वर्तमान†पता: OX11 0DE, यूके, डायमंड बिल्डिंग, हार्वेल साइंस एंड इनोवेशन पार्क, डाइटकोट, ऑक्सफ़ोर्डशायर, यूके, डायमंड लाइट सोर्स कंपनी लिमिटेड, इलेक्ट्रॉनिक बायोलॉजिकल इमेजिंग सेंटर।
रिएक्शन सेंटर लाइट-हार्वेस्टिंग कॉम्प्लेक्स 1 (RC-LH1) बैंगनी प्रकाश संश्लेषी बैक्टीरिया का मुख्य प्रकाश संश्लेषक घटक है। हमने रोडोप्सूडोमोनास पैलुस्ट्रिस से RC-LH1 कॉम्प्लेक्स की दो क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संरचनाएं प्रस्तुत कीं। RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स की 2.65-Å रिज़ॉल्यूशन संरचना में RC के चारों ओर 14 सबयूनिट LH1 लूप होते हैं, जो प्रोटीन W द्वारा बाधित होते हैं, जबकि प्रोटीन-W के बिना कॉम्प्लेक्स पूरी तरह से RC से बना होता है और RC से घिरा होता है। बंद 16 सबयूनिट LH1 लूप भी इसमें शामिल है। इन संरचनाओं की तुलना RC-LH1 कॉम्प्लेक्स में क्विनोन की गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करती है, जिसमें RC QB साइट पर क्विनोन के बंधन के दौरान पहले से अज्ञात संरचनात्मक परिवर्तन, साथ ही सहायक क्विनोन बंधन स्थलों का स्थान भी शामिल है, जो उन्हें RC तक पहुंचाने में मदद करते हैं। डब्ल्यू प्रोटीन की अनूठी संरचना एलएच1 लूप के बंद होने को रोकती है, जिससे क्विनोन/क्विनोलोन विनिमय को तेज करने के लिए एक चैनल बनता है।
प्रकाश संश्लेषण द्वारा प्रदत्त ऊर्जा पृथ्वी पर लगभग सभी जीवन को बनाए रख सकती है, और इसमें सौर जैव प्रौद्योगिकी के लिए अपार संभावनाएं हैं। वैश्विक प्रकाश संश्लेषण को बढ़ावा देने के साथ-साथ, बैंगनी प्रकाशपोषी जीवाणु विभिन्न ऊर्जा विधियों और चयापचय क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं। वे प्रकाश संश्लेषण से बच सकते हैं और अंधेरे में परपोषी जीवाणुओं के रूप में विकसित हो सकते हैं, नाइट्रोजन और कार्बन डाइऑक्साइड को स्थिर कर सकते हैं, हाइड्रोजन का उत्पादन कर सकते हैं और सुगंधित यौगिकों का अपघटन कर सकते हैं (1-3)। इन प्रक्रियाओं के लिए ऊर्जा प्रदान करने हेतु, प्रकाश को शीघ्रता और कुशलता से रासायनिक ऊर्जा में परिवर्तित किया जाना आवश्यक है। यह प्रक्रिया तब शुरू होती है जब प्रकाश-अवशोषित करने वाला एंटेना कॉम्प्लेक्स प्रकाश को अवशोषित करता है और अवशोषित ऊर्जा को अभिक्रिया केंद्र (RC) में स्थानांतरित करता है, जिससे आवेश पृथक्करण शुरू होता है (4-7)। बैंगनी प्रकाशपोषी जीवाणुओं में प्रकाश संश्लेषण की मूल इकाई टाइप 2 RC से बनी होती है, जो प्रकाश-कटाई कॉम्प्लेक्स 1 (LH1) से घिरी होती है, जिससे RC-LH1 कोर कॉम्प्लेक्स बनता है। LH1 घुमावदार αβ हेटेरोडिमर्स की एक श्रृंखला से बनता है, जिनमें से प्रत्येक दो बैक्टीरियल क्लोरोफिल (BChl) a अणुओं और एक या दो कैरोटीनॉयड (8-12) को बांधता है। सबसे सरल LH1 एंटीना में 16 या 17 αβ हेटेरोडिमर्स होते हैं जो एक बंद लूप में RC (9-13) को घेरते हैं, लेकिन अन्य कोर कॉम्प्लेक्स में, ट्रांसमेम्ब्रेन पेप्टाइड आसपास के LH1 की निरंतरता को बाधित करते हैं, जिससे RC और साइटोक्रोम bc1 कॉम्प्लेक्स (11, 13-15) के बीच क्विनोल/क्विनोन प्रसार को बढ़ावा मिलता है। बैंगनी प्रकाशपोषी पौधा रोडोप्सूडोमोनास (Rps.) एक मॉडल जीव है जो प्रकाश संश्लेषण का समर्थन करने वाले ऊर्जा और इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण को समझने में मदद कर सकता है। Rps. की पहली क्रिस्टल संरचना। पैलुस्ट्रिस RC-LH1 कॉम्प्लेक्स का मॉडल RC है, जो 15 हेटरोडाइमेरिक LH1 लूप से घिरा हुआ है, और ये लूप "प्रोटीन W" नामक एक अज्ञात प्रोटीन द्वारा बाधित होते हैं (14)। प्रोटीन-W को बाद में RPA4402 के रूप में पहचाना गया, जो एक अज्ञात 10.5kDa प्रोटीन है जिसमें तीन अनुमानित ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स (TMH) होते हैं (16)। हम प्रोटीन W को एनकोड करने वाले rpa4402 जीन का नाम बदलकर pufW रखने का प्रस्ताव करते हैं ताकि यह RC-L, M (pufL, pufM) और LH1α, β (pufA, pufB) सबयूनिट्स को एनकोड करने वाले जीनों के नामकरण के अनुरूप हो। दिलचस्प बात यह है कि प्रोटीन-W केवल लगभग 10% RC-LH1 में मौजूद होता है, जिससे पता चलता है कि Rps. palustris दो अलग-अलग RC-LH1 कॉम्प्लेक्स बनाता है। यहां, हम दो कोर कॉम्प्लेक्स की उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम (Cryo-EM) संरचनाओं की रिपोर्ट प्रस्तुत करते हैं, जिनमें से एक में प्रोटीन W और 14 αβ हेटेरोडिमर हैं, जबकि दूसरे में प्रोटीन W नहीं है और एक बंद 16 हेटेरोडिमर LH1 लूप है। हमारी संरचना Rps. palustris के RC-LH1 कॉम्प्लेक्स की समझ में एक महत्वपूर्ण बदलाव का प्रतिनिधित्व करती है, क्योंकि हमने प्रत्येक वेरिएंट की समरूप आबादी का विश्लेषण किया है और प्रत्येक पेप्टाइड और बंधे हुए पिगमेंट, संबंधित लिपिड और क्विनोन को स्पष्ट रूप से निर्धारित करने के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया है। इन संरचनाओं की तुलना से पता चलता है कि तीन TMH प्रोटीन-W, जो अब तक किसी अन्य RC-LH1 कॉम्प्लेक्स में नहीं पाए गए हैं, क्विनोन/क्विनोलोन विनिमय को गति देने के लिए एक क्विनोन चैनल उत्पन्न करते हैं। कई संरक्षित लिपिड और क्विनोन बंधन स्थलों की पहचान की गई है, और हमने क्विनोन और RC के संयोजन के बाद एक नए संरचनात्मक परिवर्तन का खुलासा किया है, जो ऑक्सीजन युक्त प्रकाश संश्लेषी जीवों के फोटोसिस्टम II (PSII) RC के लिए उपयुक्त हो सकता है। हमारे निष्कर्ष बैंगनी प्रकाशपोषी जीवाणुओं के RC-LH1 कोर कॉम्प्लेक्स में क्विनोन/क्विनोलोन बंधन और विनिमय की गतिकी के बारे में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
Rps. palustris में पाए जाने वाले दो संकुलों के विस्तृत अध्ययन को सुगम बनाने के लिए, हम प्रत्येक RC-LH1 को जैव रासायनिक विधियों द्वारा पृथक करते हैं। प्रोटीन W-रहित संकुल (जिसे आगे ΔpufW कहा जाएगा) को pufW जीन (16) की कमी वाले उपभेद से शुद्ध किया गया था, और केवल एक RC-LH1 संकुल का उत्पादन किया जा सकता है। प्रोटीन W युक्त संकुल का उत्पादन एक उपभेद द्वारा किया जाता है। इस उपभेद के प्रोटीन W को इसके C-टर्मिनस पर 10x His टैग के साथ संशोधित किया जाता है, ताकि प्रोटीन W युक्त संकुल को धातु को स्थिर करके अधिकांश प्रोटीन W की कमी वाले संकुल के साथ प्रभावी ढंग से जोड़ा जा सके। संकुल को एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी (IMAC) (16) द्वारा प्रभावी ढंग से पृथक किया जाता है।
चित्र 1 में दर्शाए अनुसार, दोनों कॉम्प्लेक्स में एक तीन उप-इकाई RC (RC-L, RC-M और RC-H) होती है जो एक LH1 एंटीना से घिरी होती है। प्रोटीन-W रहित कॉम्प्लेक्स की 2.80Å संरचना में 16 αβ हेटेरोडिमर दिखाई देते हैं, जो RC को पूरी तरह से घेरते हुए एक बंद LH1 लूप बनाते हैं, जिसे आगे RC-LH116 कॉम्प्लेक्स कहा जाएगा। प्रोटीन-W युक्त कॉम्प्लेक्स की 2.65Å संरचना में प्रोटीन-W द्वारा बाधित 14-हेटेरोडिमर LH1 होता है, जिसे आगे RC-LH114-W कहा जाएगा।
(A और B) यौगिक का सतही निरूपण। (C और D) छड़ों के रूप में बंधित रंजकों को दर्शाया गया है। (E और F) कोशिका प्लाज्मिक सतह से देखे गए संकुलों में पेप्टाइड और LH1 उप-इकाइयों को कार्टूनों में दर्शाया गया है, और प्रोटीन-W अंतराल से दक्षिणावर्त क्रम में क्रमांकित किया गया है [Rba स्फेरोइड्स संकुल (13) के अनुरूप]। LH1-α के लिए, प्रोटीन उप-इकाई का रंग पीला है; LH1-β के लिए, प्रोटीन उप-इकाई का रंग नीला है; प्रोटीन-W के लिए, प्रोटीन लाल है; RC-H के लिए, यह सियान है; RC-L के लिए, यह नारंगी है; RC-M के लिए, मैजेंटा है। सहकारकों को छड़ों द्वारा दर्शाया गया है, हरा रंग BChl और BPh a अणुओं को दर्शाता है, बैंगनी रंग कैरोटीनॉयड को दर्शाता है, और पीला रंग UQ10 अणुओं को दर्शाता है। (G और H) RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स (G) और RC-LH116 कॉम्प्लेक्स (H) के समतुल्य क्षेत्र में प्रोटीन-W गैप का आवर्धित दृश्य। कोफ़ैक्टर को रिक्त स्थान भरने के रूप में दर्शाया गया है, और चेलेटेड क्विनोन को नीले रंग में दिखाया गया है। (G) में प्रोटीन-W गैप को नीली धरातल वाली रेखा से हाइलाइट किया गया है, और (H) में LH116 रिंग पर क्विनोन/क्विनोलोल के प्रसार वाले छोटे छिद्रों को काली धरातल वाली रेखा से हाइलाइट किया गया है।
