 mm x 50 mm, 4 μm, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग किया गया। कॉलम का तापमान 30°C पर बनाए रखा गया और ऑटोसेम्प्लर को 6°C पर सेट किया गया। एलुएंट जनरेटर के माध्यम से पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड ग्रेडिएंट उत्पन्न करने के लिए विआयनीकृत जल से युक्त पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड कार्ट्रिज का उपयोग किया गया। 380 μl/min की प्रवाह दर पर मेटाबोलाइट्स का पृथक्करण निम्नलिखित ग्रेडिएंट के साथ किया गया: 0 से 3 मिनट तक 10 mM KOH; 3 से 12 मिनट तक 10 से 50 mM KOH; 12 से 19 मिनट तक 50 से 100 mM KOH; 19 से 21 मिनट तक 100 mM KOH; 21 से 21.5 मिनट तक 100 से 10 mM KOH। कॉलम को 8.5 मिनट के लिए 10 mM KOH के अंतर्गत पुनः संतुलित किया गया।
कॉलम के बाद, इल्यूटेड मेटाबोलाइट्स को 150 μl/min आइसोप्रोपेनॉल सप्लीमेंट स्ट्रीम के साथ मिलाया जाता है और फिर नेगेटिव आयनीकरण मोड में संचालित होने वाले उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर में भेजा जाता है। MS 60,000 के रिज़ॉल्यूशन के साथ m/z 50 से 750 तक की मास रेंज की निगरानी करता है। AGC को 1×10⁶ पर सेट किया गया है, और अधिकतम आयन समय 100 ms रखा गया है। हीटेड ESI स्रोत को 3.5 kV के स्प्रे वोल्टेज पर संचालित किया गया था। आयन स्रोत की अन्य सेटिंग्स इस प्रकार हैं: केशिका तापमान 275°C; शीथ गैस प्रवाह, 60 AU; सहायक गैस प्रवाह, 300°C पर 20 AU, और S लेंस सेटिंग 60 AU।
13C लेबल वाले मेटाबोलाइट्स का डेटा विश्लेषण। आइसोटोप अनुपात के डेटा विश्लेषण के लिए ट्रेसफाइंडर सॉफ़्टवेयर (संस्करण 4.2, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग किया गया। प्रत्येक यौगिक की पहचान एक विश्वसनीय संदर्भ यौगिक द्वारा सत्यापित की गई और स्वतंत्र रूप से विश्लेषण किया गया। आइसोटोप संवर्धन विश्लेषण करने के लिए, प्रत्येक 13C आइसोटोप (Mn) के निष्कर्षित आयन क्रोमैटोग्राम (XIC) के क्षेत्र को [M + H]+ से निकाला गया, जहाँ n लक्ष्य यौगिक की कार्बन संख्या है, जिसका उपयोग अमीनो एसिड के विश्लेषण के लिए किया जाता है या [MH]+ का उपयोग आयनों के विश्लेषण के लिए किया जाता है। XIC की द्रव्यमान सटीकता पाँच पार्ट्स प्रति मिलियन से कम है, और RT की सटीकता 0.05 मिनट है। संवर्धन विश्लेषण प्रत्येक पता लगाए गए आइसोटोप के अनुपात की गणना संबंधित यौगिक के सभी आइसोटोप के योग से करके किया जाता है। ये अनुपात प्रत्येक आइसोटोप के लिए प्रतिशत मान के रूप में दिए गए हैं, और परिणाम मोलर प्रतिशत संवर्धन (MPE) के रूप में व्यक्त किए गए हैं, जैसा कि पहले बताया गया है (42)।
जमे हुए न्यूरॉन पेलेट को बर्फ जैसे ठंडे 80% मेथनॉल (v/v) में समरूपीकृत किया गया, वर्टेक्स किया गया और -20°C पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। नमूने को फिर से वर्टेक्स किया गया और +4°C पर 30 मिनट के लिए हिलाया गया। नमूने को 4°C पर 21,000 g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया, और फिर परिणामी सुपरनेटेंट को एकत्र किया गया और आगे के विश्लेषण के लिए 25°C पर स्पीडवैक कंसंट्रेटर का उपयोग करके सुखाया गया। जैसा कि ऊपर बताया गया है, छांटे गए कोशिकाओं के अमीनो एसिड पर LC-MS विश्लेषण किया गया। ट्रेसफाइंडर (संस्करण 4.2, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके, प्रत्येक यौगिक के मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान का उपयोग करके डेटा विश्लेषण किया गया। मेटाबोलाइट डेटा का क्वांटाइल नॉर्मलाइजेशन प्रीप्रोसेसकोर सॉफ्टवेयर पैकेज (57) का उपयोग करके किया गया।