चित्र 1 (A और B) में RC को LH1αβ हेटेरोडिमर के खुले या बंद सरणियों से घिरा हुआ दिखाया गया है, जिनमें से प्रत्येक दो BChl और एक कैरोटीनॉयड को बांधता है (चित्र 1, C और D)। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि Rps, LH1 कॉम्प्लेक्स है। स्पिरुलिना ज़ैंथिन के जैवसंश्लेषण मार्ग में, इन प्रजातियों में कैरोटीनॉयड की मिश्रित आबादी होती है (17)। हालांकि, स्पाइरोपाइरोक्सैंथिन प्रमुख कैरोटीनॉयड है और इसका घनत्व संतोषजनक है। इसलिए, हमने सभी LH1 बंधन स्थलों पर स्पाइरोक्सैंथिन को मॉडल करने का विकल्प चुना। अल्फा और बीटा पॉलीपेप्टाइड छोटे झिल्ली बाहरी क्षेत्रों के साथ एकल TMH हैं (चित्र 1, A, B, E और F)। हालांकि C-टर्मिनस पर 17 अवशेषों का घनत्व नहीं देखा गया, अल्फा पॉलीपेप्टाइड को दोनों कॉम्प्लेक्स में Met1 से Ala46 तक विभाजित किया गया था। RC-LH116 में β पॉलीपेप्टाइड ग्लाइसिन 4 से टायरोसिन 52 तक और RC-LH114-W में सेरिन 5 से टायरोसिन 52 तक कम हो गया था। 3 या 4 एन-टर्मिनल या 13 सी-टर्मिनल अवशेषों का कोई घनत्व नहीं देखा गया (चित्र S1)। वाइल्ड-टाइप स्ट्रेन से तैयार किए गए मिश्रित RC-LH1 कॉम्प्लेक्स के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पता चला कि लुप्त क्षेत्र इन पेप्टाइडों के हेटेरोलॉगस क्लीवेज का परिणाम था (चित्र S1 और S2)। α-Met1 का एन-टर्मिनल फॉर्मिलेशन भी देखा गया (f)। विश्लेषण से पता चला कि α-पेप्टाइड में fMet1 से एस्प 42/एला 46/एला 47/एला 50 तक के अवशेष होते हैं, और β-पेप्टाइड में सेरिन 2 से एला 53 तक के अवशेष होते हैं, जो कम तापमान वाले EM घनत्व मानचित्र के साथ अच्छी तरह से मेल खाता है।
α-His29 और β-His36 का समन्वय BChls को आमने-सामने लाता है; प्रत्येक αβ हेटेरोडाइमर अपने पड़ोसियों के साथ मिलकर RC के चारों ओर एक खुला लूप (RC-LH114-W) या एक बंद लूप (RC-LH116) बनाता है। यह एक्सिटॉन युग्मित पिगमेंट सरणी (चित्र 1, C और D) है। RC-LH114-W के 877 nm बैंड की तुलना में, RC-LH116 का 880 nm अवशोषण रेड शिफ्ट 3 nm है (चित्र 2A)। हालांकि, वृत्ताकार डाइक्रोइज़्म स्पेक्ट्रम लगभग समान है (चित्र 2B), जो दर्शाता है कि खुले और बंद लूपों के बीच स्पष्ट अंतर होने के बावजूद, BChls का स्थानीय वातावरण बहुत समान है। अवशोषण रेडशिफ्ट कम थर्मल गति और बंद लूप पर बढ़ी हुई स्थिरता (18, 19), बंद लूप के कारण वर्णक युग्मन में परिवर्तन (20, 21), या इन दो प्रभावों के संयोजन (11) का परिणाम हो सकता है।
(A) पराबैंगनी/दृश्य/निकट-अवरक्त अवशोषण स्पेक्ट्रम, जिसके शिखरों को उनके संबंधित वर्णकों से चिह्नित किया गया है और 775 nm पर BPh शिखर के सापेक्ष सामान्यीकृत किया गया है। (B) 805 nm पर BChl अवशोषण के सापेक्ष सामान्यीकृत वृत्ताकार डाइक्रोइज़्म स्पेक्ट्रम। (C और D) RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स (C) और RC-LH116 कॉम्प्लेक्स (D) के समय-समाधानित अवशोषण स्पेक्ट्रम से चयनित ΔA स्पेक्ट्रम। बेहतर तुलनात्मकता के लिए, सभी स्पेक्ट्रम को 0.2 ps पर −A के ∆A के सापेक्ष सामान्यीकृत किया गया है। (E) UQ2 की विभिन्न सांद्रताओं की उपस्थिति में विकिरण के बाद साइटोक्रोम c2 ऑक्सीकरण की दर (कच्चे डेटा के लिए चित्र S8 देखें)। (F) कम, मध्यम या उच्च तीव्रता वाले प्रकाश (क्रमशः 10, 30 या 300 μMm-2 s-1) में विकसित कोशिकाओं में, शुद्ध किए गए कॉम्प्लेक्स और पृथक झिल्ली में प्रोटीन W और RC-L उप-इकाइयों का अनुपात ज्ञात कीजिए। SDS-पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और इम्यूनोएसे द्वारा प्रोटीन स्तर निर्धारित कीजिए (कच्चे डेटा के लिए चित्र S9 देखें)। शुद्ध किए गए RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स के सापेक्ष अनुपात निर्धारित कीजिए। कॉम्प्लेक्स में RC-L और प्रोटीन-W का स्टोइकोमेट्रिक अनुपात 1:1 है।
RC-LH114-W के विकृत αβ14 लूप में स्थिति 1 पर स्थित BChls (चित्र 1, A, C, और E) RC प्राथमिक दाता (P) से RC-LH116 में समतुल्य BChls (चित्र 1, B, D, और F, और चित्र S3) की तुलना में 6.8Å अधिक निकट हैं; हालाँकि, दोनों कॉम्प्लेक्सों की क्षणिक अवशोषण गतिकी दर्शाती है कि RC-LH114-W और RC-LH116 के लिए, LH1 से RC तक उत्तेजना ऊर्जा स्थानांतरण समय स्थिरांक क्रमशः 40 ±4 और 44 ±3 ps हैं (चित्र 2, C और D, चित्र S4 और तालिका S2)। RC के भीतर इलेक्ट्रॉनिक स्थानांतरण में भी कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है (चित्र S5 और संबंधित पूरक पाठ)। हमें संदेह है कि LH1 और RC-P के बीच ऊर्जा स्थानांतरण समय की निकटता का कारण दोनों LH1 लूपों में अधिकांश BChl की समान दूरी, कोण और संभावित ऊर्जा है। ऐसा प्रतीत होता है कि न्यूनतम दूरी तक पहुँचने के लिए LH1 ऊर्जा पैटर्न का अन्वेषण करना, उप-इष्टतम स्थलों से RC तक प्रत्यक्ष ऊर्जा स्थानांतरण की तुलना में तेज़ नहीं है। संरचनात्मक विश्लेषण के लिए, RC-LH114-W में खुला-लूप LH1 लूप कम तापमान की स्थितियों में नगण्य तापीय गति से गुजर सकता है, और RC 1 की स्थिति पर βBChls की रंजकता दूरी से कमरे के तापमान पर एक लंबी αβ14 रिंग संरचना होती है।
RC-LH116 कॉम्प्लेक्स में 32 BChls और 16 कैरोटीनॉयड होते हैं, और इसकी समग्र संरचना थर्मोक्रोमैटियम (Tch.) पिडपिडम [प्रोटीन डेटा बैंक (PDB) ID 5Y5S] (9), थिओरोडोविब्रियो (Trv.) 970 स्ट्रेन (PDB ID 7C9R) (12) और हरे शैवाल (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) से प्राप्त संरचना के समान है। संरेखण के बाद, αβ हेटेरोडिमर की स्थिति में केवल छोटे विचलन देखे गए, विशेष रूप से 1-5, 15 और 16 (चित्र S6)। प्रोटीन-W की उपस्थिति LH1 की संरचना पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालती है। इसके तीन TMH छोटे लूप से जुड़े होते हैं, जिसमें N-टर्मिनल कॉम्प्लेक्स के ल्यूमेन की ओर और C-टर्मिनल साइटोप्लाज्मिक की ओर होता है (चित्र 1A और 3, A से D)। प्रोटीन-W मुख्य रूप से जल-विरोधी होता है (चित्र 3B), और TMH2 और TMH3, LH1αβ-14 के साथ परस्पर क्रिया करके एक पार-झिल्लीदार सतह बनाते हैं (चित्र 3, B और E से G)। यह इंटरफ़ेस मुख्य रूप से पार-झिल्लीदार क्षेत्र में Phe, Leu और Val अवशेषों से बना होता है। ये अवशेष जल-विरोधी अमीनो अम्लों और αβ-14 वर्णकों के साथ जुड़े होते हैं। कुछ ध्रुवीय अवशेष भी इस परस्पर क्रिया में योगदान करते हैं, जिनमें जटिल गुहा की सतह पर W-Thr68 और β-Trp42 के बीच हाइड्रोजन बंध शामिल है (चित्र 3, F और G)। कोशिका द्रव्य की सतह पर, Gln34, αβ-14 कैरोटीनॉयड के कीटो समूह के निकट स्थित होता है। इसके अतिरिक्त, एन-डोडिसिल β-डी-माल्टोसाइड (β-डीडीएम) अणु का विभेदन किया गया, और इसकी हाइड्रोफोबिक पूंछ प्रोटीन-डब्ल्यू और αβ-14 के बीच के इंटरफ़ेस तक फैली हुई थी, और लिपिड पूंछ शरीर में स्थित हो सकती है। हमने यह भी देखा कि प्रोटीन डब्ल्यू और आरसीएच के सी-टर्मिनल विभेदन क्षेत्र बहुत निकट हैं, लेकिन विशिष्ट अंतःक्रियाएँ बनाने की सीमा में नहीं हैं (चित्र 1, ए और ई)। हालांकि, इन दोनों प्रोटीनों के अविभेदित सी-टर्मिनल अमीनो अम्लों में अंतःक्रियाएँ हो सकती हैं, जो आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स के संयोजन के दौरान प्रोटीन-डब्ल्यू की भर्ती के लिए एक तंत्र प्रदान कर सकती हैं।
(A) कार्टून रूप में LH1αβ14 के साथ इंटरफ़ेस का सामना करने वाले प्रोटीन-W में एक छड़ के आकार की पार्श्व श्रृंखला (लाल) है, जिसे इलेक्ट्रोस्टैटिक पोटेंशियल आरेख के एक भाग (0.13 के कंटूर स्तर वाली पारदर्शी धूसर सतह) में दर्शाया गया है। (B) प्रोटीन-W को एक जल-विरोधी रंगीन सतह द्वारा दर्शाया गया है। ध्रुवीय और आवेशित क्षेत्रों को सियान रंग में, जल-विरोधी क्षेत्रों को सफेद रंग में और अत्यधिक जल-विरोधी क्षेत्रों को नारंगी रंग में दर्शाया गया है। (C और D) कार्टून रूप में प्रोटीन-W को दर्शाया गया है, इसका अभिविन्यास (C) में (A) के समान है, और (D) में 180° घुमाया गया है। अनुक्रम में स्थिति के अनुसार, पहचानने योग्य अवशेषों को इंद्रधनुषी रंग योजना में दर्शाया गया है, जहाँ N-टर्मिनल नीला और C-टर्मिनल लाल है। (E) प्रोटीन-W को (A) के समान दृश्य में दर्शाया गया है, और प्रोटीन-W:LH1 के इंटरफ़ेस पर अवशेषों को संलग्न चिह्नों के साथ छड़ों द्वारा दर्शाया गया है। (F) कार्टून निरूपण में प्रोटीन-W को (E) और LH1αβ14 के सापेक्ष 90° घुमाया गया है, और बार निरूपण में इंटरफ़ेस अवशेषों के सापेक्ष घुमाया गया है। बीटा पॉलीपेप्टाइड से लटके हुए अवशेषों को चिह्नित किया गया है। कोफ़ैक्टर को चित्र 1 के रंग से मेल खाने वाले बार के रूप में दिखाया गया है, विघटित β-DDM को धूसर रंग में और ऑक्सीजन को लाल रंग में दिखाया गया है। (G) (F) में दिखाए गए दृश्य को 180° घुमाया गया है, जिसमें चिह्नित अल्फा पॉलीपेप्टाइड के प्रमुख अवशेष दिखाई दे रहे हैं।