स्लाइस तैयार करना। चूहे को कार्बन डाइऑक्साइड से तुरंत बेहोश किया गया और उसका सिर काट दिया गया, मस्तिष्क को खोपड़ी से तुरंत निकाल लिया गया, और बर्फ से भरी कंपन करने वाली चाकू (HM-650 V, थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्डोर्फ, जर्मनी) का उपयोग करके इसे 300 से 375 μm के सैजिटल सेक्शन में काटा गया। कोल्ड कार्बन गैसीफिकेशन (95% O2 और 5% CO2) लो Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 और 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 और 310 से 330 mOsm पर समायोजित करें)। प्राप्त मस्तिष्क के टुकड़ों को उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 4.0 mM CaCl2 और 3.5 mM MgCl2) pH 7.4 और 310 से 320 mOsm वाले कक्ष में स्थानांतरित करें। रिकॉर्डिंग से पहले टुकड़ों को 20 से 30 मिनट के लिए रखें ताकि वे अपनी मूल स्थिति में वापस आ सकें।
रिकॉर्डिंग के लिए एक माइक्रोस्कोप स्टेज का उपयोग किया गया था, जिसमें एक निश्चित रिकॉर्डिंग चैम्बर और 20x वाटर इमर्शन ऑब्जेक्टिव लेंस (साइंटिफिका) लगा हुआ था। सभी रिकॉर्डिंग के लिए संभावित पुरकिंजे कोशिकाओं की पहचान (i) शरीर के आकार, (ii) सेरिबेलम की शारीरिक स्थिति और (iii) फ्लोरोसेंट mtYFP रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के आधार पर की गई थी। 5 से 11 मेगाओम के टिप प्रतिरोध वाले पैच पिपेट को बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका (GB150-10, 0.86 मिमी × 1.5 मिमी × 100 मिमी, साइंस प्रोडक्ट्स, हॉफहाइम, जर्मनी) और एक क्षैतिज पिपेट इंस्ट्रूमेंट्स (P-1000, सटर, नोवाटो, कैलिफ़ोर्निया) द्वारा खींचा गया था। सभी रिकॉर्डिंग ELC-03XS npi पैच क्लैंप एम्पलीफायर (npi इलेक्ट्रॉनिक GmbH, टैम, जर्मनी) द्वारा की गई थीं, जिसे सिग्नल सॉफ्टवेयर (संस्करण 6.0, कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक, कैम्ब्रिज, यूके) द्वारा नियंत्रित किया गया था। प्रयोग को 12.5 किलोहर्ट्ज़ की सैंपलिंग दर पर रिकॉर्ड किया गया। सिग्नल को दो शॉर्ट-पास बेसेल फ़िल्टरों द्वारा फ़िल्टर किया गया, जिनकी कटऑफ़ फ़्रीक्वेंसी क्रमशः 1.3 और 10 किलोहर्ट्ज़ थी। झिल्ली और पिपेट की धारिता को एम्पलीफायर का उपयोग करके कंपनसेशन सर्किट द्वारा संतुलित किया गया। सभी प्रयोग ओर्का-फ्लैश 4.0 कैमरे (हमामात्सु, गेर्डन, जर्मनी) के नियंत्रण में किए गए, जिसे होकावो सॉफ़्टवेयर (संस्करण 2.8, हमामात्सु, गेर्डन, जर्मनी) द्वारा नियंत्रित किया गया था।