प्रोटीन-W एक αβ हेटेरोडाइमर (चित्र 1F में 15वां) को प्रतिस्थापित करता है, जिससे लूप का बंद होना रुक जाता है और पहले तीन αβ हेटेरोडाइमर झुक जाते हैं। यह देखा गया कि फिल्म नॉर्मल के सापेक्ष पहले αβ-1 हेटेरोडाइमर का अधिकतम झुकाव कोण 25° से 29° था (चित्र 1, A और E), जो RC A शार्प कंट्रास्ट-LH116 में αβ-1 के 2° से 8° के झुकाव से बना था (चित्र 1, B और F)। दूसरे और तीसरे हेटेरोडाइमर क्रमशः 12° से 22° और 5° से 10° पर झुके हुए हैं। RC के स्टीयरिक अवरोध के कारण, αβ-1 का झुकाव αβ के दूसरे जोड़े (जो चित्र 1F में 16वें αβ के अनुरूप है) को शामिल नहीं करता है, जिससे LH1 रिंग में एक स्पष्ट अंतराल बन जाता है (चित्र 1, A और E)। दो αβ हेटेरोडिमर की कमी, साथ ही चार BChl और दो कैरोटीनॉयड के नुकसान के कारण, कोई भी कैरोटीनॉयड मुड़े हुए αβ-1 सबयूनिट से नहीं जुड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप LH114-W रिंग में 13 कैरोटीनॉयड और 28 BChl होते हैं। αβ1 से 7 क्षेत्रों में दो कॉम्प्लेक्स के स्थानीय रिज़ॉल्यूशन अनुमान LH1 लूप के बाकी हिस्सों की तुलना में कम हैं, जो RC QB साइट के निकट स्थित LH1 सबयूनिट की अंतर्निहित प्लास्टिसिटी को दर्शा सकते हैं (चित्र 4)।
चित्र RC-LH114-W (A और B) तथा RC-LH116 (C और D) की तस्वीरें चित्र 1 के समान शीर्ष दृश्य/पार्श्व दृश्य (A और B) (A और C) और गुहा सतह (B और D) से दिखाई गई हैं। रंगीन कुंजियाँ दाईं ओर दिखाई गई हैं।
1:14 के स्टोइकोमेट्रिक अनुपात वाला एकमात्र अन्य विशिष्ट कोर कॉम्प्लेक्स रोडोकोकस स्फेरोइड्स (Rba.) RC-LH1-PufX डाइमर (13) है। हालाँकि, प्रोटीन W और PufX में कोई स्पष्ट समरूपता नहीं है, और उनकी संबंधित LH1 संरचनाओं पर इनका महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। PufX एक एकल TMH है जिसमें एक N-टर्मिनल साइटोप्लाज्मिक डोमेन होता है जो Rps. palustris LH116αβ-16 के अनुरूप स्थिति पर RC-H सबयूनिट (13) के साइटोप्लाज्मिक पक्ष के साथ इंटरैक्ट करता है। PufX, RC-LH1 और साइटोक्रोम bcl कॉम्प्लेक्स के बीच क्विनोन/क्विनोलोन विनिमय के लिए एक चैनल बनाता है और सभी Rba. sphaeroides कोर कॉम्प्लेक्स (13) में मौजूद होता है। हालाँकि मोनोमर-मोनोमर इंटरफ़ेस Rba. स्फेरोइड्स RC-LH1-PufX डाइमर, RC-LH114-W में प्रोटीन W के बंधन स्थान पर स्थित है, और PufX और प्रोटीन-W द्वारा प्रेरित अंतराल एक समतुल्य स्थिति पर है (चित्र S7A)। RC-LH114-W में अंतराल, स्यूडोमोनास रोजिया LH1 के काल्पनिक क्विनोन चैनल (8) के साथ भी संरेखित है, जो प्रोटीन W या PufX से संबंधित नहीं पेप्टाइड्स द्वारा निर्मित है (चित्र S7B)। इसके अतिरिक्त, Blc. एमराल्ड ग्रीन LH1 में क्विनोन चैनल, जो एक γ सबयूनिट (7) को छोड़कर निर्मित होता है, एक समान स्थिति में स्थित है (चित्र S7C)। यद्यपि विभिन्न प्रोटीनों द्वारा मध्यस्थता की जाती है, RC-LH1 कॉम्प्लेक्स में एक सामान्य स्थिति में इन क्विनोन/क्विनोलोल चैनलों की उपस्थिति अभिसारी विकास का एक उदाहरण प्रतीत होती है, जो इंगित करता है कि प्रोटीन W द्वारा निर्मित अंतराल एक क्विनोन चैनल के रूप में कार्य कर सकता है।
LH114-W लूप में मौजूद अंतराल, प्रोटीन की तरह प्रोटीन छिद्र के माध्यम से दो डोमेन को जोड़ने के बजाय, RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स के आंतरिक स्थान और बल्क झिल्ली के बीच एक सतत झिल्ली क्षेत्र के निर्माण की अनुमति देता है (चित्र 1G)। RC-LH116 कॉम्प्लेक्स एक बंद Tch. नीडल-जैसे कॉम्प्लेक्स (22) के समान है (चित्र 1H)। चूंकि झिल्ली के माध्यम से क्विनोन का प्रसार संकीर्ण प्रोटीन चैनल के माध्यम से प्रसार की तुलना में तेज़ होता है, इसलिए खुला LH114-W लूप बंद LH116 लूप की तुलना में तेज़ RC टर्नओवर की अनुमति दे सकता है, और RC में क्विनोन का प्रसार अधिक प्रतिबंधित हो सकता है। यह परीक्षण करने के लिए कि क्या प्रोटीन W, RC के माध्यम से क्विनोन के रूपांतरण को प्रभावित करता है, हमने यूबिक्विनोन 2 (UQ2) (एक छोटे आइसोप्रीन टेल के साथ प्राकृतिक UQ10 का एक एनालॉग) की एक निश्चित सांद्रता पर साइटोक्रोम ऑक्सीकरण परख किया (चित्र 2E)। हालांकि चेलेटेड क्विनोन की उपस्थिति स्पष्ट माइकलिस स्थिरांक के सटीक निर्धारण में बाधा डालती है (RC-LH114-W और RC-LH116 क्रमशः 0.2 ± 0.1 μM और 0.5 ± 0.2 μM के लिए उपयुक्त हैं), RC-LH114-W (4.6 ± 0.2 e-RC-1 s-1) की अधिकतम दर RC-LH116 (3.6 ± 0.1 e-RC-1 s-1) से 28 ± 5% अधिक है।
हमने शुरू में अनुमान लगाया था कि प्रोटीन-W कोर कॉम्प्लेक्स (16) के लगभग 10% में मौजूद है; यहाँ, कम प्रकाश, मध्यम प्रकाश और उच्च प्रकाश वृद्धि कोशिकाओं की अधिभोग दरें क्रमशः 15±0.6%, 11±1% और 0.9±0.5% हैं (चित्र 2F)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री की मात्रात्मक तुलना से पता चला कि हिस्टिडीन टैग के जुड़ने से जंगली-प्रकार के उपभेदों की तुलना में प्रोटीन-W की सापेक्ष प्रचुरता कम नहीं हुई (P = 0.59), इसलिए ये स्तर संशोधित प्रोटीन-W का कोई कृत्रिम प्रभाव नहीं हैं (चित्र S10)। हालांकि, RC-LH1 कॉम्प्लेक्स में प्रोटीन-W की यह कम अधिभोग दर कुछ RCs को त्वरित दर से फ्लिप करने की अनुमति दे सकती है, जिससे RC-LH116 कॉम्प्लेक्स में धीमे क्विनोन/क्विनोलोन विनिमय को कम किया जा सकता है। हमने देखा कि उच्च प्रकाश अधिभोग दर हाल के ट्रांसक्रिप्टोमिक्स डेटा के साथ असंगत है, जो दर्शाता है कि तेज रोशनी में pufW जीन अभिव्यक्ति बढ़ जाती है (चित्र S11) (23)। pufW प्रतिलेखन और प्रोटीन-W के RC-LH1 कॉम्प्लेक्स में समावेश के बीच का अंतर भ्रामक है और यह प्रोटीन के जटिल विनियमन को प्रतिबिंबित कर सकता है।
RC-LH114-W में, 6 कार्डियोलिपिन (CDL), 7 फॉस्फेटिडिलकोलीन (POPC), 1 फॉस्फेटिडिलग्लिसरॉल (POPG) और 29 β-DDM अणु आवंटित किए गए हैं और इसमें 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG और 12 βDDM अणुओं को मॉडल किया गया है। RC-LH116 (चित्र 5, A और B) में, CDL लगभग कॉम्प्लेक्स के साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर स्थित है, जबकि POPC, POPG और β-DDM अधिकतर ल्यूमिनल पक्ष पर स्थित हैं। RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स के αβ-1 से αβ-6 क्षेत्र में दो लिपिड और डिटर्जेंट अणु पृथक किए गए (चित्र 5A), और RC-LH116 के समतुल्य क्षेत्र में पाँच पृथक किए गए (चित्र 5B)। कॉम्प्लेक्स के दूसरी तरफ अधिक लिपिड पाए गए, मुख्य रूप से सीडीएल, जो आरसी और αβ-7 से αβ-13 के बीच जमा हुए (चित्र 5, ए और बी)। अन्य संरचनात्मक रूप से हल किए गए लिपिड और डिटर्जेंट एलएच1 रिंग के बाहर स्थित हैं, और अच्छी तरह से हल की गई एसिल श्रृंखलाएं एलएच1 सबयूनिट्स के बीच फैली हुई हैं, जिन्हें आरसी-एलएच114-डब्ल्यू में अस्थायी रूप से β-डीडीएम के रूप में नामित किया गया है, और आरसी में β-डीडीएम और पीओपीसी-एलएच116 के मिश्रण के रूप में परिभाषित किया गया है। हमारी संरचना में कीलेटिंग लिपिड और डिटर्जेंट की समान स्थिति इंगित करती है कि वे शारीरिक रूप से प्रासंगिक बंधन स्थल हैं (चित्र एस12ए)। टीसीएच में समतुल्य अणुओं की स्थिति में भी अच्छी संगति है। जेंटल और टीआरवी। स्ट्रेन 970 आरसी-एलएच1 (चित्र एस12, बी से ई) (9, 12) और लिपिड हेड समूह के हाइड्रोजन-बॉन्डिंग अवशेषों ने अनुक्रम संरेखण (चित्र एस13) में काफी अच्छा संरक्षण दिखाया, यह दर्शाता है कि संरक्षित सीडीएल जो आरसी (24) से बंधता है, ये साइटें आरसी-एलएच1 कॉम्प्लेक्स में संरक्षित हो सकती हैं।
(A और B) RC-LH114-W (A) और RC-LH116 (B) पेप्टाइड को कार्टून के रूप में दर्शाया गया है, और पिगमेंट को छड़ों के रूप में, चित्र 1 में दी गई रंग योजना का उपयोग करते हुए। लिपिड को लाल रंग में और डिटर्जेंट को धूसर रंग में दिखाया गया है। RC QA और QB साइटों से बंधा UQ पीले रंग में है, जबकि पृथक UQ नीले रंग में है। (C और D) (A) और (B) के समान दृश्य, जिनमें लिपिड को हटा दिया गया है। (E से G) RC-LH116 से Q1(E), Q2(F) और Q3(G) का आवर्धित दृश्य, जिसमें एक दूसरे को प्रभावित करने वाली पार्श्व श्रृंखलाएं दिखाई गई हैं। हाइड्रोजन बंधों को काली धरातल वाली रेखाओं के रूप में दर्शाया गया है।