नियमित संपूर्ण कोशिका विन्यास और विश्लेषण। रिकॉर्डिंग से ठीक पहले, पिपेट को निम्नलिखित पदार्थों से युक्त आंतरिक विलयन से भरें: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM पोटेशियम ग्लूकोनेट, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM गुआनोसिन ट्राइफॉस्फेट (GTP) (Na) और 10.0 mM क्रिएटिनिन फॉस्फेट। pH को 7.25 पर समायोजित किया गया था, और परासरण दाब 290 mOsm (सुक्रोज) था। झिल्ली को तोड़ने के लिए 0 pA का बल लगाने के तुरंत बाद, विश्राम झिल्ली विभव को मापा गया। -40, -30, -20 और -10 pA की अतिध्रुवीकृत धाराएँ लगाकर इनपुट प्रतिरोध को मापा गया। वोल्टेज प्रतिक्रिया के परिमाण को मापें और इनपुट प्रतिरोध की गणना के लिए ओम के नियम का उपयोग करें। वोल्टेज क्लैंप में 5 मिनट के लिए स्वतःस्फूर्त गतिविधि रिकॉर्ड की गई, और अर्ध-स्वचालित पहचान स्क्रिप्ट का उपयोग करके इगोर प्रो (संस्करण 32 7.01, वेवमेट्रिक्स, लेक ओस्वेगो, ओरेगन, यूएसए) में sPSC की पहचान और माप की गई। IV वक्र और स्थिर-अवस्था धारा को बैटरी को विभिन्न विभवों (-110 mV से शुरू) पर क्लैंप करके और वोल्टेज को 5 mV के चरणों में बढ़ाकर मापा गया। AP उत्पादन का परीक्षण एक डीपोलराइजिंग धारा लगाकर किया गया। डीपोलराइजिंग धारा पल्स लगाते समय सेल को -70 mV पर क्लैंप करें। प्रत्येक रिकॉर्डिंग इकाई के चरण आकार को अलग-अलग समायोजित करें (10 से 60 pA)। उच्चतम AP आवृत्ति उत्पन्न करने वाले पल्स स्पाइक्स की मैन्युअल गणना करके अधिकतम AP आवृत्ति की गणना करें। AP थ्रेशोल्ड का विश्लेषण उस डीपोलराइजेशन पल्स के द्वितीय व्युत्पन्न का उपयोग करके किया जाता है जो पहले एक या अधिक AP को ट्रिगर करता है।
छिद्रित पैच विन्यास और विश्लेषण। मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके छिद्रित पैच रिकॉर्डिंग करें। एक एटीपी और जीटीपी रहित पिपेट का उपयोग करें जिसमें निम्नलिखित तत्व न हों: 128 mM ग्लूकोनेट K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA और 2 mM MgCl2, और pH को 7.2 पर समायोजित करें (KOH का उपयोग करके)। कोशिका झिल्ली की अनियंत्रित पारगम्यता को रोकने के लिए इंट्रासेल्युलर घोल से एटीपी और जीटीपी को हटा दिया जाता है। पंच्ड पैच रिकॉर्ड प्राप्त करने के लिए पैच पिपेट को एम्फोटेरिसिन युक्त आंतरिक घोल (लगभग 200 से 250 μg/ml; G4888, सिग्मा-एल्ड्रिच) से भरा जाता है। एम्फोटेरिसिन को डाइमिथाइल सल्फोक्साइड में घोला गया था (अंतिम सांद्रता: 0.1 से 0.3%; DMSO; D8418, सिग्मा-एल्ड्रिच)। अध्ययन किए गए न्यूरॉन्स पर उपयोग किए गए DMSO की सांद्रता का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा। पंचिंग प्रक्रिया के दौरान, चैनल प्रतिरोध (Ra) की लगातार निगरानी की गई, और Ra और AP के आयाम स्थिर होने के बाद (20-40 मिनट) प्रयोग शुरू किया गया। वोल्टेज और/या करंट क्लैंप में 2 से 5 मिनट तक स्वतःस्फूर्त गतिविधि को मापा गया। डेटा विश्लेषण Igor Pro (संस्करण 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (संस्करण 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) और GraphPad Prism (संस्करण 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) का उपयोग करके किया गया। स्वतःस्फूर्त APs की पहचान करने के लिए, IgorPro के NeuroMatic v3.0c प्लग-इन का उपयोग किया गया। दिए गए थ्रेशोल्ड का उपयोग करके APs की स्वचालित रूप से पहचान की गई, जिसे प्रत्येक रिकॉर्ड के लिए व्यक्तिगत रूप से समायोजित किया गया। स्पाइक अंतराल का उपयोग करके, अधिकतम तात्कालिक स्पाइक आवृत्ति और औसत स्पाइक आवृत्ति के साथ स्पाइक आवृत्ति निर्धारित की गई।
पीएन पृथक्करण। पूर्व में प्रकाशित प्रोटोकॉल को अपनाकर, एक निर्दिष्ट चरण (58) पर माउस सेरिबेलम से पीएन को शुद्ध किया गया। संक्षेप में, सेरिबेलम को बर्फ-ठंडे पृथक्करण माध्यम [एचबीएसएस Ca2+ और Mg2+ के बिना, 20 mM ग्लूकोज, पेनिसिलिन (50 U/ml) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.05 mg/ml) के साथ पूरक] में विच्छेदित और बारीक किया गया, और फिर माध्यम को पैपेन [एचबीएसएस, 1-सिस्टीन·एचसीएल (1 mg/ml), पैपेन (16 U/ml) और डीऑक्सीराइबोन्यूक्लेज I (डीएनएज़ I; 0.1 mg/ml) के साथ पूरक] में 30°C पर 30 मिनट के लिए उपचारित किया गया। सबसे पहले, एंजाइमेटिक पाचन को रोकने के लिए, कमरे के तापमान पर अंडे के म्यूकस (10 मिलीग्राम/मिली), बीएसए (10 मिलीग्राम/मिली) और डीएनएज़ (0.1 मिलीग्राम/मिली) युक्त एचबीएसएस माध्यम में ऊतकों को धोएं, और फिर 20 मिलीमी ग्लूकोज युक्त एचबीएसएस माध्यम में धीरे-धीरे पीसकर पेनिसिलिन (50 यू/मिली), स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.05 मिलीग्राम/मिली) और डीएनएज़ (0.1 मिलीग्राम/मिली) को अलग करें। परिणामी कोशिका निलंबन को 70 μm सेल स्ट्रेनर से छान लिया गया, फिर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूगेशन (1110 आरपीएम, 5 मिनट, 4°C) द्वारा पेलेट किया गया और सॉर्टिंग माध्यम [एचबीएसएस, 20 मिलीमी ग्लूकोज, 20% भ्रूण बोवाइन सीरम, पेनिसिलिन (50 यू/मिली) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.05 मिलीग्राम/मिली) के साथ पूरक] में पुनः निलंबित किया गया। प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करके कोशिका व्यवहार्यता का मूल्यांकन करें और कोशिका घनत्व को 1×10⁶ से 2×10⁶ कोशिकाएँ/मिलीलीटर तक समायोजित करें। फ्लो साइटोमेट्री से पहले, सस्पेंशन को 50 μm सेल स्ट्रेनर से छान लें।
फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके 4°C तापमान पर FACSAria III मशीन (BD Biosciences) और FACSDiva सॉफ़्टवेयर (BD Biosciences, संस्करण 8.0.1) की सहायता से कोशिका छँटाई की गई। कोशिका निलंबन को 100 μm नोजल का उपयोग करके 20 psi के दबाव में लगभग 2800 इवेंट/सेकंड की दर से छाँटा गया। चूंकि पारंपरिक गेटिंग मानदंड (कोशिका आकार, द्विमोडल भेदभाव और प्रकीर्णन विशेषताएँ) अन्य प्रकार की कोशिकाओं से PN के सही पृथक्करण को सुनिश्चित नहीं कर सकते, इसलिए गेटिंग रणनीति को mitoYFP+ ​​और नियंत्रण mitoYFP− चूहों में YFP तीव्रता और ऑटोफ्लोरेसेंस की प्रत्यक्ष तुलना के आधार पर निर्धारित किया गया। YFP को 488 nm लेजर लाइन से नमूने को विकिरणित करके उत्तेजित किया गया, और सिग्नल को 530/30 nm बैंड पास फ़िल्टर का उपयोग करके पता लगाया गया। mitoYFP+ ​​चूहों में, Rosa26-mitoYFP रिपोर्टर जीन की सापेक्षिक शक्ति का उपयोग तंत्रिका पिंड और अक्षीय खंडों को अलग करने के लिए भी किया जाता है। 7-AAD को 561 nm पीले लेजर से उत्तेजित किया जाता है और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए 675/20 nm बैंडपास फिल्टर का उपयोग करके इसका पता लगाया जाता है। साथ ही, एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए, कोशिका निलंबन को ACSA-2-APC से रंगा गया, फिर नमूने को 640 nm लेजर लाइन से विकिरणित किया गया, और सिग्नल का पता लगाने के लिए 660/20 nm बैंडपास फिल्टर का उपयोग किया गया।