RC-LH116 में, आवेश पृथक्करण प्रक्रिया में इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण में भाग लेने वाले RC QA और QB UQ दोनों अपने बंधन स्थलों में विघटित हो जाते हैं। हालाँकि, RC-LH114-W में, QB क्विनोन का स्पष्ट विश्लेषण नहीं हो पाया है और इस पर नीचे विस्तार से चर्चा की जाएगी। QA और QB क्विनोन के अतिरिक्त, दो कीलेटेड UQ अणु (RC और LH1 वलयों के बीच स्थित) को RC-LH114-W संरचना में उनके स्पष्ट रूप से विभेदित शीर्ष समूहों (क्रमशः Q1 और Q2 में स्थित) के अनुसार स्थान दिया गया है (चित्र 5C)। दो आइसोप्रीन इकाइयों को Q1 से जोड़ा गया है, और घनत्व मानचित्र Q2 की संपूर्ण 10 आइसोप्रीन पूंछों को स्पष्ट रूप से दर्शाता है। RC-LH116 की संरचना में, तीन कीलेटेड UQ10 अणु (Q1 से Q3, चित्र 5D) स्पष्ट रूप से विभेदित हुए हैं, और सभी अणुओं की पूंछ में स्पष्ट घनत्व है (चित्र 5, D से G)। दोनों संरचनाओं में, Q1 और Q2 के क्विनोन हेड समूहों की स्थिति में उत्कृष्ट संगति है (चित्र S12F), और वे केवल RC के साथ परस्पर क्रिया करते हैं। Q1, RC-LH114-W के W गैप के प्रवेश द्वार पर स्थित है (चित्र 1G और 5, C, D और E), और Q2, QB बंधन स्थल के निकट स्थित है (चित्र 5, C, D और F)। संरक्षित L-Trp143 और L-Trp269 अवशेष Q1 और Q2 के बहुत निकट हैं और संभावित π-स्टैकिंग अंतःक्रिया प्रदान करते हैं (चित्र 5, E और F, और चित्र S12)। Q1 के दूरस्थ ऑक्सीजन से 3.0 Å की दूरी पर स्थित L-Gln88 एक मजबूत हाइड्रोजन बंधन प्रदान करता है (चित्र 5E); यह अवशेष सबसे दूरस्थ संबंध को छोड़कर सभी RC में संरक्षित है (चित्र S13)। अधिकांश अन्य आरसी में एल-सेर91 को थ्र के स्थान पर संरक्षित रूप से प्रतिस्थापित किया जाता है (चित्र एस13), यह क्यू1 के मिथाइल ऑक्सीजन से 3.8 एंगस्ट्रॉम की दूरी पर स्थित है, और कमजोर हाइड्रोजन बंध प्रदान कर सकता है (चित्र 5ई)। क्यू3 का कोई विशिष्ट अंतःक्रिया नहीं प्रतीत होता है, लेकिन यह आरसी-एम उपइकाई और एलएच1-α उपइकाई 5 से 6 के बीच के जलभक्षी क्षेत्र में स्थित है (चित्र 5, डी और जी)। क्यू1, क्यू2 और क्यू3 या आस-पास के कीलेटेड क्विनोन को टीसीएच जेंटल, टीआरवी स्ट्रेन 970 और बीएलसी में भी पहचाना गया है। आइरिस संरचना (9, 10, 12) आरसी-एलएच1 कॉम्प्लेक्स में एक संरक्षित सहायक क्विनोन बंधन स्थल की ओर इशारा करती है (चित्र एस12जी)। आरसी-एलएच116 में विघटित पांच यूक्यू उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा निर्धारित प्रत्येक कॉम्प्लेक्स के 5.8 ± 0.7 के साथ अच्छी तरह से मेल खाते हैं, जबकि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू में विघटित तीन यूक्यू 6.2 ± 0.3 के मापा मूल्य से कम हैं (चित्र एस14) यह दर्शाता है कि संरचना में अनसुलझे यूक्यू अणु मौजूद हैं।
छद्म-सममित L और M पॉलीपेप्टाइड में से प्रत्येक में पाँच TMH होते हैं और एक हेटेरोडाइमर बनाते हैं जो एक BChl डाइमर, दो BChl मोनोमर, दो बैक्टीरियोफेज (BPh) मोनोमर, एक नॉन-हीम आयरन और एक या दो UQ10 अणुओं को जोड़ता है। टर्मिनल कीटोन समूह पर हाइड्रोजन बंधों की उपस्थिति और Rps में इसके ज्ञात संचय के माध्यम से, कैरोटीनॉयड M-उपइकाई में शामिल होते हैं, जिसे cis-3,4-डीहाइड्रोओरोडोपिन नाम दिया गया है। प्रजाति (25)। RC-H का बाहरी झिल्ली डोमेन एक एकल TMH द्वारा झिल्ली से जुड़ा होता है। समग्र RC संरचना संबंधित प्रजातियों (जैसे Rba) के तीन उपइकाई RC के समान है। स्फेरोइड्स (PDB ID: 3I4D)। बीसीएल और बीपीएफ के मैक्रोसाइकिल, कैरोटीनॉयड बैकबोन और नॉन-हीम आयरन इन संरचनाओं की संकल्प सीमा के भीतर ओवरलैप करते हैं, जैसा कि क्यूए साइट पर यूक्यू10 हेड ग्रुप और आरसी-एलएच116 पर क्यूबी क्विनोन करते हैं (चित्र एस15)।
अलग-अलग QB साइट अधिभोग दरों वाली दो RC संरचनाओं की उपलब्धता, QB क्विनोन बंधन के साथ होने वाले सुसंगत संरचनात्मक परिवर्तनों की जांच करने का एक नया अवसर प्रदान करती है। RC-LH116 कॉम्प्लेक्स में, QB क्विनोन पूरी तरह से बंधे हुए "निकटवर्ती" स्थिति (26) में स्थित है, लेकिन RC-LH114-W के पृथक्करण में QB क्विनोन नहीं है। RC-LH114-W में QB क्विनोन का न होना आश्चर्यजनक है क्योंकि यह कॉम्प्लेक्स सक्रिय है, संरचनात्मक रूप से स्पष्ट QB क्विनोन वाले RC-LH116 कॉम्प्लेक्स की तुलना में अधिक सक्रिय है। यद्यपि दो LH1 वलय लगभग छह क्विनोन को बांधते हैं, बंद RC-LH116 वलय में पाँच संरचनात्मक रूप से स्पष्ट हैं, जबकि खुले RC-LH114-W वलय में केवल तीन संरचनात्मक रूप से सीमित हैं। यह बढ़ी हुई संरचनात्मक अव्यवस्था RC-LH114-W QB साइटों के तेजी से प्रतिस्थापन, कॉम्प्लेक्स में क्विनोन की तीव्र गति और LH1 लूप को पार करने की बढ़ी हुई संभावना को दर्शा सकती है। हमारा सुझाव है कि RC-LH114-W की RC QB साइट में UQ की कमी एक अधिक जटिल और अधिक सक्रिय कॉम्प्लेक्स का परिणाम हो सकती है, और RC-LH114-W की QB साइट UQ टर्नओवर में तुरंत स्थिर हो गई है। विशिष्ट चरण (QB साइट का प्रवेश द्वार बंद हो गया है) इस गतिविधि की संरचना को दर्शाता है।
QB की अनुपस्थिति में, L-Phe217 का घूर्णन UQ10 बंधन के लिए अनुपयुक्त स्थिति में होता है, क्योंकि इससे पूंछ की पहली आइसोप्रीन इकाई के साथ स्थानिक टकराव होता है (चित्र 6A)। इसके अतिरिक्त, स्पष्ट मुख्य संरचनात्मक परिवर्तन दिखाई देते हैं, विशेष रूप से हेलिक्स डी (TMH D और E के बीच लूप में छोटा हेलिक्स) जहां L-Phe217 QB बंधन पॉकेट में स्थानांतरित हो जाता है और L-Tyr223 का घूर्णन (चित्र 6A) M-Asp45 फ्रेमवर्क के साथ हाइड्रोजन बंधन को तोड़ता है और QB बंधन स्थल के प्रवेश द्वार को बंद कर देता है (चित्र 6B)। हेलिक्स डी अपने आधार पर घूमता है, L-Ser209 का Cα 0.33Å स्थानांतरित हो जाता है, जबकि L-Val221Cα 3.52Å स्थानांतरित हो जाता है। TMH D और E में कोई स्पष्ट परिवर्तन नहीं दिखाई देते हैं, जो दोनों संरचनाओं में एक दूसरे पर आरोपित होते हैं (चित्र 6A)। जहां तक ​​हमें पता है, प्राकृतिक आरसी में यह पहली संरचना है जो क्यूबी साइट को बंद करती है। पूर्ण (क्यूबी-बद्ध) संरचना के साथ तुलना करने पर पता चलता है कि क्विनोन के अपचयन से पहले, इसे क्विनोन में प्रवेश करने के लिए एक संरचनात्मक परिवर्तन की आवश्यकता होती है। एल-फे217 घूमकर क्विनोन हेड ग्रुप के साथ एक π-स्टैकिंग अंतःक्रिया बनाता है, और हेलिक्स बाहर की ओर खिसक जाता है, जिससे एल-ग्लाइ222 का कंकाल और एल-टाइर223 की पार्श्व श्रृंखला एक स्थिर हाइड्रोजन बंध संरचना के साथ एक हाइड्रोजन बंध नेटवर्क बना पाती है (चित्र 6, ए और सी)।
(A) होलोग्राम (L श्रृंखला, नारंगी/M श्रृंखला, मैजेंटा) और एपो (ग्रे) संरचना का अतिव्यापी कार्टून, जिसमें प्रमुख अवशेषों को छड़ जैसी आकृति में दर्शाया गया है। UQ10 को पीले रंग की पट्टी से दर्शाया गया है। बिंदीदार रेखा पूरी संरचना में बने हाइड्रोजन बंधों को इंगित करती है। (B और C) एपोलिपोप्रोटीन और संपूर्ण वलय संरचना का सतही निरूपण, जिसमें L-Phe217 के पार्श्व श्रृंखला ऑक्सीजन को नीले रंग में और L-Tyr223 को लाल रंग में दर्शाया गया है। L उप-इकाई नारंगी रंग की है; M और H उप-इकाइयों को रंग नहीं दिया गया है। (D और E) एपोलिपोप्रोटीन (D) और संपूर्ण (E) RC QB साइटें [क्रमशः (A) के अनुसार रंगित] और थर्मोफिलस थर्मोफिलस PSII (हरा, प्लास्टिक क्विनोन के साथ नीला; PDB ID: 3WU2) संरेखित करें (58)।
अप्रत्याशित रूप से, यद्यपि LH1 के बिना QB-कमी वाले RC की कई संरचनाएँ उपलब्ध हैं, इस अध्ययन में देखे गए संरचनात्मक परिवर्तनों की रिपोर्ट पहले नहीं की गई है। इनमें Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) और Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) से QB की कमी वाली संरचनाएँ शामिल हैं, जो लगभग अपनी समग्र QB संरचना के समान हैं। 3PRC के गहन निरीक्षण से पता चला कि LDAO (लॉरिल डाइमिथाइल एमाइन ऑक्साइड) डिटर्जेंट अणु QB स्थिति के प्रवेश द्वार पर बंधते हैं, जो एक बंद संरचना में पुनर्व्यवस्था को रोक सकता है। यद्यपि LDAO 1EYS या 1OGV में उसी स्थिति में विघटित नहीं होता है, ये RC एक ही डिटर्जेंट का उपयोग करके तैयार किए जाते हैं और इसलिए समान प्रभाव उत्पन्न कर सकते हैं। Rba. की क्रिस्टल संरचना। साइटोक्रोम c2 (PDB ID: 1L9B) के साथ सह-क्रिस्टलीकृत स्फेरोइड्स RC में भी एक बंद QB साइट प्रतीत होती है। हालाँकि, इस मामले में, RC-M पॉलीपेप्टाइड का N-टर्मिनल क्षेत्र (Q हेलिक्स पर टायरोसिन अवशेष के H बॉन्ड के माध्यम से QB बाइंडिंग साइट के साथ इंटरैक्ट करते हुए) एक अप्राकृतिक संरचना अपनाता है, और QB संरचनात्मक परिवर्तन का आगे अध्ययन नहीं किया गया है (30)। संतोषजनक बात यह है कि हमने RC-LH114-W संरचना में M पॉलीपेप्टाइड का इस प्रकार का विरूपण नहीं देखा है, जो RC-LH116 RC के N-टर्मिनल क्षेत्र के लगभग समान है। यह भी ध्यान देने योग्य है कि डिटर्जेंट-आधारित LH1 एंटेना के उन्मूलन के बाद, PDB में एपोलिपोप्रोटीन RC को अलग किया गया, जिससे RC और आसपास के LH1 वलय की आंतरिक सतह के बीच के अंतराल में आंतरिक क्विनोन पूल और लिपिड समाप्त हो गए (31, 32)। RC कार्यात्मक बना रहता है क्योंकि इसमें विघटनशील QB क्विनोन को छोड़कर सभी सहकारक मौजूद रहते हैं, जो कम स्थिर होता है और अक्सर तैयारी प्रक्रिया के दौरान नष्ट हो जाता है (33)। इसके अलावा, यह ज्ञात है कि RC से LH1 और प्राकृतिक चक्रीय लिपिड को हटाने से कार्यों पर प्रभाव पड़ सकता है, जैसे कि आवेश-पृथक P+QB-अवस्था का छोटा जीवनकाल (31, 34, 35)। इसलिए, हम अनुमान लगाते हैं कि RC के चारों ओर स्थानीय LH1 वलय का अस्तित्व "बंद" QB स्थल को बनाए रख सकता है, जिससे QB के निकट स्थानीय वातावरण संरक्षित रहता है।