एकत्रित कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूगेशन (1110 आरपीएम, 5 मिनट, 4°C) द्वारा पेलेट में परिवर्तित किया गया और उपयोग होने तक -80°C पर संग्रहित किया गया। प्रक्रियात्मक भिन्नता को कम करने के लिए Mfn2cKO चूहों और उनके बच्चों का वर्गीकरण एक ही दिन किया गया। FACS डेटा प्रस्तुतिकरण और विश्लेषण FlowJo सॉफ़्टवेयर (FlowJo LLC, एशलैंड, ओरेगन, यूएसए) का उपयोग करके किया गया।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है (59), पुनर्वर्गीकृत न्यूरॉन्स से डीएनए को पृथक करने के लिए रीयल-टाइम पीसीआर का उपयोग किया जाता है, ताकि बाद में एम.टी.एन.ए. की मात्रा निर्धारित की जा सके। रैखिकता और थ्रेशोल्ड संवेदनशीलता का परीक्षण प्रारंभ में विभिन्न संख्या में कोशिकाओं पर क्यूपीसीआर चलाकर किया गया था। संक्षेप में, 50 mM ट्रिस-एचसीएल (pH 8.5), 1 mM ईडीटीए, 0.5% ट्विन 20 और प्रोटीनएज़ K (200 एनजी/एमएल) से युक्त एक लाइसिस बफर में 300 पीएन एकत्र करें और 55°C पर 120 मिनट तक इनक्यूबेट करें। प्रोटीनएज़ K के पूर्ण निष्क्रियकरण को सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को 95°C पर 10 मिनट तक और इनक्यूबेट किया गया। एम.टी.-एनडी1 के लिए विशिष्ट टैकमैन प्रोब (थर्मो फिशर) का उपयोग करके, एम.टी.एन.ए. को 7900HT रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर द्वारा मापा गया। एमटी-एनडी6 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर Mm04225274_s1), एमटी-एनडी6 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर AIVI3E8) और 18एस (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर Hs99999901_s1) जीन।
प्रोटीओम नमूना तैयार करना। लाइसिस बफर [6 M गुआनिडीन क्लोराइड, 10 mM ट्रिस(2-कार्बोक्सीएथिल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड, 10 mM क्लोरोएसेटामाइड और 100 mM ट्रिस-HCl] में घोल को 95°C पर 10 मिनट तक गर्म करके और सोनिकेट करके, जमे हुए न्यूरॉन पेलेट्स को बायोरप्टर (डायजेनोड) पर 10 मिनट (30 सेकंड पल्स / 30 सेकंड पॉज़ अवधि) के लिए लाइसिस किया गया। नमूने को 20 mM ट्रिस-HCl (pH 8.0) में 1:10 के अनुपात में पतला किया गया, 300 ng ट्रिप्सिन गोल्ड (प्रोमेगा) के साथ मिलाया गया और पूर्ण पाचन प्राप्त करने के लिए 37°C पर रात भर इनक्यूबेट किया गया। दूसरे दिन, नमूने को 20,000 g पर 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। सुपरनेटेंट को 0.1% फॉर्मिक एसिड से पतला किया गया और घोल को स्वनिर्मित स्टेजटिप्स से डीसॉल्ट किया गया। नमूने को स्पीडवैक उपकरण (एपेनडॉर्फ कंसंट्रेटर प्लस 5305) में 45°C पर सुखाया गया और फिर पेप्टाइड को 0.1% फॉर्मिक एसिड में निलंबित किया गया। सभी नमूने एक ही व्यक्ति द्वारा एक साथ तैयार किए गए थे। एस्ट्रोसाइट नमूनों का विश्लेषण करने के लिए, 4 माइक्रोग्राम डीसॉल्टेड पेप्टाइड्स को 1:20 के पेप्टाइड से टीएमटी अभिकर्मक अनुपात के साथ एक टैंडम मास टैग (टीएमटी10प्लेक्स, कैटलॉग नंबर 90110, थर्मो फिशर साइंटिफिक) से लेबल किया गया। टीएमटी लेबलिंग के लिए, 0.8 मिलीग्राम टीएमटी अभिकर्मक को 70 μl निर्जल एसीएन में पुनः निलंबित किया गया, और सूखे पेप्टाइड को 9 μl 0.1 M टीईएबी (ट्राईएथिलअमोनियम बाइकार्बोनेट) में पुनर्गठित किया गया, जिसमें एसीएन में 7 μl टीएमटी अभिकर्मक मिलाया गया। सांद्रता 43.75% थी। 60 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद, अभिक्रिया को 2 μl 5% हाइड्रॉक्सिलमाइन से बुझा दिया गया। लेबल किए गए पेप्टाइड को एकत्रित किया गया, सुखाया गया, 200 μl 0.1% फॉर्मिक एसिड (एफए) में पुनः निलंबित किया गया, दो भागों में विभाजित किया गया, और फिर स्व-निर्मित स्टेजटिप्स का उपयोग करके लवण विशोधित किया गया। UltiMate 3000 अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ (UltiMate 3000 अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ) का उपयोग करते हुए, दो हिस्सों में से एक को 1 मिमी x 150 मिमी एक्विटी क्रोमैटोग्राफिक कॉलम पर 130Å1.7μm C18 कणों (वाटर्स, कैटलॉग नंबर SKU: 186006935)। थर्मो फिशर साइंटिफिक से भरे कॉलम पर अलग किया गया। पेप्टाइड्स को 30μl/min की प्रवाह दर पर अलग किया गया। 1% से 50% बफर B को 85 मिनट तक 96 मिनट के चरणबद्ध ग्रेडिएंट के साथ अलग किया गया, फिर 50% से 95% बफर B को 3 मिनट तक और फिर 95% बफर B को 8 मिनट तक अलग किया गया; बफर A में 5% ACN और 10 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट (ABC) है, और बफर B में 80% ACN और 10 mM ABC है। प्रत्येक 3 मिनट में भिन्नों को एकत्र करें और उन्हें दो समूहों (1 + 17, 2 + 18, आदि) में संयोजित करें और उन्हें वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज में सुखाएं।
LC-MS/MS विश्लेषण। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए, पेप्टाइड्स (संख्या r119.aq) को 25 सेमी, 75 μm आंतरिक व्यास वाले पिकोफ्रिट विश्लेषणात्मक कॉलम (नया ऑब्जेक्टिव लेंस, भाग संख्या PF7508250) पर पृथक किया गया, जिसमें 1.9 μm रिप्रोसिल-पुर 120 C18-AQ माध्यम (डॉ. मैश, मैट) का उपयोग किया गया था। इसके लिए EASY-nLC 1200 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, जर्मनी) का उपयोग किया गया। कॉलम को 50°C पर बनाए रखा गया। बफर A और B क्रमशः जल में 0.1% फॉर्मिक एसिड और 80% एसीएन में 0.1% फॉर्मिक एसिड हैं। पेप्टाइड्स को 65 मिनट के लिए 6% से 31% बफर B और 5 मिनट के लिए 31% से 50% बफर B में 200 nl/min के ग्रेडिएंट के साथ पृथक किया गया। इल्यूटेड पेप्टाइड्स का विश्लेषण ऑर्बिट्रैप फ्यूजन मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) पर किया गया। पेप्टाइड प्रीकर्सर m/z माप 350 से 1500 m/z की रेंज में 120,000 के रिज़ॉल्यूशन के साथ किया गया। 27% मानकीकृत टक्कर ऊर्जा का उपयोग करते हुए, 2 से 6 की चार्ज अवस्था वाले सबसे मजबूत प्रीकर्सर को उच्च ऊर्जा C ट्रैप डिसोसिएशन (HCD) क्लीवेज के लिए चुना गया। चक्र समय 1 सेकंड निर्धारित किया गया। पेप्टाइड खंड के m/z मान को आयन ट्रैप में 5×10⁴ के सबसे छोटे AGC लक्ष्य और 86 मिलीसेकंड के अधिकतम इंजेक्शन समय का उपयोग करके मापा गया। विखंडन के बाद, प्रीकर्सर को 45 सेकंड के लिए डायनामिक एक्सक्लूजन सूची में रखा गया। TMT-लेबल वाले पेप्टाइड्स को 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap कॉलम (Thermo Fisher Scientific, कैटलॉग नंबर 164942) पर अलग किया गया, और माइग्रेशन स्पेक्ट्रा का विश्लेषण Orbitrap Lumos Tribrid मास स्पेक्ट्रोमीटर (Thermo Fisher Scientific) पर किया गया, जो हाई-फील्ड एसिमेट्रिक वेवफॉर्म आयन (FAIMS) उपकरण (Thermo Fisher Scientific) से