यद्यपि एपोलिपोप्रोटीन (क्यूबी क्विनोन के बिना) और संपूर्ण संरचना, घटनाओं की एक श्रृंखला के बजाय, क्यूबी साइट के टर्नओवर के केवल दो स्नैपशॉट का प्रतिनिधित्व करते हैं, फिर भी ऐसे संकेत मिलते हैं कि हाइड्रोक्विनोन द्वारा पुनः बंधन को रोकने के लिए बंधन को नियंत्रित किया जा सकता है ताकि सब्सट्रेट अवरोध को रोका जा सके। एपोलिपोप्रोटीन के क्यूबी साइट के पास क्विनोलॉल और क्विनोन की परस्पर क्रिया भिन्न हो सकती है, जिसके कारण आरसी द्वारा इसे अस्वीकार कर दिया जाता है। लंबे समय से यह माना जाता रहा है कि संरचनात्मक परिवर्तन क्विनोन के बंधन और अपचयन में भूमिका निभाते हैं। अंधेरे में अनुकूलन के बाद जमे हुए आरसी की क्विनोन को अपचयित करने की क्षमता कम हो जाती है (36); एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी से पता चलता है कि यह क्षति क्यूबी क्विनोन के सक्रिय समीपस्थ स्थिति से लगभग 4.5 Å दूर एक "दूरस्थ" संरचना में फंसने के कारण होती है (26), 37)। हमारा सुझाव है कि यह दूरस्थ बंधन संरचना एपोलिपोप्रोटीन और पूर्ण वलय संरचना के बीच की मध्यवर्ती अवस्था का एक स्नैपशॉट है, जो क्विनोन के साथ प्रारंभिक अंतःक्रिया और क्यूबी साइट के खुलने के बाद होती है।
कुछ प्रकाशपोषी जीवाणुओं और सायनोबैक्टीरिया, शैवाल और पौधों के PSII कॉम्प्लेक्स में पाए जाने वाले टाइप II RC में संरचनात्मक और कार्यात्मक संरक्षण होता है (38)। चित्र 6 (D और E) में दर्शाया गया संरचनात्मक संरेखण PSII RC और जीवाणु RC कॉम्प्लेक्स के QB स्थल के बीच समानता को दर्शाता है। यह तुलना लंबे समय से क्विनोन बंधन और अपचयन की निकट संबंधी प्रणालियों के अध्ययन के लिए एक मॉडल रही है। पिछले प्रकाशनों ने सुझाव दिया है कि PSII द्वारा क्विनोन के अपचयन के साथ संरचनात्मक परिवर्तन होते हैं (39, 40)। इसलिए, RC के विकासवादी संरक्षण को ध्यान में रखते हुए, यह पहले कभी न देखा गया बंधन तंत्र ऑक्सीजन युक्त प्रकाशपोषी पौधों में PSII RC के QB स्थल पर भी लागू हो सकता है।
Rps ΔpufW (अनलेबल pufW विलोपन) और PufW-His (प्राकृतिक pufW लोकस से व्यक्त C-टर्मिनल 10x His-टैग्ड प्रोटीन-W) उपभेद। palustris CGA009 का वर्णन हमारे पिछले कार्य (16) में किया गया था। इन उपभेदों और आइसोजेनिक वाइल्ड-टाइप जनक को फ्रीजर से PYE (प्रत्येक 5 ग्राम लीटर -1) (LB में -80 °C पर संग्रहित, जिसमें 50% (w/v) ग्लिसरॉल प्रोटीन, यीस्ट एक्सट्रेक्ट और सक्सिनेट होता है) अगर [1.5% (w/v)] प्लेट पर थोड़ी संख्या में कोशिकाओं को स्ट्रीक करके प्राप्त किया गया था। प्लेट को रात भर कमरे के तापमान पर अंधेरे में अवायवीय परिस्थितियों में रखा गया, और फिर 3 से 5 दिनों तक OSRAM 116-W हैलोजन बल्ब (RS Components, UK) द्वारा प्रदान की गई सफेद रोशनी (~50 μmolm-2 s-1) से प्रकाशित किया गया जब तक कि एक कॉलोनी दिखाई न दे। एक कॉलोनी का उपयोग 0.1% (w/v) कैसामिनो एसिड (जिसे आगे M22 कहा जाएगा) के साथ पूरक 10 मिलीलीटर M22+ माध्यम (41) में इनोक्यूलेट करने के लिए किया गया था। कल्चर को कम ऑक्सीजन की स्थिति में अंधेरे में 34°C पर 180 rpm की गति से हिलाते हुए 48 घंटे तक उगाया गया, और फिर 70 मिलीलीटर कल्चर को उसी स्थिति में 24 घंटे के लिए इनोक्यूलेट किया गया। 1 मिलीलीटर आयतन वाले अर्ध-वायुजी संवर्धन को 30 मिलीलीटर के सार्वभौमिक पेंच-शीर्ष पारदर्शी कांच की बोतल में 30 मिलीलीटर एम22 माध्यम में डाला गया और बाँझ चुंबकीय बल सरगर्मी छड़ द्वारा 48 घंटे तक हिलाते हुए विकिरणित किया गया (~50 μmolm⁻² s⁻¹)। फिर, 30 मिलीलीटर संवर्धन को लगभग 1 लीटर संवर्धन के साथ समान परिस्थितियों में डाला गया, जिसका उपयोग लगभग 9 लीटर संवर्धन को ~200 μmolm⁻² s⁻¹ पर 72 घंटे तक प्रकाशित करने के लिए किया गया। कोशिकाओं को 7132 RCF पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्री द्वारा एकत्रित किया गया, लगभग 10 मिलीलीटर 20 mM ट्रिस-एचसीएल (pH 8.0) में पुनः निलंबित किया गया और आवश्यकता पड़ने तक -20°C पर संग्रहित किया गया।
पिघलने के बाद, पुनर्सस्पेंड की गई कोशिकाओं में डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिएज़ I (मर्क, यूके), लाइसोसोम (मर्क, यूके) के कुछ क्रिस्टल और रोश होलोएंजाइम प्रोटीएज़ अवरोधक की दो गोलियाँ (मर्क, यूके) मिलाएँ। 20,000 psi फ्रेंच प्रेशर सेल (अमीनको, यूएसए) में, कोशिकाओं को 8 से 12 बार तोड़ा गया। 4°C पर 15 मिनट के लिए 18,500 RCF पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा अखंड कोशिकाओं और अघुलनशील मलबे को हटाने के बाद, 43,000°C पर 2 घंटे के लिए 113,000 RCF पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा झिल्ली को रंगीन लाइसैट से अवक्षेपित किया गया। घुलनशील अंश को त्याग दें और रंगीन झिल्ली को 100 से 200 मिलीलीटर 20 mM ट्रिस-एचसीएल (pH 8.0) में पुनर्सस्पेंड करें और तब तक समरूपित करें जब तक कोई दृश्यमान समुच्चय न रह जाए। निलंबित झिल्ली को 2% (w/v) β-DDM युक्त 20 mM ट्रिस-HCl (pH 8.0) (एनाट्रेस, यूएसए) में 4°C पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में धीरे-धीरे हिलाते हुए इनक्यूबेट किया गया। फिर 70°C पर सेंट्रीफ्यूज करके 150,000 RCF को घोला गया और 4°C पर 1 घंटे के लिए सेंट्रीफ्यूज करके अवशिष्ट अघुलनशील पदार्थों को हटा दिया गया।
ΔpufW स्ट्रेन से प्राप्त घुलनशील झिल्ली को 50 मिलीलीटर DEAE सेफरोस आयन एक्सचेंज कॉलम पर तीन कॉलम वॉल्यूम (CV) बाइंडिंग बफर [20 mM ट्रिस-HCl (pH 8.0) जिसमें 0.03% (w/v) β-DDM होता है] के साथ लगाया गया। कॉलम को दो CV बाइंडिंग बफर से धोया गया, और फिर दो बाइंडिंग बफर से धोया गया जिसमें 50 mM NaCl था। RC-LH116 कॉम्प्लेक्स को 1.75 CV पर 150 से 300 mM NaCl (बाइंडिंग बफर में) के रैखिक ग्रेडिएंट के साथ निकाला गया, और शेष बाइंडिंग कॉम्प्लेक्स को 0.5 CV पर 300 mM NaCl वाले बाइंडिंग बफर के साथ निकाला गया। 250 और 1000 एनएम के बीच अवशोषण स्पेक्ट्रम एकत्र करें, 880 से 280 एनएम पर 1 से अधिक अवशोषण अनुपात (A880/A280) वाले अंश को रखें, इसे बाइंडिंग बफर में दो बार पतला करें, और शुद्धिकरण के लिए DEAE कॉलम पर उसी प्रक्रिया का पुनः प्रयोग करें। 1.7 से अधिक A880/A280 अनुपात और 3.0 से अधिक A880/A805 अनुपात वाले अंशों को पतला करें, आयन विनिमय का तीसरा दौर करें, और 2.2 से अधिक A880/A280 अनुपात और 5.0 से अधिक A880/A805 अनुपात वाले अंशों को रखें। आंशिक रूप से शुद्ध किए गए कॉम्प्लेक्स को एमिकन 100,000 मॉलिक्यूलर वेट कट-ऑफ (MWCO) सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर (मर्क, यूके) में लगभग 2 मिलीलीटर तक सांद्रित किया गया और 200 mM NaCl बफर युक्त सुपरडेक्स 200 16/600 साइज एक्सक्लूजन कॉलम (जीई हेल्थकेयर, यूएस) पर लोड किया गया, और फिर उसी बफर में 1.5 CV पर इल्यूट किया गया। साइज एक्सक्लूजन अंश के अवशोषण स्पेक्ट्रा को एकत्रित करें, और 2.4 से अधिक A880/A280 अनुपात और 5.8 से अधिक A880/A805 अनुपात वाले अवशोषण स्पेक्ट्रा को 100 A880 तक सांद्रित करें, और क्रायो-TEM ग्रिड तैयार करने या भंडारण के लिए तुरंत उनका उपयोग करें। आवश्यकता पड़ने तक -80°C पर रखें।
PufW-His स्ट्रेन से प्राप्त घुलनशील झिल्ली को 20 मिलीलीटर HisPrep FF Ni-NTA सेफरोस कॉलम (20 mM ट्रिस-एचसीएल (pH 8.0) जिसमें 200 mM NaCl और 0.03% (w/w) शामिल है) पर IMAC बफर (GE हेल्थकेयर) में लगाया गया। v) β-DDM]। कॉलम को IMAC बफर के पांच CV से धोया गया, और फिर 10 mM हिस्टिडीन युक्त IMAC बफर के पांच CV से धोया गया। कोर कॉम्प्लेक्स को 100 mM हिस्टिडीन युक्त IMAC बफर के पांच घोलों से कॉलम से निकाला गया। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स युक्त अंश को एमिकन 100,000 एमडब्ल्यूसीओ फिल्टर (मर्क, यूके) से सुसज्जित एक स्टिरर्ड टैंक में लगभग 10 मिलीलीटर तक सांद्रित किया जाता है, बाइंडिंग बफर के साथ 20 गुना पतला किया जाता है, और फिर 25 मिलीलीटर डीईएई सेफरोस कॉलम में डाला जाता है, जहां बफर से बंधे चार सीवी का पहले से उपयोग किया जाता है। कॉलम को चार सीवी बाइंडिंग बफर से धोएं, फिर 0 से 100 mM NaCl (बाइंडिंग बफर में) के रैखिक ग्रेडिएंट पर आठ सीवी पर कॉम्प्लेक्स को एल्यूट करें, और शेष चार सीवी में 100 mM बाइंडिंग बफर शामिल करें। सोडियम क्लोराइड पर एल्यूट किए गए अवशिष्ट कॉम्प्लेक्स, जिनका A880/A280 अनुपात 2.4 से अधिक और A880/A805 अनुपात 4.6 से अधिक था, को एमिकन 100,000 MWCO सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर में लगभग 2 मिलीलीटर तक सांद्रित किया गया, और पहले से बफर इक्विलिब्रेटेड सुपरडेक्स 200 16/600 साइज एक्सक्लूजन कॉलम में 1.5 सीवी IMAC से भरा गया, और फिर उसी बफर में 1.5 सीवी पर एल्यूट किया गया। आकार-अपवर्जन अंशों के अवशोषण स्पेक्ट्रा को एकत्रित करें और 2.1 से अधिक A880/A280 अनुपात और 4.6 से अधिक A880/A805 अनुपात वाले अवशोषण स्पेक्ट्रा को 100 A880 तक केंद्रित करें, जिनका उपयोग तुरंत जमे हुए TEM ग्रिड तैयार करने के लिए किया जाता है या आवश्यकता पड़ने तक -80°C पर संग्रहीत किया जाता है।