लैस है और -50 और -70 V के दो कंपन वोल्टेज पर संचालित होता है। सिंक्रोनाइज़ेशन प्रीकर्सर के आधार पर चयनित MS3 का उपयोग TMT रिपोर्ट आयन सिग्नल माप के लिए किया गया। पेप्टाइड पृथक्करण EASY-nLC 1200 पर 90% लीनियर ग्रेडिएंट इल्यूशन का उपयोग करके, 6% से 31% की बफर सांद्रता के साथ किया गया; बफर A में 0.1% FA था, और बफर B में 0.1% FA और 80% ACN था। विश्लेषणात्मक कॉलम को 50°C पर संचालित किया गया। FAIMS क्षतिपूर्ति वोल्टेज के अनुसार मूल फ़ाइल को विभाजित करने के लिए FreeStyle (संस्करण 1.6, Thermo Fisher Scientific) का उपयोग करें।
प्रोटीन की पहचान और मात्रा निर्धारण। एकीकृत एंड्रोमेडा सर्च इंजन का उपयोग करते हुए, मूल डेटा का विश्लेषण मैक्सक्वांट संस्करण 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) का उपयोग करके किया गया। एक्वोरिया विक्टोरिया से प्राप्त क्री रिकॉम्बिनेज और वाईएफपी अनुक्रमों के अलावा, माउस संदर्भ प्रोटीओम (प्रोटीओम आईडी UP000000589, मई 2017 में यूनिप्रोट से डाउनलोड किया गया) के मानक अनुक्रम और आइसोफॉर्म अनुक्रम के लिए पेप्टाइड खंड स्पेक्ट्रा की खोज की गई। मेथियोनीन ऑक्सीकरण और प्रोटीन एन-टर्मिनल एसिटिलेशन को परिवर्तनीय संशोधन के रूप में सेट किया गया; सिस्टीन कार्बामॉयल मिथाइलेशन को स्थिर संशोधन के रूप में सेट किया गया। पाचन मापदंडों को "विशिष्टता" और "ट्रिप्सिन/पी" पर सेट किया गया। प्रोटीन पहचान के लिए उपयोग किए जाने वाले पेप्टाइड और रेजर पेप्टाइड की न्यूनतम संख्या 1 है; अद्वितीय पेप्टाइड की न्यूनतम संख्या 0 है। पेप्टाइड मैप मिलान की शर्तों के तहत, प्रोटीन पहचान दर 0.01 थी। “सेकंड पेप्टाइड” विकल्प सक्षम है। विभिन्न मूल फ़ाइलों के बीच सफल पहचानों को स्थानांतरित करने के लिए “मैच बिटवीन रन्स” विकल्प का उपयोग करें। लेबल-मुक्त मात्रा निर्धारण (LFQ) (60) के लिए LFQ न्यूनतम अनुपात गणना 1 का उपयोग करें। LFQ तीव्रता को प्रत्येक समय बिंदु पर कम से कम एक जीनोटाइप समूह में कम से कम दो मान्य मानों के लिए फ़िल्टर किया जाता है, और इसे 0.3 की चौड़ाई और 1.8 की निचली सीमा के साथ एक सामान्य वितरण से एक्सट्रपलेट किया जाता है। LFQ परिणामों का विश्लेषण करने के लिए Perseus कंप्यूटिंग प्लेटफ़ॉर्म (https://maxquant.net/perseus/) और R (https://r-project.org/) का उपयोग करें। विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण (61) के लिए लिम्मा सॉफ़्टवेयर पैकेज से दो-तरफ़ा मध्यम t परीक्षण का उपयोग किया गया था। ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally और pheatmap का उपयोग करके खोजपूर्ण डेटा विश्लेषण किया गया। TMT-आधारित प्रोटिओमिक्स डेटा का विश्लेषण MaxQuant संस्करण 1.6.10.43 का उपयोग करके किया गया था। UniProt के मानव प्रोटिओमिक्स डेटाबेस से रॉ प्रोटिओमिक्स डेटा खोजें, जिसे सितंबर 2018 में डाउनलोड किया गया था। विश्लेषण में निर्माता द्वारा प्रदान किया गया आइसोटोप शुद्धता सुधार कारक शामिल है। विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए R में limma का उपयोग करें। मूल डेटा, डेटाबेस खोज परिणाम, डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह और परिणाम सभी ProteomeXchange गठबंधन में PRIDE पार्टनर रिपॉजिटरी के माध्यम से डेटा सेट पहचानकर्ता PXD019690 के साथ संग्रहीत हैं।