कम तापमान वाले टीईएम ग्रिड तैयार करने के लिए लाइका ईएम जीपी इमर्शन फ्रीजर का उपयोग किया गया। कॉम्प्लेक्स को आईएमएसी बफर में 50 के अनुपात में ए880 तक पतला किया गया, और फिर 5 μl को नए सिरे से ग्लो-डिस्चार्ज किए गए क्वांटिफ़ॉइल 1.2/1.3 कार्बन-कोटेड कॉपर मेश (अगर साइंटिफिक, यूके) पर लोड किया गया। ग्रिड को 20°C और 60% सापेक्ष आर्द्रता पर 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट किया गया, फिर 3 सेकंड के लिए सुखाया गया, और फिर इसे -176°C पर तरल इथेन में ठंडा किया गया।
RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स का डेटा eBIC (इलेक्ट्रॉनिक बायोइमेजिंग सेंटर) (ब्रिटिश डायमंड लाइट सोर्स) पर टाइटन क्रियोस माइक्रोस्कोप से रिकॉर्ड किया गया, जो 300kV के त्वरण वोल्टेज, 130,000× के नाममात्र आवर्धन और 20 eV के ऊर्जा अंतराल पर काम करता है। डेटा एकत्र करने के लिए काउंटिंग मोड में छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए K2 पीक डिटेक्टर के साथ Gatan 968 GIF क्वांटम का उपयोग किया गया। कैलिब्रेटेड पिक्सेल आकार 1.048Å है, और खुराक दर 3.83 e-Å-2s-1 है। मूवी को 11 सेकंड में एकत्र किया गया और इसे 40 भागों में विभाजित किया गया। माइक्रोस्कोप को पुनः फोकस करने के लिए कार्बन-कोटेड क्षेत्र का उपयोग किया गया, और फिर प्रति छेद तीन मूवी एकत्र की गईं। कुल मिलाकर, -1 और -3μm के बीच डिफोकस मानों के साथ 3130 मूवी एकत्र की गईं।
RC-LH116 कॉम्प्लेक्स का डेटा एस्टरबरी बायोस्ट्रक्चर लेबोरेटरी (लीड्स विश्वविद्यालय, यूके) में उसी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्र किया गया था। डेटा को 130 k आवर्धन पर काउंटिंग मोड में एकत्र किया गया था, और पिक्सेल आकार को 4.6 e-Å-2s-1 की खुराक के साथ 1.065 Å पर कैलिब्रेट किया गया था। मूवी को 12 सेकंड में रिकॉर्ड किया गया और 48 भागों में विभाजित किया गया। कुल मिलाकर, -1 और -3μm के बीच डीफोकस मानों के साथ 3359 फिल्में एकत्र की गईं।
सभी डेटा प्रोसेसिंग Relion 3.0 पाइपलाइन (42) में की जाती है। डोज़ वेटिंग द्वारा बीम मोशन को ठीक करने के लिए Motioncorr 2 (43) का उपयोग करें, और फिर CTF (कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन) पैरामीटर निर्धारित करने के लिए CTFFIND 4.1 (44) का उपयोग करें। इन प्रारंभिक प्रोसेसिंग चरणों के बाद विशिष्ट फोटोमाइक्रोग्राफ चित्र 2. S16 में दिखाए गए हैं। स्वचालित चयन टेम्पलेट 250-पिक्सेल फ्रेम में 1000 कणों के लगभग 250 पिक्सेल का मैन्युअल रूप से चयन करके और कोई संदर्भ द्वि-आयामी (2D) वर्गीकरण न करके उत्पन्न किया जाता है, जिससे उन वर्गीकरणों को अस्वीकार कर दिया जाता है जो नमूना संदूषण को पूरा करते हैं या जिनमें कोई स्पष्ट विशेषताएँ नहीं होती हैं। फिर, सभी माइक्रोफ़ोटोग्राफ़ पर स्वचालित चयन किया गया, और RC-LH114-W में 849,359 कण थे, और RC-LH116 कॉम्प्लेक्स में 476,547 कण थे। सभी चयनित कणों का दो चरणों में गैर-संदर्भ 2डी वर्गीकरण किया गया है, और प्रत्येक चरण के बाद, कार्बन क्षेत्र, नमूना संदूषण, कोई स्पष्ट विशेषता न होने या अत्यधिक अतिव्यापी कणों को अस्वीकार कर दिया गया है, जिसके परिणामस्वरूप 772,033 (90.9%) और 359,678 (75.5%) कण क्रमशः RC-LH114-W और RC-LH116 के 3डी वर्गीकरण के लिए उपयोग किए गए हैं। प्रारंभिक 3डी संदर्भ मॉडल स्टोकेस्टिक ग्रेडिएंट डिसेंट विधि का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। प्रारंभिक मॉडल को संदर्भ के रूप में उपयोग करते हुए, चयनित कणों को 3डी में चार श्रेणियों में वर्गीकृत किया गया है। इस श्रेणी के मॉडल को संदर्भ के रूप में उपयोग करते हुए, सबसे बड़ी श्रेणी के कणों पर 3डी परिशोधन किया गया, फिर विलायक क्षेत्र को कवर करने के लिए प्रारंभिक 15Å लो-पास फ़िल्टर का उपयोग किया गया, 6 पिक्सेल के सॉफ्ट एज जोड़े गए, और शीर्ष डिटेक्टर के गैटन K2 पीक मॉड्यूलेशन ट्रांसफर फ़ंक्शन को सही करने के लिए पिक्सेल का पोस्ट-प्रोसेसिंग किया गया। RC-LH114-W डेटासेट के लिए, इस प्रारंभिक मॉडल को मास्क के किनारों पर मौजूद सघन घनत्व (UCSF चिमेरा में कोर कॉम्प्लेक्स घनत्व से अलग) को हटाकर संशोधित किया गया था। परिणामी मॉडल (RC-LH114-W और RC-LH116 का रिज़ॉल्यूशन क्रमशः 3.91 और 4.16 Å है) का उपयोग 3D वर्गीकरण के दूसरे दौर के लिए संदर्भ के रूप में किया गया। उपयोग किए गए कणों को प्रारंभिक 3D वर्ग में समूहीकृत किया गया है और उनका आस-पड़ोस के साथ कोई मजबूत सहसंबंध नहीं है। ओवरलैप या स्पष्ट संरचनात्मक विशेषताओं की कमी है। 3D वर्गीकरण के दूसरे दौर के बाद, उच्चतम रिज़ॉल्यूशन वाली श्रेणी का चयन किया गया [RC-LH114-W के लिए, एक श्रेणी में 377,703 कण (44.5%) हैं, RC-LH116 के लिए, दो श्रेणियां हैं, जिनमें कुल 260,752 कण (54.7%) हैं, जहां वे केवल प्रारंभिक घूर्णन के बाद संरेखित होने पर ही थोड़े अंतर के साथ समान हैं]। चयनित कणों को 400 पिक्सेल बॉक्स में पुनः निकाला जाता है और 3डी रिफाइनिंग द्वारा परिष्कृत किया जाता है। सॉल्वेंट मास्क प्रारंभिक 15Å लो-पास फ़िल्टर, 3 पिक्सेल मैप विस्तार और 3 पिक्सेल सॉफ्ट मास्क का उपयोग करके उत्पन्न किया जाता है। प्रति-कण सीटीएफ रिफाइनमेंट, प्रति-कण गति सुधार और प्रति-कण सीटीएफ रिफाइनमेंट के दूसरे दौर का उपयोग करके, परिणामी बनावट को और परिष्कृत करने के लिए प्रत्येक चरण के बाद 3डी रिफाइनमेंट, सॉल्वेंट मास्किंग और पोस्ट-प्रोसेसिंग की जाती है। 0.143 के एफएससी (फूरियर शेल सहसंबंध गुणांक) कट-ऑफ मान का उपयोग करके, आरसी-एलएच114-डब्ल्यू और आरसी-एलएच116 के अंतिम मॉडल का रिज़ॉल्यूशन क्रमशः 2.65 और 2.80Å है। अंतिम मॉडल का एफएससी वक्र चित्र 2. S17 में दिखाया गया है।
सभी प्रोटीन अनुक्रम UniProtKB से डाउनलोड किए गए हैं: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); प्रोटीन-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3)। RC के एक समरूपता मॉडल के निर्माण के लिए SWISS-MODEL (45) का उपयोग किया गया था, जिसमें RC-L, RC-M और RC-H के प्रोटीन अनुक्रम शामिल हैं और Rba. sphaeroides RC की क्रिस्टल संरचना को एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया गया था (PDB ID: 5LSE) (46)। यूसीएसएफ चिमेरा में "फिट मैप" टूल का उपयोग करके उत्पन्न मॉडल को मानचित्र (47) में फिट करें, प्रोटीन संरचना में सुधार करें, और कोफ़ैक्टर [4×BChl a (मोनोमर लाइब्रेरी अवशेष नाम = BCL), 2×BPh a (BPH), एक या दो प्रकार के UQ10 (U10), एक नॉन-हीम आयरन (Fe) और एक 3,4-डायहाइड्रोहेक्साकार्बोनिलकोलीन (QAK)] को जोड़ने के लिए Coot (48) का उपयोग करें। चूंकि QAK मोनोमर लाइब्रेरी में उपलब्ध नहीं है, इसलिए इसे PHENIX (49) में eLBOW टूल का उपयोग करके पैरामीटराइज़ किया गया था।
इसके बाद, LH1 सबयूनिट का निर्माण किया गया। प्रारंभ में, PHENIX (49) में स्वचालित निर्माण उपकरण का उपयोग करके, मानचित्र और LH1-α तथा LH1-β प्रोटीन अनुक्रमों को इनपुट के रूप में लेकर LH1 अनुक्रम के एक भाग का स्वचालित निर्माण किया गया। सबसे पूर्ण LH1 सबयूनिट का चयन करें, उसे निकालें और Coot में लोड करें, उसमें लुप्त अनुक्रम को मैन्युअल रूप से जोड़ें, और दो BCl (BCL) और एक स्पिरिलोक्सैंथिन (CRT) जोड़ने से पहले पूरी संरचना को मैन्युअल रूप से परिष्कृत करें [संबंधित Rps प्रजातियों (17) के अनुसार LH1 कॉम्प्लेक्स का घनत्व और ज्ञात कैरोटीनॉयड सामग्री]। पूर्ण LH1 सबयूनिट की प्रतिलिपि बनाएँ, और UCSF चिमेरा "डॉकिंग मैप टूल" का उपयोग करके LH1 घनत्व के निकटवर्ती गैर-मॉडल क्षेत्र में डॉक करें, और फिर इसे Coot में परिष्कृत करें; इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएँ जब तक कि सभी LH1 सबयूनिट का मॉडल तैयार न हो जाए। RC-LH114-W संरचना के लिए, Coot में अनिर्धारित घनत्व को निकालकर, प्रोटीन को USCF चिमेरा मानचित्र में शेष गैर-प्रोटीन घटकों से अलग किया जाता है और प्रारंभिक मॉडल स्थापित करने के लिए ऑटोबिल्ड टूल का उपयोग किया जाता है, और शेष उप-इकाइयों (प्रोटीन-W) का मॉडलिंग PHENIX (49) में किया जाता है। Coot (48) में परिणामी मॉडल में किसी भी लुप्त अनुक्रम को जोड़ें, और फिर पूरी उप-इकाई को मैन्युअल रूप से परिष्कृत करें। शेष अनिर्धारित घनत्व लिपिड (CDL = CDL, POPC = 6PL और POPG = PGT का PDB मोनोमर लाइब्रेरी ID), β-DDM डिटर्जेंट (LMT) और UQ10 अणुओं (U10) के संयोजन के अनुरूप है। PHENIX अनुकूलन (49) और Coot (48) में मैन्युअल अनुकूलन का उपयोग करके संपूर्ण प्रारंभिक मॉडल को तब तक परिपूर्ण करें जब तक कि मॉडल सांख्यिकी और फिट की दृश्य गुणवत्ता में और सुधार न हो सके। अंत में, स्थानीय मानचित्र को तेज करने के लिए LocScale (50) का उपयोग करें, और फिर अनआवंटित घनत्व और स्वचालित और मैन्युअल अनुकूलन के मॉडलिंग के कई अन्य चक्रों को निष्पादित करें।
संबंधित घनत्वों के भीतर डॉक किए गए संबंधित पेप्टाइड, कोफ़ैक्टर और अन्य लिपिड और क्विनोन को चित्र 1 और 2 में दर्शाया गया है। S18 से S23। अंतिम मॉडल की सांख्यिकीय जानकारी तालिका S1 में दर्शाई गई है।
जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न किया जाए, यूवी/विज़/एनआईआर अवशोषण स्पेक्ट्रा को कैरी60 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (एजिलेंट, यूएसए) पर 250 एनएम से 1000 एनएम तक 1 एनएम के अंतराल पर और 0.1 सेकंड के एकीकरण समय के साथ एकत्र किया गया था।
नमूने को 2 मिमी पथ वाली क्वार्ट्ज़ क्यूवेट में A880 के अनुपात 1 तक पतला करें और 400 से 1000 एनएम के बीच अवशोषण स्पेक्ट्रम एकत्र करें। वृत्ताकार डाइक्रोइक स्पेक्ट्रम को जैस्को 810 स्पेक्ट्रोपोलारिमीटर (जैस्को, जापान) पर 400 एनएम और 950 एनएम के बीच 1 एनएम के अंतराल पर 20 एनएम/मिनट की स्कैन दर पर एकत्र किया गया।
कोर कॉम्प्लेक्स को लगभग 50 के A880 तक पतला करके मोलर विलुप्तिकरण गुणांक निर्धारित किया जाता है। 10 μl आयतन को 990 μl बाइंडिंग बफर या मेथनॉल में पतला करें, और BChl क्षरण को कम करने के लिए अवशोषण स्पेक्ट्रम को तुरंत एकत्र करें। प्रत्येक मेथनॉल नमूने की BChl सामग्री की गणना 771 nm पर 54.8 mM-1 cm-1 के विलुप्तिकरण गुणांक द्वारा की गई थी, और विलुप्तिकरण गुणांक निर्धारित किया गया था (51)। कोर कॉम्प्लेक्स सांद्रता निर्धारित करने के लिए मापी गई BChl सांद्रता को 32 (RC-LH114-W) या 36 (RC-LH116) से विभाजित करें, जिसका उपयोग बफर में एकत्र किए गए उसी नमूने के अवशोषण स्पेक्ट्रम विलुप्तिकरण गुणांक को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। समानांतर। प्रत्येक नमूने के लिए तीन बार माप लिया गया, और गणना के लिए BChl Qy अधिकतम के औसत अवशोषण का उपयोग किया गया। 878 एनएम पर मापा गया RC-LH114-W का विलुप्तिकरण गुणांक 3280±140 mM-1 cm-1 है, जबकि 880 एनएम पर मापा गया RC-LH116 का विलुप्तिकरण गुणांक 3800±30 mM-1 cm-1 है।
UQ10 का परिमाणीकरण (52) में वर्णित विधि के अनुसार किया गया। संक्षेप में, रिवर्स फेज HPLC (RP-HPLC) को Agilent 1200 HPLC सिस्टम का उपयोग करके निष्पादित किया गया। लगभग 0.02 nmol RC-LH116 या RC-LH114-W को 50 μl 50:50 मेथनॉल:क्लोरोफॉर्म में घोलें जिसमें 0.02% (w/v) फेरिक क्लोराइड हो, और पूर्व-संतुलित Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm कॉलम में इंजेक्ट करें। 40°C पर HPLC विलायक (80:20 मेथनॉल:2-प्रोपेनॉल) में 1 ml-1 min-1 की दर से ×25 cm कॉलम पर घोलें। 275 nm (UQ10), 450 nm (कैरोटीनॉयड) और 780 nm (BChl) पर अवशोषण की निगरानी के लिए 1 घंटे तक HPLC विलायक में आइसोग्रैफिक इल्यूशन करें। 275 एनएम क्रोमैटोग्राम में 25.5 मिनट पर प्राप्त शिखर को एकीकृत किया गया, जिसमें कोई अन्य पता लगाने योग्य यौगिक नहीं थे। एकीकृत क्षेत्र का उपयोग 0 से 5.8 एनएमओएल तक शुद्ध मानकों के इंजेक्शन से परिकलित अंशांकन वक्र के संदर्भ में निकाले गए यूक्यू10 की मोलर मात्रा की गणना करने के लिए किया जाता है (चित्र एस14)। प्रत्येक नमूने का तीन बार विश्लेषण किया गया, और रिपोर्ट की गई त्रुटि औसत के मानक विचलन (एसडी) के अनुरूप है।
0.1 के अधिकतम Qy अवशोषण वाले RC-LH1 कॉम्प्लेक्स युक्त एक विलयन को 30 μM रिड्यूस्ड हॉर्स हार्ट साइटोक्रोम c2 (मर्क, यूके) और 0 से 50 μM UQ2 (मर्क, यूके) के साथ तैयार किया गया। प्रत्येक UQ2 सांद्रता पर तीन 1-ml नमूने तैयार किए गए और माप से पहले अंधेरे में पूर्ण अनुकूलन सुनिश्चित करने के लिए उन्हें 4°C पर रात भर रखा गया। विलयन को 300 nm फ्लेम/500 लाइन ग्रेटिंग, 1.24 mm इनलेट, 0.12 mm मध्य और 0.6 mm आउटलेट स्लिट्स से सुसज्जित OLIS RSM1000 मॉड्यूलर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में लोड किया गया। उत्तेजना प्रकाश को रोकने के लिए नमूना फोटोट्यूब और संदर्भ फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब के प्रवेश द्वार पर 600 nm का लॉन्ग पास फिल्टर लगाया गया। अवशोषण को 0.15 s के एकीकरण समय के साथ 550 nm पर मॉनिटर किया गया। उत्तेजना प्रकाश 880 एनएम एम880एफ2 एलईडी (लाइट एमिटिंग डायोड) (थोरलैब्स लिमिटेड, यूके) से एक फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम से 90% तीव्रता पर डीसी2200 नियंत्रक (थोरलैब्स लिमिटेड, यूके) द्वारा उत्सर्जित होता है और प्रकाश स्रोत पर 90° के कोण पर पड़ता है। मापन किरण दर्पण के विपरीत दिशा में होती है ताकि नमूने द्वारा प्रारंभ में अवशोषित न किए गए किसी भी प्रकाश को वापस लौटाया जा सके। 50 सेकंड के प्रदीपन से 10 सेकंड पहले अवशोषण की निगरानी की जाती है। फिर क्विनोलॉल द्वारा साइटोक्रोम सी23+ को स्वतः अपचयित करने की सीमा का आकलन करने के लिए 60 सेकंड तक अंधेरे में अवशोषण की निगरानी की जाती है (कच्चे डेटा के लिए चित्र एस8 देखें)।
डेटा को 0.5 से 10 सेकंड (UQ2 सांद्रता के आधार पर) के भीतर एक रेखीय प्रारंभिक दर को फिट करके और प्रत्येक UQ2 सांद्रता पर तीनों नमूनों की दरों का औसत निकालकर संसाधित किया गया। संबंधित विलुप्तिकरण गुणांक द्वारा गणना की गई RC-LH1 सांद्रता का उपयोग दर को उत्प्रेरक दक्षता में परिवर्तित करने के लिए किया गया, जिसे Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) में प्लॉट किया गया और स्पष्ट Km और Kcat मानों को निर्धारित करने के लिए माइकलिस-मेंटेन मॉडल में फिट किया गया।
क्षणिक अवशोषण मापन के लिए, RC-LH1 नमूने को 50 mM सोडियम एस्कॉर्बेट (मर्क, यूएसए) और 0.4 mM टर्बुटिन (मर्क, यूएसए) युक्त IMAC बफर में लगभग 2μM तक तनु किया गया। एस्कॉर्बिक अम्ल का उपयोग बलिदानी इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में और टर्ट-ब्यूटाक्लोफेन का उपयोग QB अवरोधक के रूप में किया गया ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि मुख्य RC दाता मापन प्रक्रिया के दौरान अपचयित (अर्थात, प्रकाश-ऑक्सीकृत नहीं) रहे। लगभग 3 मिलीलीटर नमूना एक अनुकूलित घूर्णनशील सेल (लगभग 0.1 मीटर व्यास, 350 RPM) में डाला गया, जिसकी प्रकाशीय पथ लंबाई 2 मिमी थी, ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि लेजर पथ में नमूने को उत्तेजना स्पंदनों के बीच अंधेरे अनुकूलन के लिए पर्याप्त समय मिले। Ti: सैफायर लेजर सिस्टम (स्पेक्ट्रा फिजिक्स, यूएसए) को प्रवर्धित करने के लिए लगभग 100-fs लेजर पल्स का उपयोग करें ताकि नमूने को 880 nm पर 1 kHz की पुनरावृति दर (NIR के लिए 20 nJ या Vis के लिए 100 nJ) पर उत्तेजित किया जा सके। डेटा एकत्र करने से पहले, नमूने को लगभग 30 मिनट तक उत्तेजना प्रकाश के संपर्क में रखें। इस संपर्क से QA निष्क्रिय हो जाएगा (संभवतः QA एक या दो बार कम हो जाएगा)। लेकिन कृपया ध्यान दें कि यह प्रक्रिया प्रतिवर्ती है क्योंकि लंबे समय तक अंधेरे में अनुकूलन के बाद, RC धीरे-धीरे QA गतिविधि में वापस आ जाएगा। -10 से 7000 ps के विलंब समय के साथ क्षणिक स्पेक्ट्रा को मापने के लिए एक हेलिओस स्पेक्ट्रोमीटर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम्स, यूएसए) का उपयोग किया गया था। डेटा सेट को अनग्रुप करने के लिए सरफेस एक्सप्लोरर सॉफ़्टवेयर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम्स, यूएसए) का उपयोग करें, फिर उन्हें मर्ज और मानकीकृत करें। क्षय से संबंधित विभेदक स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए संयुक्त डेटा सेट का उपयोग करने हेतु कार्पेटव्यू सॉफ्टवेयर पैकेज (लाइट कन्वर्शन लिमिटेड, लिथुआनिया) का उपयोग करें, या ओरिजिन (ओरिजिनलैब, यूएसए) में एकल-तरंगदैर्ध्य स्पेक्ट्रल विकास को फिट करने के लिए उपकरण प्रतिक्रिया के साथ कई घातांकों को संयोजित करने वाले फ़ंक्शन का उपयोग करें।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है (53), आरसी और परिधीय एलएच2 एंटेना दोनों से रहित एलएच1 कॉम्प्लेक्स युक्त एक प्रकाश संश्लेषक फिल्म तैयार की गई थी। झिल्ली को 20 मिली ट्रिस (पीएच 8.0) में पतला किया गया और फिर 2 मिमी ऑप्टिकल पथ वाली क्वार्ट्ज क्यूवेट में लोड किया गया। 540 एनएम पर नमूने को -10 से 7000 पीएसएस के विलंब समय के साथ उत्तेजित करने के लिए 30 एनजे लेजर पल्स का उपयोग किया गया था। आरपीएस.पाल नमूने के लिए वर्णित अनुसार डेटा सेट को संसाधित करें।