कार्यात्मक एनोटेशन विश्लेषण को समृद्ध करते हैं। 8 सप्ताह के डेटा सेट के कार्यात्मक एनोटेशन शब्दों की प्रचुरता निर्धारित करने के लिए इनजेन्युइटी पाथवे एनालिसिस (QIAGEN) टूल का उपयोग किया गया (चित्र 1)। संक्षेप में, LC-MS/MS (टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री) डेटा विश्लेषण से प्राप्त मात्रात्मक प्रोटीन सूची का उपयोग निम्नलिखित फ़िल्टर मानदंडों के साथ किया गया: प्रजाति और पृष्ठभूमि के रूप में Mus musculus का चयन किया गया, और श्रेणी में बेनजामिनी द्वारा समायोजित P मान 0.05 या उससे कम को महत्वपूर्ण माना गया। इस ग्राफ में, समायोजित P मान के आधार पर प्रत्येक क्लस्टर में शीर्ष पांच अतिरिक्त श्रेणियों को दर्शाया गया है। मल्टीपल t-टेस्ट का उपयोग करते हुए, बेनजामिनी, क्राइगर और येकुटिएली (Q = 5%) के दो-चरणीय रैखिक बूस्ट प्रोग्राम का उपयोग करके, प्रत्येक श्रेणी में पहचाने गए महत्वपूर्ण उम्मीदवारों पर समय-क्रम प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण किया गया, और प्रत्येक पंक्ति का अलग-अलग विश्लेषण किया गया। एक समान मानक विचलन (SD) अपनाने की आवश्यकता नहीं है।
इस अध्ययन के परिणामों की तुलना प्रकाशित डेटाबेस से करने और चित्र 1 में वेन आरेख बनाने के लिए, हमने मात्रात्मक प्रोटीन सूची को माइटोकार्टा 2.0 एनोटेशन (24) के साथ संयोजित किया। आरेख बनाने के लिए ऑनलाइन टूल ड्रॉ वेन डायग्राम (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) का उपयोग करें।
प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली सांख्यिकीय प्रक्रियाओं की विस्तृत जानकारी के लिए, कृपया सामग्री और विधियाँ के संबंधित अनुभाग को देखें। अन्य सभी प्रयोगों के लिए, विस्तृत जानकारी संबंधित विवरण में पाई जा सकती है। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न हो, सभी डेटा माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किए गए हैं, और सभी सांख्यिकीय विश्लेषण GraphPad Prism 8.1.2 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किए गए हैं।
इस लेख के पूरक सामग्री के लिए, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 देखें।
यह एक ओपन एक्सेस लेख है जिसे क्रिएटिव कॉमन्स एट्रीब्यूशन-नॉन-कमर्शियल लाइसेंस की शर्तों के तहत वितरित किया गया है, जो किसी भी माध्यम में इसके उपयोग, वितरण और पुनरुत्पादन की अनुमति देता है, बशर्ते अंतिम उपयोग व्यावसायिक लाभ के लिए न हो और मूल कार्य सही हो। संदर्भ।
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ई. मोटरी, आई. अटानासोव, एसएमवी कोचन, के. फोल्ज़-डोनह्यू, वी. सक्थिवेलु, पी. जियावलीस्को, एन. टोनी, जे. पुयाल, एन.-जी द्वारा। लार्सन
निष्क्रिय न्यूरॉन्स के प्रोटीओमिक्स विश्लेषण से पता चला कि न्यूरोडीजेनरेशन का मुकाबला करने के लिए चयापचय कार्यक्रम सक्रिय हो जाते हैं।
ई. मोटरी, आई. अटानासोव, एसएमवी कोचन, के. फोल्ज़-डोनह्यू, वी. सक्थिवेलु, पी. जियावलीस्को, एन. टोनी, जे. पुयाल, एन.-जी द्वारा। लार्सन
निष्क्रिय न्यूरॉन्स के प्रोटीओमिक्स विश्लेषण से पता चला कि न्यूरोडीजेनरेशन का मुकाबला करने के लिए चयापचय कार्यक्रम सक्रिय हो जाते हैं।
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