झिल्ली को 4°C पर 2 घंटे के लिए 150,000 RCF पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा पेलेट किया गया, और फिर 880 nm पर इसके अवशोषण को 20 mM ट्रिस-HCl (pH 8.0) और 200 mM NaCl में पुनः निलंबित किया गया। झिल्ली को 4°C पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए 2% (w/v) β-DDM में धीरे-धीरे हिलाकर घोला गया। नमूने को 100 mM ट्राईएथिलअमोनियम कार्बोनेट (pH 8.0) (TEAB; मर्क, यूके) में 2.5 mg ml-1 की प्रोटीन सांद्रता तक पतला किया गया (बायो-रैड विश्लेषण)। आगे की प्रक्रिया पूर्व प्रकाशित विधि (54) के अनुसार की गई, जिसमें 50 μg प्रोटीन को 1% (w/v) सोडियम लॉरेट (मर्क, यूके) युक्त कुल 50 μl TEAB में पतला किया गया। 60 सेकंड तक सोनिकेशन के बाद, इसे 37°C पर 30 मिनट के लिए 5 mM ट्रिस(2-कार्बोक्सीएथिल)फॉस्फीन (मर्क, यूके) के साथ अपचयित किया गया। एस-एल्किलेशन के लिए, नमूने को 10 mM मिथाइल एस-मिथाइलथियोमेथेनसल्फोनेट (मर्क, यूके) के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और इसे 200 mM आइसोप्रोपेनॉल स्टॉक सॉल्यूशन से मिलाएं। प्रोटियोलिटिक पाचन 2 μg ट्रिप्सिन/एंडोप्रोटीनेज लाइस-सी मिश्रण (प्रोमेगा यूके) मिलाकर किया गया और इसे 37°C पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। लॉरेट सर्फेक्टेंट को 50 μl एथिल एसीटेट और 10 μl 10% (v/v) एलसी ग्रेड ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (TFA; थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) मिलाकर और 60 सेकंड के लिए वर्टेक्सिंग करके निकाला गया। 15,700 RCF पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा फेज पृथक्करण को बढ़ावा दिया गया। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, पेप्टाइड युक्त निचले फेज को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट और डीसॉल्ट करने के लिए C18 स्पिन कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) का उपयोग किया गया। वैक्यूम सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा सुखाने के बाद, नमूने को 0.5% TFA और 3% एसीटोनिट्राइल में घोला गया, और 500 ng का विश्लेषण नैनोफ्लो RP क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पूर्व में विस्तृत सिस्टम मापदंडों का उपयोग करके किया गया।
प्रोटीन की पहचान और मात्रा निर्धारण के लिए MaxQuant v.1.5.3.30 (56) का उपयोग करें और Rps. palustris प्रोटिओम डेटाबेस (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) में खोजें। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स डेटा को PRIDE पार्टनर रिपॉजिटरी (http://proteomecentral.proteomexchange.org) के माध्यम से ProteomeXchange Alliance में डेटासेट पहचानकर्ता PXD020402 के तहत जमा किया गया है।
इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ RPLC द्वारा विश्लेषण के लिए, RC-LH1 कॉम्प्लेक्स को वाइल्ड-टाइप Rps से तैयार किया गया था। पहले प्रकाशित विधि (16) का उपयोग करते हुए, पैलुस्ट्रिस कोशिकाओं में उत्पादित प्रोटीन की सांद्रता 20 mM हेपेस (pH 7.8), 100 mM NaCl और 0.03% (w/v) β- (बायो-रैड विश्लेषण) DDM में 2 mg ml-1 थी। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, अवक्षेपण विधि द्वारा 10 μg प्रोटीन निकालने के लिए 2D शुद्धिकरण किट (GE हेल्थकेयर, USA) का उपयोग किया गया, और अवक्षेप को 20 μl 60% (v/v) फॉर्मिक एसिड (FA), 20% (v/v) एसीटोनिट्राइल और 20% (v/v) पानी में घोला गया। पांच माइक्रोलीटर का विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मैक्सिस UHR-TOF, ब्रूकर) के साथ RPLC (डायोनेक्स RSLC) द्वारा किया गया। 60°C और 100μlmin -1 पर पृथक्करण के लिए MabPac 1.2×100 mm कॉलम (Thermo Fisher Scientific, UK) का उपयोग करें, जिसमें 85% (v/v) विलायक A [0.1% (v/v) FA और 0.02% (V/v) TFA जलीय विलयन] से 85% (v/v) विलायक B [0.1% (v/v) FA और 0.02% (v/v) 90% (v/v) एसीटोनिट्राइल TFA में] का ग्रेडिएंट हो। मानक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत और डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग करते हुए 60 मिनट से अधिक समय तक, मास स्पेक्ट्रोमीटर 100 से 2750 m/z (द्रव्यमान-से-आवेश अनुपात) प्राप्त करता है। ExPASy बायोइन्फॉर्मेटिक्स संसाधन पोर्टल के FindPept टूल (https://web.expasy.org/findpept/) की मदद से, मास स्पेक्ट्रम को कॉम्प्लेक्स की उप-इकाइयों से मैप करें।
कोशिकाओं को 100 मिलीलीटर एनएफ-कम (10μMm-2 s-1), मध्यम (30μMm-2 s-1) या उच्च (300μMm-2 s-1) प्रकाश में 72 घंटे तक उगाया गया। 100 मिलीलीटर स्क्रू-टॉप बोतल (23) में एम22 माध्यम (एम22 माध्यम जिसमें अमोनियम सल्फेट को हटा दिया गया है और सोडियम सक्सिनेट को सोडियम एसीटेट से बदल दिया गया है) का उपयोग किया गया। पांच 30-सेकंड के चक्रों में, 0.1 माइक्रोन कांच के मोतियों को 1:1 के आयतन अनुपात में कोशिकाओं को लाइस करने के लिए डाला गया और 5 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा किया गया। अघुलनशील पदार्थ, अविभाजित कोशिकाएं और कांच के मोतियों को बेंचटॉप माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूज में 16,000 आरसीएफ पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा हटा दिया गया। झिल्ली को 20 mM ट्रिस-एचसीएल (pH 8.0) में 100,000 RCF वाले Ti 70.1 रोटर में 40/15% (w/w) सुक्रोज ग्रेडिएंट के साथ 10 घंटे तक अलग किया गया।
जैसा कि हमारे पिछले कार्य में वर्णित है, PufW (16) पर His टैग का इम्यूनोडिटेक्शन किया गया। संक्षेप में, शुद्ध कोर कॉम्प्लेक्स (11.8 nM) या RC की समान सांद्रता वाली झिल्ली (ऑक्सीकरण द्वारा निर्धारित, कम किए गए अंतर स्पेक्ट्रम को घटाकर और रंगीन जेल पर लोड का मिलान करके) को 2x SDS लोडिंग बफर (मर्क, यूके) में दो बार पतला किया गया। प्रोटीन को एक प्रतिकृति 12% बिस्-ट्रिस नुपेज जेल (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) पर अलग किया गया। RC-L सबयूनिट को लोड करने और देखने के लिए जेल को कूमासी ब्रिलियंट ब्लू (बायो-रैड, यूके) से रंगा गया। दूसरे जेल पर प्रोटीन को इम्यूनोएसे के लिए मेथनॉल-सक्रिय पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) पर स्थानांतरित किया गया। पीवीडीएफ झिल्ली को 50 mM ट्रिस-एचसीएल (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) ट्विन-20 और 5% (w/v) स्किम्ड मिल्क पाउडर में अवरुद्ध किया गया, और फिर एंटी-हिज़ प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटीबॉडी बफर [50 mM ट्रिस-एचसीएल (pH 7.6), 150 mM NaCl और 0.05% (v/v) ट्विन-20] को 1:1000 A190-114A, बेथिल लेबोरेटरीज, यूएसए में पतला करें) के साथ 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। एंटीबॉडी बफर में 5 मिनट के लिए तीन बार धोने के बाद, झिल्ली को हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (सिग्मा-एल्ड्रिच, यूके) एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी (एंटीबॉडी बफर में 1:10,000 के अनुपात में पतला) के साथ मिलाया गया। वेस्टार ईटीए सी 2.0 केमिलुमिनेसेंस सबस्ट्रेट (सायनजेन, इटली) और एमर्शम इमेजर 600 (जीई हेल्थकेयर, यूके) का उपयोग करके पता लगाने के लिए (एंटीबॉडी बफर में तीन बार धोने के बाद 5 मिनट के लिए) इनक्यूबेट किया गया।
प्रत्येक स्टेन किए गए जेल या इम्यूनोएसे लेन के तीव्रता वितरण को चित्रित करके, शिखर के नीचे के क्षेत्र को एकीकृत करके और RC-L (स्टेन किए गए जेल) और प्रोटीन-W (इम्यूनोएसे) के तीव्रता अनुपात की गणना करके, ImageJ (57) में छवि को संसाधित करें। इन अनुपातों को मोलर अनुपातों में परिवर्तित किया गया, यह मानते हुए कि शुद्ध RC-LH114-W नमूने में RC-L और प्रोटीन-W का अनुपात 1:1 था और तदनुसार संपूर्ण डेटा सेट को सामान्यीकृत किया गया।
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